JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, sporozoitler veya ikinci nesil merozoitler nükleofekting tavuk Eimeria parazitlerin kararlı transfeksiyon elde etmek için bir yöntem sağladı. Heterolog antijenik genleri ifade eden genetiği değiştirilmiş eimerian parazitler aşı dağıtım aracı olarak kullanılabilir.

Özet

Transfeksiyon, DNA ve çift iplikli RNA gibi genetik materyalin ilgi genini değiştirmek için hücrelere teslim edildiği teknik bir süreçtir. Şu anda, transgenik teknoloji Eimeriaçalışma için vazgeçilmez bir araç haline geliyor , kümes hayvanları ve hayvancılık koksidoz nedensel ajanlar. Bu protokol eimerian parazitlerde kararlı transfeksiyonun ayrıntılı bir tanımını sağlar: sporozoitlerin veya ikinci nesil merozitlerin saflaştırılması ve nükleofeslenmesi ve transfected parazitlerin in vivo yayılımı. Bu protokolü kullanarak, Eimeriaçeşitli türlerde transfection elde etti. Birlikte ele alındığında, nükleofection eimerian parazitlerde genetik manipülasyon kolaylaştırmak için yararlı bir araçtır.

Giriş

Eimeria spp. koksidoza neden olur ve bu da hayvancılık ve kümes hayvanları endüstrisinde önemli ekonomik kayıplara yol açar. Antikokokidiyal ilaçlar, ve bir ölçüde, zayıflatılmış antikokokidiyal aşılar, coccidiosis kontrolü için yaygın olarak kullanılmaktadır rağmen, hala onların ilaç direnci ile ilgili eksiklikler vardır, ilaç artıkları, ve virülans yeniden aşı suşlarının potansiyel difüzyon1. Moleküler biyolojinin gelişmesiyle transfeksiyon, gen fonksiyonlarını incelemek, yeni aşılar geliştirmek ve Eimeriaiçin yeni ilaç hedeflerinitleme için hayati bir araç haline gelmiştir.

Son yıllarda, transfeksiyon plazmodium ve Toxoplasma gondii2,3,4,5,6gibi apicomplexan parazitler için başarıyla uygulanmıştır. E. tenella transfection için bir muhabir olarak β-gal kullanarak bir çalışma Eimeria7gibi çalışma pilot . E. tenella8transfeksiyon ,9, E. mitis10, ve E. acervulina (Zhang ve ark., yayınlanmamış veri) tavukbaşarılı oldu. Son zamanlarda, biz nükleofection11ile E. necatrix merozoitler kullanarak transfeksiyon elde etti.

Çalışmalar eimeria heterolog antijen ifade bir rekombinant aşı olarak geliştirilebilir potansiyeline sahip olduğunu gösterdi, bu campylobacter jejuni antijen A ifade gibi (CjaA) veya tavuk interlökin 2 (chIL-2)12,13. Bu nedenle, bu protokol tavuklarda Eimeria spp. bir nükleofection çalışma açıklar. Prosedür, sporozoitlerin veya merozoitlerin saflaştırılmasını, plazmid DNA ile nükleofeksiyonu, kloakal aşılama/intravenöz enjeksiyonu ve araştırmacıların transgenik Eimeria parazitleri üzerinde çalışmalara başlamalarına yardımcı olmak için in vivo yayılımı tanımlar.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri için Tavuklar ev sahipliği ve Çin Tarım Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi yönergelerine göre muhafaza edildi ve Biyomedikal Araştırma Hayvanlar içeren için Uluslararası Rehberlik İlkeleri izledi. Deneyler Pekin Laboratuvar Hayvanları Yönetim Komitesi tarafından onaylandı.

1. Eimeria spp. sporozoitlerinin çıkarılması ve arıtımı (örn. E. tenella)

  1. Sporokistlerin salınımı
    1. 5 dk. 2.300 x g.'da potasyum dikromat çözeltisi (%2.5, m/v) santrifüj 1 x 107sporlu ookistler üç kez PBS (fosfat tampon çözeltisi) ile yıkayın.
    2. Peletleri 1 mL PBS ile yeniden askıya alın ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Eşit hacimli cam boncuklar (1 mm x 1 mm çap aralığı) ekleyin ve sporokistleri serbest bırakmak için bir girdap mikseri kullanarak ookist süspansiyonuna salınım.
    3. Her dakika mikroskopi ile sporokistlerin salınımını izleyin. Ookistlerin %90'ından fazlası kırıldığında girdapyapmayı durdurun.
      NOT: Ookistlerin çoğu (E. tenella, E. necatrixve E. acervulinagibi) girdap mikseri kullanılarak 1 dk sonra kırıldı.
    4. Sporokist süspansiyonu yeni 1,5 mL tüplere ve santrifüje 1.600 x g 5 dk aktarın.
    5. Çökeltiyi 1 mL%50 yoğunluk gradyan çözeltisi ile yeniden askıya alın, 1,5 mL tüpte birleştirin ve 1 dk için 10.000 x g'de santrifüj edin.
      NOT: Yoğunluk gradyan kompozisyonu için Tablo 1'ebakın. Yoğunluk gradyanı, polivinilpyrrolidone (PVP) kullanılarak kaplanmış 15-30 nm çapındaki kolloidal silika parçacıklarından (%23 w/w) oluşan silika esaslı kolloidal bir ortamdır.
  2. Sporozoitlerin salınımı
    1. Ansifo tamponu(Tablo 1)ile çökelti yeniden askıya alın ve sporozoitleri serbest bırakmak için 42 °C'lik su banyosunda 40-60 dakika kuluçkaya yatırın. Sporozoitlerin %90'ından fazlası serbest bırakıldığında kuluçkayı durdurun. Sonra 10 dk için 600 x g santrifüj.
      NOT: Tüpleri her 5 dakikada bir salla.
    2. 1 mL%55 yoğunluk gradyan çözeltisi ve 1 dk için 10.000 x g santrifüj ile yağışı yeniden askıya alın.
    3. PBS 1 mL ile yağış resuspend ve bir hemositometre kullanarak sporozoitler saymak.

2. E. necatrix'in merozoitlerinin toplanması ve arıtımı

NOT: Deneyde 7-14 d yaş arası Arbor Acre (AA) broilers kullanın. Kokidia içermeyen tavuklar (n=3) 2 x 105 ookist E. necatrixile aşılandı. Saat 109'da, kuşlar servikal çıkış la kurban edildi. Bağırsak2 nesil merozoitlerin toplanması için çıkarıldı. Farklı Eimeria türleriiçin, 2 nesil merozoitlerin toplanması için farklı bir zaman vardı: 109 saat e. necatrix ve 112 saat post-inoulation de E. tenella. E. necatrixtransfection için, merozoites ikinci merozoitler arındırmak kolay olduğu gibi optimal seçimdir.

  1. E. necatrix ikinci nesil merozoitler koleksiyonu
    1. Tavuk bağırsağı uzunlamasına kesin, sarısı sapından (ince bağırsağın ortasından) ileosel orifise kadar, ve PBS veya HBSS (Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi) ile hafifçe üç kez petri kabında yıkayın.
    2. Bağırsağı 0,5 cm x 0,5 cm'lik parçalara kesin ve sindirim tamponu ile konik bir şişeye yerleştirin(Tablo 1). Marozoitleri serbest bırakmak için 30-60 dk karıştırma çubuğu ile 37 °C'de bir manyetik karıştırıcı üzerine şişe yerleştirin. Kuluçka 30 dakika sonra, mikroskobik inceleme ile her 5 dakika merozoitlerin salınımını izlemek.
  2. Filtrasyon ve santrifüj ile merozoitler arındırın.
    1. Filtre gazlı bez dört kat kullanarak sindirilmiş merozoitler içeren süspansiyon14, ve santrifüj 600 x g 10 dakika için.
    2. Santrifüjden sonra, bağırsak enkaz içeren supernatant atın. Saflaştırılmış merozoitlerle yağışı 1,5 mL tüpe aktarın.
    3. PBS 1 mL ile yağış resuspend ve bir hemositometre kullanarak merorositler saymak.

3. Merozoitlerin veya sporozoitlerin nükleofection'ı

  1. Parazitlerin nükleofeksiyonöncesi hazırlanması
    1. Bir tüp yaklaşık 107 merozoites veya sporozoitler hazırlayın. Merozoitler transfecting ise, 3-4 tüpler hazırlamak.
    2. 10 μg'den büyük veya eşit miktarda plazmid DNA veya saflaştırılmış PCR parçası hazırlayın.
      NOT: Bu çalışmada kullanılan plazmid 2 gen içerir: gelişmiş sarı floresan protein (EYFP) ve dihidrofolat redüktaz timizilaz timisilat sintalaz Toxoplasma gondii türetilmiştir (TgDHFR-TS)15.
    3. Restriksiyon enziminin 25 U'su hazırlayın. Plazmidler doğrusallaştırılmışsa, restriksiyon enzimi transfeksiyon verimliliğini artırabilir. Plazmidler daireselse, restriksiyon enzimini atla.
    4. 85 μL nükleofection tamponu hazırlayın: 20 μL nükleofection tamponU I ve 1 mL nükleofection tamponU II'yi karıştırın ve çözeltinin bir parçasını kullanın. Toplam arabelleğenin hacmi 100 μL'dir.
  2. Nükleofection
    1. 10 dakika boyunca 600 x g sporozoit veya merozoit süspansiyon santrifüj. Sonra supernatant atın.
    2. Aşağıdaki sırada, sporozoit veya merozoitiçeren 1,5 mL tüpe 85 μL nükleer transfeksiyon tamponu, 10 g plazmid (PCR parçası) ve 25 U restriksiyon enzimi (genellikle 5 μL) ekleyin.
    3. Süspansiyonu nükleer transfeksiyon kabına aktarın. Bardağı nükleer transfer oluğuna koy.
    4. Güç düğmesini kullanarak nükleofection cihazını açın ve U-033transfeksiyon prosedürünü seçin. Nucleofection cihazı Serbest Program Seçimi modunda başlarsa, X düğmesine basarak bu moddan çıkın.
    5. Program bittiğinde, nükleofection cihazının X düğmesine basın ve ekran Tamam'ıgörüntülemeli ve çekirdeklemenin başarılı olduğunu belirtmelidir.
    6. Reaksiyonu durdurmak ve hafifçe karıştırdıktan sonra süspansiyonu 1,5 mL tüpe aktarmak için çekirdeklik kabına 0,5-1 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortası (DMEM)8'i ekleyin.

4. Kloakal aşılama veya intravenöz enjeksiyon

  1. Çekirdekleri 7 günlük tavuklara dönüştürün. E. necatrix'in merozoitlerini veya E. tenella sporozoitlerini kloakal yol üzerinden aşıla, ancak intravenöz enjeksiyon yoluyla E. acervulina sporozoitleri aşıla. Her tavuk içine yaklaşık 2 x 107 milyon sporozoitler aşılamak ve her kuş için 107 meronitrat.

5. Yayılma ve FACS sıralama

  1. Transfected sporozoitler ile 5-9 gün post-inoulation dışkı ookistler toplamak. Transfected merozoitler ile aşılama sonra üçüncü gün oocysts toplamak.
  2. Transgenik popülasyon oranını art arda artırmak için floresan aktif hücre sıralama (FACS) ve 150 mg/kg pirimethamin8 kullanın.
    NOT: Doğrudan beslemeye ekleyerek pyrimethamine kullanın. Daha rahat kullanım için suda çözünen pirimethamin hazırlayın. 0,2 mL pf H2SO4 ve 9,8 mL N-metil pirolidon (NMP) içinde pirimethamin 1 g çözünür ve sonra kuşlar için içme suyu 1 L içine bu stok çözeltisi 1,5 mL ekleyin.

6. İsteğe bağlı kolon arınması

NOT: Daha saf sporozoitler veya merozoitler gerekiyorsa, bir diethylaminoethyl-52 selüloz (DE-52 selüloz) sütun yoluyla onları arındırır isteğe bağlı bir yöntem vardır.

  1. DE-52 selüloz sütununu en az bir gün önceden hazırlayın.
    1. Glisin elüent tamponu/ Glisin elüent tamponunun pH'ını 7,6'dan 8,0'a ayarlayın ve önceden ısıtılmış 41 °C'ye ayarlayın.
    2. Sütuna 2,5 g DE-52 selüloz ekleyin. Su ekleyin ve bir gecede ıslatın. Supernatant atın.
    3. Su ekleyin ve 1 saat bekletin.
    4. 0,1 M NaOH ekleyin ve en az 2 saat bekletin. Bu adımı tekrarlayın.
    5. Supernatant'ı suyla değiştirin. Selüloz tamamen dibe yerleştikten sonra (yaklaşık yarım saat), bu adımı tekrarlayın.
    6. Supernatant atın, 0.1 M HCl ekleyin ve en az 2 saat bekletin. Bu adımı tekrarlayın.
    7. Supernatant atın ve glisin elüent tampon ile iki kez selüloz ıslatın.
    8. 0,1 M HCl veya 0,1 M NaOH ekleyerek pH'ı 7,6'dan 8,0'a kadar ölçün ve ayarlayın.
      NOT: Bu bölümde sıvı, DE-52 selülozunkinden en az 5 kat daha fazla hacime sahiptir.
  2. Akış hızını 40-50 r/dk arasında ayarlayın.
  3. Selüloz sedimantasyonu tamamlandığında, kromatografik sütuna sporozoit veya merozoit süspansiyon ekleyin. Akış hızını 30-40 r/dk olarak ayarlayın.
    NOT: Kromatografik kolon eklemeden önce glisin elüent tampon ile sporozoit veya merozoit yağış resuspend.
  4. 50 mL tüpler içine glisin elüent tampon ile toplayın. Elüsasyon işlemi sırasında sporozoitlerin veya meroozitlerin mikroskobik incelemesi sonuçlarına göre koleksiyonu durdurun.
  5. 10 dk. Için 600 x g'de toplanan glisin elüent tamponunu santrifüj edin.
  6. Hemositometre kullanarak sporozoitleri veya merozitleri sayın.

Sonuçlar

Bu protokol eimerian parazitleri nakletmek için kullanılmıştır. Bu çalışmada Şekil 2A ve Şekil 2B'de E. necatrix'in 2. nesil meront ve merozoitleri gösterilmiştir, Şekil 2C ve Şekil 2D yoğunluk gradyan çözeltileri kullanılarak E. tenellasporocysts ve sporozo...

Tartışmalar

1990'larda apikompleks parazitler için bir transfeksiyon sistemi geliştirilmiş ve eimerian parazitler üzerinde çalışmalarda kullanılmıştır. Son zamanlarda, kararlı transfeksiyon E. tenella8yapıldı ,9 ve E. nieschulzi15. İkinci nesil merozoitler 11'i dönüştürerek E. necatrix'in kararlı transfeksiyonuna ulaştık. E. acervulina transfected sporozoitlerin kanat da...

Açıklamalar

Hiçbiri.

Teşekkürler

Bu çalışma Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2017YFD0501200) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31572507, 31772728 ve 31873007) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
ATP-disodiumSigmaA26209
Cellulose DE-52SolarbioC8350
Constant Flow PumpSHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD.HL-2B
DMEMMACGENECM15019
Glass beadsSigmaZ250473-1PAK
GlucoseSigmaNo. V900116
GlycineBiotoppedG6200
HBSSMACGENECC016
KH2PO4SigmaNo. V900041
Low Speed CentrifugeBEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD.DT5-2
Magnetic MixerSCILOGEXMS-H280-Pro
MgCl2Sigma449164
MoFlo cell sorterBeckMan Coulter, US201309995
NaHCO3Sigma144-55-8
Nucleofection deviceLONZA/amaxa90900012 (Nucleofector II)
PBSSolarbioP1010
Percoll (DG gradient stock solution)GE Healthcare17-0891-09
Sodium taurodeoxycholate hydrateSigmaT0875
Sorvall Legend Micro 17 MicrocentrifugeThermoFisher Scientific75002430
The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES.
TrypsinSolarbioT8150
Vortex MixerBeijing North TZ-Biotech Develop.co.HQ-60-II
Water Bath ThermostatGrant Instruments (Cambridge), Ltd.GD120,GM0815010

Referanslar

  1. Suo, X., et al. The efficacy and economic benefits of Supercox, a live anticoccidial vaccine in a commercial trial in broiler chickens in China. Veterinary Parasitology. 142 (1-2), 63-70 (2006).
  2. Kim, K., Soldati, D., Boothroyd, J. C. Gene replacement in Toxoplasma gondii with chloramphenicol acetyltransferase as selectable marker. Science. 262 (5135), 911-914 (1993).
  3. Sibley, L. D., Messina, M., Niesman, I. R. Stable DNA transformation in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii by complementation of tryptophan auxotrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5508-5512 (1994).
  4. Donald, R. G., Roos, D. S. Stable molecular transformation of Toxoplasma gondii: a selectable dihydrofolate reductase-thymidylate synthase marker based on drug-resistance mutations in malaria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (24), 11703-11707 (1993).
  5. Soldati, D., Boothroyd, J. C. Transient transfection and expression in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii. Science. 260 (5106), 349-352 (1993).
  6. Goonewardene, R., Daily, J., et al. Transfection of the malaria parasite and expression of firefly luciferase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5234-5236 (1993).
  7. Kelleher, M., Tomley, F. M. Transient expression of beta-galactosidase in differentiating sporozoites of Eimeria tenella. Molecular and Biochemical Parasitology. 97 (1-2), 21-31 (1998).
  8. Clark, J. D., et al. A toolbox facilitating stable transfection of Eimeria species. Molecular and Biochemical Parasitology. 162 (1), 77-86 (2008).
  9. Yan, W. C., et al. Stable transfection of Eimeria tenella: Constitutive expression of the YFP-YFP molecule throughout the life cycle. International Journal for Parasitology. 39 (1), 109-117 (2009).
  10. Qin, M., et al. Transfection of Eimeria mitis with Yellow Fluorescent Protein as Reporter and the Endogenous Development of the Transgenic Parasite. PloS One. 9 (12), e114188 (2014).
  11. Duan, C. H., et al. Stable transfection of Eimeria necatrix through nucleofection of second generation merozoites. Molecular and Biochemical Parasitology. , 1-5 (2019).
  12. Li, Z. R., et al. Transgenic Eimeria mitis expressing chicken interleukin 2 stimulated higher cellular immune response in chickens compared with the wild-type parasites. Frontiers in Microbiology. 6, 533 (2015).
  13. Clark, J. D., et al. Eimeria species parasites as novel vaccine delivery vectors: anti-Campylobacter jejuni protective immunity induced by Eimeria tenella-delivered CjaA. Vaccine. 30 (16), 2683-2688 (2012).
  14. Eckert, J., Braun, R., Shirley, M. W., Coudert, P. Eimeria species and strains of chickens. Biotechnology: Guidelines on techniques in coccidiosis research. Part. I: Eimeria and Isospora, 1-24 (1995).
  15. Kurth, M., Entzeroth, R. Reporter gene expression in cell culture stages and oocysts of Eimeria nieschulzi (Coccidia, Apicomplexa). Parasitology Research. 104 (2), 303-310 (2009).
  16. Tao, G. R., et al. Transgenic Eimeria magna Perard, 1925 Displays Similar Parasitological Properties to the Wild-type Strain and Induces an Exogenous Protein-Specific Immune Response in Rabbits (Oryctolagus cuniculus L.). Frontiers in Immunology. 8, 2 (2017).
  17. Shi, T. Y., et al. Stable Transfection of Eimeria intestinalis and Investigation of Its Life Cycle, Reproduction and Immunogenicity. Frontiers in Microbiology. 7, 807 (2016).
  18. Wang, P., et al. A novel telomerase-interacting OTU protein of Eimeria tenella and its telomerase-regulating activity. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (8), 744-745 (2017).
  19. Li, J. N., Zou, J., Yin, G. W., Liu, X. Y., Suo, X. Plasmid DNA could be delivered into Eimeria maxima unsporulated oocyst with gene gun system. Acta Polytechnica Hungarica. 60 (4), 431-440 (2012).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 156transfeksiyonmerozoitlersporozoitlerEimeriaaraa lama

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır