JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada kornea endotel hücrelerinin (MSK) neodimyum kullanarak Descemet zarından (DM) ayrılması için bir protokol sunuyoruz:YAG (Nd:YAG) lazer, büllöz keratopati (BK) için eksvivo hastalık modeli olarak.

Özet

Nd:YAG lazerler noninvaziv göz içi cerrahisi gerçekleştirmek için kullanılmaktadır, kapsulotomi gibi şimdi birkaç on yıldır. Kesi etkisi lazer odaklama optik arıza dayanır. Akustik şok dalgaları ve kavitasyon kabarcıkları üretilir, doku yırtılmasına neden olur. Kabarcık boyutları ve basınç genlikleri darbe enerjisi ve odak noktasının konumuna göre değişir. Bu çalışmada, enükleatlı domuz gözleri ticari olarak mevcut nd:YAG lazerin önüne yerleştirilmiştir. Değişken darbe enerjileri ve korneaya arka fokal noktaların farklı konumları test edildi. Ortaya çıkan lezyonlar iki foton mikroskobu ve histoloji ile değerlendirildi ve kornea endotel hücrelerinin (MSK) en az ikincil hasarla özel bir ayrılması için en iyi parametreler belirlendi. Bu yöntemin avantajları, CEC'nin kesin ablasyon, azaltılmış ikincil hasar ve hepsinden önemlisi temassız tedavidir.

Giriş

Korneanın saydamlığı, ışığın retinaya ve fotoreseptörlerine iletilmesi için gereklidir1. Bu bağlamda, dehidratasyon göreceli bir devlet kornea stroma içinde kollajen lifleri doğru hizalanmış tutmak için önemlidir. Bu homeostaz Descemet membran (DM)2üzerinde bulunan kornea endotel hücreleri (MSK) tarafından korunur. Endotel en içteki kornea tabakasıdır. Bu kornea şeffaflık için çok önemli bir bariyer ve pompa fonksiyonu vardır3. Epitelaksine, endotel kendini yenilemek mümkün değildir4. Bu nedenle, hastalık veya travma nedeniyle herhangi bir hücre hasarı büyütmek ve göç, ortaya çıkan kusurları kapsayacak ve kornea işlevselliğini korumak için kalan endotel hücrelerini uyarır5. Ancak, CEC yoğunluğu kritik bir eşiğin altına düşerse, endotel dekompansasyonu bir ödem yol açar, bulanık görme ve rahatsızlık ve hatta şiddetli ağrı ile sonuçlanan4. Semptomları hafifletmek için ilaçların mevcudiyetine rağmen, şu anda bu durumlarda tek kesin tedavi kornea naklidir, tam kalınlıkta greft veya lamellar endotel transplantasyonu şeklinde yapılabilir. İkinci prosedür Descemet membran endotel keratoplasti olarak kullanılabilir (DMEK) yanı sıra Descemet's sıyırma otomatik endotel keratoplasti (DSAEK)6. Ancak, kalan MK'nin korunması ve hayatta kalmalarının artırılması alternatif bir hedef olabilir, potansiyel terapötik ilaçları test etmek için yeterli bir hastalık modeline ihtiyaç vardır.

Mevcut CEC kaybı hastalığı modelleri toksik ajanların enjeksiyonu yoluyla endotel imha odaklanmak (örneğin, benzalkonyum klorür) ön hazneiçine veya bir invaziv descemetorheks tekniği kullanarak hücrelerin mekanik aşınma ile7,8. Bu modeller iyi kurulmuş olmakla birlikte, genel inflamatuar yanıt ve kesin olmayan ikincil hasar gibi dezavantajları var. Bu nedenle, bu modeller daha fazla hastalığın son aşamalarında temsil etmek olasıdır, yukarıda belirtilen cerrahi seçenekler kaçınılmaz olduğunda.

Kök hücre ve gen tedavisi gibi hücresel tedavi stratejilerindeki gelişmelerle, bu hücresel tedavilerin uygulanması MK kaybının erken evrelerinde yararlı olabilir9. Daha sonra, hastalığın bu erken evrelerini daha yeterli bir şekilde temsil eden bir modele ihtiyacımız vardır. Bu bağlamda, hücre kültürü modelleri son on yılda geliştirilmiş ama yine de geçerliliği sınırlıdır, in vitro hücreleri kornea içinde farklı hücre türleri arasında meydana gelen karmaşık etkileşimleri çoğaltma yakın gelemez gibi10. Bu nedenle, ex vivo ve in vivo hastalık modelleri hala yüksek talep ve mevcut olanları iyileştirilmesi son derece ilgi çekicidir.

Noninvaziv, göz içi cerrahisi bir neodimyum kullanarak fotoaksilik:YAG (Nd:YAG) lazer geç 1970'lerin sonlarında piyasaya sunulmasından bu yana dünya çapında göz doktorları için rutin bir prosedür haline gelmiştir11. Photodisruption plazma oluşumuna yol açan doğrusal olmayan ışık emilimi dayanır, akustik şok dalgaları üretimi, ve kavitasyon kabarcıkları oluşturulması, uygulama sitesi sıvı bir ortamda bulunduğunda12. Genel olarak, bu süreçler hassas doku kesme amaçlanan etkiye katkıda bulunur. Ancak, onlar da lazer cerrahisi13yerel hapsi sınırlayan gereksiz teminat hasar kaynağı olabilir.

Ortaya çıkan mekanik etkilerin tahmini, şok dalgası yayılımı ve kavitasyon rotasının karakterizasyonu ile önemli ölçüde iyileşmiştir. Amacımız MSK kaybının erken evreleri için noninvaziv, lazer destekli deneysel bir hastalık modeli sağlamak için çevre dokulara mümkün olduğunca az hasar ile MSK hedef. Bu amaçla lazerin odak noktalarının optimum darbe enerjilerini ve konumlarını belirlemek gerekir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Hayvan dokusu ile ilgili tüm prosedürler yerel Hayvan Bakım ve Etik Komitesi yönergelerine uyar.

1. Organ kültürünün hazırlanması ve lazer tedavisi

  1. Yerel mezbaha dan taze enükleated domuz gözleri elde edin. Onları serin tutun (4 °C) Dulbecco modifiye Eagle orta (DMEM) yüksek glikoz ile, L-glutamin ile takviye, sodyum pirüuvat, penisilin / streptomisin (%1), ve domuz serumu (%10), bundan böyle tam orta olarak bu makalede belirtilen.
  2. Makas ile ekstrasellüler dokuları çıkarın ve kullanıma kadar sterilfosfat tamponlu salin (PBS) yerleştirmeden önce 5 dakika boyunca% 5 povione-iyot oftalmik çözelti gözleri ıslatın.
  3. Spektral etki alanı optik koherens tomografi cihazı(Tablo Of Materials)ile kornea skar, ödem ve diğer opakentler gibi ana anterior segment patolojileri için ekran gözleri.
  4. Gözleri, dalga boyu 1.064 nm ve havada 10 μm odak noktası çapına sahip Nd:YAG lazeri(Malzeme Tablosu)ile donatılmış bir lamba ünitesinin önüne yerleştirin.
    NOT: En iyi konumlandırma için 3D baskılı bir tutma aparatı kullanılır, bu da göz firmasını tutmak için tasarlanmıştır, üzerinde çok fazla baskı olmadan(Şekil 1).
  5. 12x büyütme kullanın ve tek tek kornea katmanları görselleştirmek için aydınlatma saptırmak.
  6. Endotel hücrelerinin seçici ablasyonunu ayarlamak için darbe enerjisini (örn. 1,6 mJ) ve odak noktasını (örn. 0,16 mm) ayarlayın.
  7. Limbus yakın net bir kornea paracentesis yerleştirin ve ön oda stabilize etmek için viskoelastik enjekte(Malzeme Tablosu).
  8. Lazerle tedavi edilen merkezi korneayı 8 mm trephine kullanarak çıkar.
  9. Eksintise korneayı 12 kuyulu bir tablaya yerleştirin ve endotel bölgesi yukarı bakacak şekilde 3 mL'lik tam orta 3 mL'lik bir alanda 3 7 °C'ye kadar 3 gün kuluçkaya yatırın.
    NOT: Bu adımda ortama potansiyel sitoprotektif maddeler eklenebilir.

2. Histolojiye hazırlık

  1. 133 mM KH2PO4 19,6 mL içeren 7,4 pH ile Sorensen tampon hazırlayın ve 133 mM Na2HPO480,4 mL .
  2. Metanoliçermeyen paraformaldehit (%4) kullanarak kornea içeren kuyudan ortayı çıkarın ve 20 dakika oda sıcaklığında (RT) dokuyu sabitle Sorensen'in tamponunda.
  3. Doku battı kadar PBS% 20 sakaroz yerleştirin (1 saat) ve daha sonra% 30 sakaroz PBS bir gecede RT. Kabarcıklar ve hava yüzeyi arayüzü ile temas önlemek için dikkat edin. Dokuyu optimum kesme sıcaklığına (OCT) yerleştirin ve -80 °C'de saklayın.
  4. -27 °C'de bir kriyostat kullanarak 10 μm kalınlığında kesin.
    NOT: Bir deve saç fırçası bıçak bıçak üzerinde ortaya çıkan bölüm rehberlik yardımcı olmak için yararlıdır.
  5. Dokuyu dondurup kurutmaktan kaçınmak için kesişten 1 dakika sonra kaydırağa dokunarak bölümü mikroskop slaytına aktarın. Slaytları -80 °C'de saklayın.

3. Hematoksilin ve eozin (H&E) boyama

  1. Hava kuru bölümleri birkaç dakika nem kaldırmak için.
  2. 50 mL tüpte 10 dk boyunca %0.1 Mayers hematoksinilin ile leke.
  3. Bir Coplin kavanozda, 5 dakika boyunca serin çalışan ddH2O durulayın ve % 0.5 eozin 10x daldırma.
  4. DDH2O'ya din eozin çizgileri durdurana kadar daldırın ve %50 (10x) ve %70 (10x) EtOH'a daldırın.
  5. Ksilene birkaç kez daldırma önce% 95 EtOH (30 s) ve% 100 EtOH (60 s) dengeleyin.
  6. Son olarak, hafif bir mikroskop kullanarak görüntü almadan önce numuneyi monte edin ve kapağını kapatın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Burada sunulan prosedürü kullanarak, uygun parametreleri bulmak için farklı darbe enerjilerini (1.0−4.6 mJ) ve odak noktalarının (korneanın arka yüzeyinden uzaklık: 0.0−0.2 mm) konumlarını değerlendirerek gözleri Nd:YAG lazerile tedavi ettik. Lazer parametrelerinin her takımyıldızı için birden fazla çoğaltma (n = 3) değerlendirildi (12 x 21).

Yukarıda belirtilen protokole ek olarak, numune fiksasyon ve H&E boyamadan önce iki foton mikroskop la analiz edildi. İki fot...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu pilot çalışmanın sonuçları, enerji dozu ve odak noktası pozisyonu için uygun parametreler seçildiğinde kornea endotel hücrelerini seçici olarak ablate etmek için nd:YAG lazerin kullanılabileceğini göstermektedir.

Endotel fonksiyonu kornea şeffaflığı ve korneanın stromal ödemden korunması açısından önemli olduğundan, endotel disfonksiyonu modelleri ödem önleyici ilaçların veya cerrahi işlemlerin geliştirilmesinde önemli rol oynamaktadır. In vivo durum takl...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Christine Örün ve Jan A. M. Sochurek'e deneysel yöntemlerdeki yardımları için teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
BARRON VACUUM TREPHINEKatenaK20-2058
CryostatLeicaCM 3050S
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucosePAAE-15009
Eye holderSelfN/A
Inverted MicroscopeLeicaDMI 6000 B
KH2PO4Merck529568
Na2HPO4Merck1065860500
Nd:YAG laserZeiss MeditecvisuLAS YAG II plus
OCT Tissue TekSakura Finetechnical4583
Penicillin-StreptomycinSigma-AldrichP4333
Phosphate Buffered Saline (PBS)Gibco10010056
Porcine serumSigma-Aldrich12736C
Spectral-domain optical coherence tomographHeidelberg EngineeringSpectralis
Tissue culture plate 12-wellSarstedt833921
Two-Photon MicroscopeJenLabDermaInspect
ViscoelasticOmniVisionMethocel

Referanslar

  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  2. Edelhauser, H. F. The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (5), 1754-1767 (2006).
  3. Tuft, S. J., Coster, D. J. The corneal endothelium. Eye. 4, London, England. Pt 3 389-424 (1990).
  4. Bourne, W. M. Biology of the corneal endothelium in health and disease. Eye. 17, 912-918 (2003).
  5. He, Z., et al. 3D map of the human corneal endothelial cell. Scientific Reports. 6, 29047(2016).
  6. Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
  7. Schwartzkopff, J., Bredow, L., Mahlenbrey, S., Boehringer, D., Reinhard, T. Regeneration of corneal endothelium following complete endothelial cell loss in rat keratoplasty. Molecular Vision. 16, 2368-2375 (2010).
  8. Bredow, L., Schwartzkopff, J., Reinhard, T. Regeneration of corneal endothelial cells following keratoplasty in rats with bullous keratopathy. Molecular Vision. 20, 683-690 (2014).
  9. Bartakova, A., Kunzevitzky, N. J., Goldberg, J. L. Regenerative Cell Therapy for Corneal Endothelium. Current Ophthalmology Reports. 2 (3), 81-90 (2014).
  10. Zhao, B., et al. Development of a three-dimensional organ culture model for corneal wound healing and corneal transplantation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2840-2846 (2006).
  11. Aron-Rosa, D., Aron, J. J., Griesemann, M., Thyzel, R. Use of the neodymium-YAG laser to open the posterior capsule after lens implant surgery: a preliminary report. Journal - American Intra-Ocular Implant Society. 6 (4), 352-354 (1980).
  12. Vogel, A., Hentschel, W., Holzfuss, J., Lauterborn, W. Cavitation bubble dynamics and acoustic transient generation in ocular surgery with pulsed neodymium: YAG lasers. Ophthalmology. 93 (10), 1259-1269 (1986).
  13. Vogel, A., Schweiger, P., Frieser, A., Asiyo, M. N., Birngruber, R. Intraocular Nd:YAG laser surgery: laser-tissue interaction, damage range, and reduction of collateral effects. IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2240-2260 (1990).
  14. Zhu, Q., Zhu, Y., Tighe, S., Liu, Y., Hu, M. Engineering of Human Corneal Endothelial Cells In Vitro. International Journal of Medical Sciences. 16 (4), 507-512 (2019).
  15. Li, Z., et al. Nicotinamide inhibits corneal endothelial mesenchymal transition and accelerates wound healing. Experimental Eye Research. 184, 227-233 (2019).
  16. Pescina, S., et al. Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: histological and permeability evaluation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 63-71 (2015).
  17. Smeringaiova, I., et al. Endothelial Wound Repair of the Organ-Cultured Porcine Corneas. Current Eye Research. 43 (7), 856-865 (2018).
  18. Yamashita, K., et al. A Rabbit Corneal Endothelial Dysfunction Model Using Endothelial-Mesenchymal Transformed Cells. Scientific Reports. 8 (1), 16868(2018).
  19. Schubert, H. D., Trokel, S. Endothelial repair following Nd:YAG laser injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (8), 971-976 (1984).
  20. Zhang, W., et al. Rabbit Model of Corneal Endothelial Injury Established Using the Nd: YAG Laser. Cornea. 36 (10), 1274-1281 (2017).
  21. McCally, R. L., Bonney-Ray, J., de la Cruz, Z., Green, W. R. Corneal endothelial injury thresholds for exposures to 1.54 micro m radiation. Health Physics. 92 (3), 205-211 (2007).
  22. Nash, J. P., Wickham, M. G., Binder, P. S. Corneal damage following focal laser intervention. Experimental Eye Research. 26 (6), 641-650 (1978).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 158Nd YAG lazerkorneakornea endotel h crelerib ll z keratopatikavitasyon kabarchastal k modeli

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır