Yakın Kızılötesi Hassas, Çekirdek Kabuğu Aşı Dağıtım Platformu Üretimi

Özet

Bu makalede, gecikmiş seri sürüm sağlamak için yeni bir aşı dağıtım platformu olan "polybubbles"ı üretmek için kullanılan protokoller açıklanmaktadır. Polikonik (laktik-koglikolik asit) ve polikaprolakon gibi polikrolakon polikasını oluşturmak için polyesterler, küçük moleküller ve antijen ler kargo olarak kullanıldı.

Özet

Yeni salınım profilleri sağlarken kargonun organik çözücüye maruz kalmasını sınırlandırabilen aşı dağıtım stratejileri, dünya çapında bağışıklama kapsamının iyileştirilmesi için çok önemlidir. Burada, polibubbles adı verilen aşı dağıtım platformu sağlayan yeni bir enjekte edilebilir, ultraviyole- tedavi edilebilir ve gecikmiş patlama salınımı tanıtıldı. Kargo% 10 karboksimethycellulose tabanlı sulu çözelti oluşturulan polyester bazlı polibubbles içine enjekte edildi. Bu kağıt polikabarcıklar küresel şeklini korumak ve polikabarcıklar içinde kargo miktarını en üst düzeye çıkarmak için kargo yerleşimi ve tutma optimize etmek için protokoller içerir. Güvenliği sağlamak için polikasındaki klorlu çözücü içeriği nötron aktivasyon analizi kullanılarak analiz edildi. Serbest bırakma çalışmaları, gecikmiş patlama salınımını onaylamak için polikağın içinde kargo olarak küçük moleküllerle yapılmıştır. Kargonun isteğe bağlı teslimat potansiyelini daha fazla göstermek için, altın nanorodlar yakın kızılötesi lazer aktivasyonu sağlamak için polimer kabuk içinde karıştırıldı.

Giriş

Sınırlı bağışıklama kapsamı özellikle aşı yla önlenebilir hastalıklardan kaynaklanan 3 milyon kişinin ölümüyle sonuçlanır^1. Yetersiz depolama ve taşıma koşulları fonksiyonel aşıların israfına yol açar ve böylece küresel bağışıklamanın azalmasına katkıda bulunur. Buna ek olarak, gerekli aşı programlarına bağlı kalarak değil eksik aşılama da sınırlı aşı kapsama neden olur, özellikle gelişmekte olan ülkelerde². Tıbbi personele birden fazla ziyaret güçlendirici çekim almak için önerilen süre içinde gereklidir, böylece tam aşı ile nüfus yüzdesi sınırlayan. Bu nedenle, bu zorlukları aşmak için kontrollü aşı teslimatı için yeni stratejiler geliştirmek için bir ihtiyaç vardır.

Aşı dağıtım teknolojileri geliştirmeye yönelik mevcut çabalar emülsiyon tabanlı polimerik sistemleri içerir^3,4. Ancak, kargo genellikle potansiyel olarak toplama ve denatürasyona neden olabilir organik çözücü daha fazla miktarda maruz, özellikle protein bazlı kargo bağlamında^5,6. Biz yeni bir aşı dağıtım platformu geliştirdik, "polybubbles", potansiyel olarak solvent maruz kalan kargo hacmini en aza indirirken birden fazla kargo bölmeleri ev olabilir⁷. Örneğin, polikasını çekirdek kabuğu platformumuzda, çapı 0,38 mm (SEM) olan bir kargo cebi, 1 mm'lik polikasının ortasına enjekte edilir. Bu durumda organik çözücüye maruz kalan kargonun yüzey alanı yaklaşık 0,453 mm²olacaktır. Kürelerin (mikro partiküllerin) bir küre (kargo deposu) içindeki ambalaj yoğunluğu göz önüne alındığında, depoya sığabilecek mikro partiküllerin (10³μm çapında) gerçek hacmi 0,17 mm 3'tür. Bir mikropartikülün hacmi 5,24x10^-8 mm³ olup depoya sığabilecek partikül lerin sayısı ~3.2x10⁶ partikültür. Her mikropartikülün 0,25 μm çapında 20 kargo cebi (çift emülsiyon sonucu) varsa, organik çözücüye maruz²kalan kargonun yüzey alanı 1274 mm 2'dir. Böylece polikabaron içindeki kargo deposu, mikro partiküllerde organik çözücüye maruz kalan organik çözücüye göre ~2800 kat daha az yüzey alanına sahip olacaktır. Polyester bazlı platformumuz böylece organik çözücüye maruz kalan kargo miktarını potansiyel olarak azaltabilir ve bu da kargo toplama ve kararsızlığa neden olabilir.

Polikasında, organik fazdaki polyesterin küresel bir kabarcıkla sonuçlanan sulu bir çözeltiye enjekte edildiği faz ayırma prensibine göre oluşur. Sulu fazdaki kargo daha sonra polikanın ortasına enjekte edilebilir. Başka bir kargo bölmesi potansiyel polimer kabuk ile farklı bir kargo karıştırılarak polikasını içinde elde edilebilir. Bu aşamada polikabar dövülebilir olacak ve daha sonra ortasında kargo ile sağlam bir polikabarcık yapısı neden tedavi edilecektir. Küresel polikasını, polikağın genel boyutunu en aza indirirken polikağın içindeki kargo kapasitesini artırmak için diğer geometrik şekiller in üzerine seçilmiştir. Merkezinde kargo ile Polybubbles gecikmiş patlama serbest göstermek için seçildi. Polybubbles da yakın kızılötesi ile dahil edildi (NIR)- duyarlı (yani, theranostic-sağlayan) ajan, yani altın nanorods (AuNR), polikabarcıkların sıcaklık artışına neden. Bu etki potansiyel olarak daha hızlı bozulmayı kolaylaştırabilir ve gelecekteki uygulamalarda kinetik kontrolü için kullanılabilir. Bu yazıda, polikabarcıklar oluşturmak ve karakterize etmek, polibubbles gecikmiş patlama sürümü elde etmek ve NIR aktivasyonu neden polikabarcıklar içinde AuNR dahil etmek için yaklaşımımızı açıklar.

Protokol

1. Policaprolacyone triakrilat (PCLTA) sentezi

1. Kuru 3.2 mL 400 Da policaprolacyone (PCL) triol bir gecede 50 °C açık 200 mL yuvarlak alt şişe ve K₂CO₃ 90 °C'de bir cam şişe.
2. Trikoyu 6,4 mL diklorometan (DCM) ve 4,246 g potasyum karbonat (K₂CO₃₎ile argon altında karıştırın.
3. 27,2 mL DCM'de 2,72 mL akrilosil klorür karıştırın ve 5 dk'nın üzerindeki şişedeki reaksiyon karışımına damla yama ekleyin.
4. Reaksiyon karışımını alüminyum folyo ile kaplayın ve oda sıcaklığında 24 saat argon altında rahatsız edilmeden bekletin.
5. 24 saat sonra, fazla reaktifleri atmak için vakum altında bir Buchner hunisi üzerinde bir filtre kağıdı kullanarak reaksiyon karışımı filtre.
6. Diethyl eter kaldırmak için bir 1:3 (vol / vol) ve rotovape 30 °C'de diethyl eter içinde endcapped polimer içeren adım 1.5 filtrat çökeltmek.

2. Polikasının oluşumu

NOT: Deiyonize (DI) suya polimer enjekte etmek, polikabarcıkların şişenin dibine göç etmesini ve bunun sonucunda da düzleşmeye neden olur. Polikabarın düzlemesi önlemek için %10 (wt/vol) karboksimetil selüloz (CMC) yerine cam şişeyi doldurun.

1. DI suda %10 (wt/vol) CMC çözeltisi hazırlayın.
2. 0,92 mL'lik cam şişeyi 1 mL transfer pipet kullanarak %10 CMC'nin 0,8 mL'si ile doldurun.
3. 1000 mg/mL 14 kDa PCL'yi DCM'de karıştırın ve PCLTA'yı 200 μL'lik toplam hacim için 1:3 (vol/vol) sentezlayın veya kloroformda 5 kDa polisi (laktik-koglikolik asit) diyakrilat (PLGADA) 1000 mg/mL 200mg/mL hazırlayın.
4. Mix 2-hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-metilpropiophenone (fotoproinitiator) polimer ile (PLGADA veya PCL/PCLTA) karışımı 0.005:1 (vol/vol).
5. 0,016 inç iç çapı olan paslanmaz çelik bir boruya bağlı bir şırınga pompasıüzerine monte edilmiş 1 mL cam şırınga içine 200 μL polimer karışımı yükleyin.
6. Polimer tüpün ileri ve geri hareketini kontrol etmek için bir mikromotor kullanın ve polimeri cam şişedeki %10 CMC'ye enjekte edin ve polikabunu oluşturun.
7. 2 W/cm 2'de 60 s için 254 nm dalga boyunda²ultraviyole (UV) altında polibubbles Cure .
8. Flaş sıvı nitrojen polikabarcıklar dondurma ve 0.010 mBar vakum gecede ve -85 °C lyophilize.
9. Polybubbles'ı forseps kullanarak kurutulmuş CMC'den ayırın ve artık CMC'yi temizlemek için polikabarcıkları DI su ile yıkayın. Diğer polimerler serbest kinetiği değiştirmek için değişiklikler ile büyük olasılıkla kullanılabilir unutmayın.

3. Polikabarcık çapının modülasyonu

1. 0,92 mL'lik cam şişeyi 1 mL transfer pipet kullanarak %10 CMC ile doldurun.
2. 1000mg/mL 14kDa PCL ile 1:3 (vol/vol) ile PCL/PCLTA'yı karıştırın ve PCLTA sentezedin. 0.005:1 (vol/vol) ile fotoinitiator'u polimer karışımıile karıştırın.
3. Polimer karışımını, 0,016 inç iç çapı olan paslanmaz çelik bir boruya bağlı bir şırınga pompasına monte edilmiş 1 mL cam şırıngaya yükleyin.
4. Polimer tüpün ileri ve geri hareketini kontrol etmek için bir mikromotor kullanın ve polimeri cam şişedeki %10 CMC'ye enjekte edin ve polikabunu oluşturun.
5. Çeşitli çaplarda polikasını elde etmek için dağıtım oranını 0,0005'ten 1 μL/s'ye göre değiştirin.
6. Farklı çapta polikabarcıklar ile şişe görüntüleri alın.
7. Polybubbles çapını ölçmek ve ölçek olarak şişe boyutunu kullanmak için ImageJ kullanın.

4. Polybubble içinde kargo merkezleme

1. K₂CO₃kullanılarak PCL/PCLTA viskozitesinin modülasyonu :
   NOT: 1000 mg/mL'de 5 kDa PLAGDA'nın viskozitesi kargonun merkezalınması için yeterli olduğundan PLGADA'nın viskozitesi K₂CO₃ kullanılarak değiştirilmemektedir.
   1. 0 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL, 40 mg/mL ve 60 mg/mL dahil olmak üzere çeşitli konsantrasyonlarda PCLTA'ya K₂CO₃ (PCLTA reaksiyonundan sonra izole edildi) ekleyin.
   2. Reometri kullanarak kesme hızını 0'dan 1000'e 1/s'ye değiştirerek çözeltilerin dinamik viskozitelerini ölçün.
   3. Farklı K₂CO₃ (adım 4.1.1) konsantrasyonlarında PCL/PCLTA çözeltileri kullanılarak oluşturulan polikasınıların ortasına kargoyu el ile enjekte edin (kargo karışımını hazırlamak için adım 4.2'ye bakın). Adım 4.1.1'den hangi çözeltinin kargonun ortada tutulmasına neden olabileceğini gözlemleyerek K₂CO_3'ün optimum konsantrasyonunun belirlenmesi.
2. CMC ile kargonun (küçük moleküllerle zaten gösterilen fizibilite) merkeze
   1. Kargonun viskozitesini artırmak için kargoyu bir rotatorda bir gecede %5 (wt/vol) CMC ile karıştırın.
   2. Polybubble'a 2 μL kargo karışımını elle enjekte edin ve 2 W/cm^2'de60 s için 254 nm dalga boyunda UV kürleme ile devam edin.
   3. Flaş 30 s için sıvı nitrojen polikabarcıklar dondurma ve 0.010 mBar vakum gecede lyophilize ve -85 °C.
   4. Forseps kullanarak kurutulmuş CMC'den polikabarcıkları ayırın ve artık CMC'yi çıkarmak için DI suyuyla yıkayın.
   5. Polybubble'ı ikiye kesin ve kargonun ortalanması için konfokal mikroskopi kullanarak yarıları görüntüleyin (uyarma ve emisyon dalga boyları için 6. adıma bakın).

5. Kargo Formülasyonu

NOT: Polikabarcık formülasyonu küçük moleküller, proteinler ve nükleik asitler de dahil olmak üzere çeşitli kargo tipleri ev olabilir.

1. Önceki çalışmalara dayanarak, protein kargo durumunda, polietilen glikol dahil excipients kullanın (PEG)⁶, polivinilpyrrolidone (PVP), ve glikopolimerler⁶ polikabarcık formülasyonu sırasında protein istikrarını artırmak için.
2. 2. adımdaki protokole göre çok kabarcıklar oluştur.
3. 625 μL HIV gp120/41 antijenine 17,11 g trehalose ekleyerek antijen çözeltisini hazırlayın.
4. Polybubble ortasında 1 μL antijen çözeltisi elle enjekte edin.
5. 0, 7, 14 ve 21 gün açık polikabarcıklar ve uyarma ve emisyon dalga boyları ile antijen floresan kayıt 497 nm ve 520 nm, sırasıyla.
6. Enzime bağlı immünosorbent tsay (ELISA) kullanarak antijenin işlevselliğini belirleyin ve %5 yağsız sütü bloke edici tampon olarak kullanın.

6. Kargonun serbest bırakılması

NOT: Küçük molekül veya antijen kargo tipi olarak kullanılabilir

1. Küçük molekül
   1. 37 °C'de 400 μL fosfat tampon salini (PBS), PLGADA polikabarcıkları için 50 °C ve PCL/PCLTA polikasında 70 °C'de ortalanmış acriflavine ile inkübatör polikasını.
      NOT: Vücut ısılarının üzerinde test yapmanızı önermemizin nedeni, PCL ve PLGA içindeki altın nanorodları (AUNR) lazerle rken polikağın ulaştığı sıcaklığı (50 °C) simüle etmektir; ve b) PCL'nin (50 °C, 70 °C) bozulma sürecini hızlandırır.
   2. Her zaman noktasında, supernatants toplamak ve taze PBS 400 μL ile değiştirin.
   3. Toplanan süpernatantlarda floresan yoğunlukları ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın.
      NOT: Acriflavine için 416 nm/514 nm ex/em kullanın.
2. Antijen
   1. 37 °C'de 400 μL PBS'de ortalanmış büyükbaş albumin serumu (BSA)-488, PLGADA polikasında 50 °C ve PCL/PCLTA polikasında 50 °C'de kuluçka polikasında.
   2. Her zaman noktasında, supernatants toplamak ve 400 μL taze PBS ile değiştirin.
   3. Toplanan süpernatantlarda floresan yoğunlukları ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın. BSA-488 için 497 nm/520 nm ex/em kullanın.
      NOT: Antijenin aşırı sıcaklığa maruz kalmaması için PCL/PCLTA polikasını 70 °C'de serbest bırakma çalışması yapılmamalıdır.

7. Toksisite

1. Nötron aktivasyon analizi (NAA) kullanılarak polikabarcıklarda klor içeriğinin ölçülmesi
   1. Bu çalışma için 0,010 mBar vakum ve -85 °C'de 2, 4, 6, 20 ve 24 saat için lyophilized polibubbles kullanın.
   2. Ölçü 5-9 polikabarcıklar mg ve LDPE ışınlama şişeleri üzerine yerleştirin.
   3. Ulusal standartlar ve teknoloji enstitüsünden (NIST) izlenebilir kalibrasyon çözeltisinden 1000 g/mL klor kalibrasyon çözeltisi hazırlayın.
   4. 1- megawatt Triga reaktörünün her numuneüzerinde nötron ışınlamalarını 9,1 × 10^{12/cm 2}·s 600 s için nötron ışınlamaları gerçekleştirin.
   5. Polikasını ışınlanmamış şişelere aktarın.
   6. 360 s çürüme aralıklarından sonra 500 s için gama ışını spektrumları elde etmek için HPGe dedektörü kullanın.
   7. Verileri analiz etmek için canberra Industries'in NAA yazılımını kullanın.
2. NAA kullanarak polikabarcıklardan salınan klor içeriğinin ölçülmesi
   1. Bir gecede (0.010 mBar vakumve -85 °C'de) 37 °C'de 400 μL PBS'de liyofilize edilen polikasında inküpoliz polikasında.
   2. Kuluçkadan sonra 1, 2 ve 3.
   3. Adım 7.1'de açıklandığı gibi yukarıdaki yöntemi kullanarak NAA kullanarak klor içeriği için süpernatantları analiz edin.

8. Kittler, S., ve ark.⁸ tarafından AuNR Sentezi

1. AuNR tohumlama çözeltisini 250 μL 10 mM kloroaurik asit (HAuCl₄), 7,5 mL 100 mM setrimonyum bromür (CTAB) ve 600 μL 10 mM buz gibi sodyum borohidrit (NaBH₄₎karıştırarak hazırlayın.
2. 100 mM CTAB'ın 40 mL'si, 10 mM HAuCl_4,250 μL gümüş nitrat (AgNO₃₎ve 270 μL 17,6 mg/mL askorbik asidi bir tüpe karıştırarak Büyüme çözeltisini hazırlayın.
3. 1 dk için 1200 rpm'de 420 μL tohum çözeltisini büyüme çözeltisi ile şiddetle karıştırın. Daha sonra 16 saat tepki vermek için karışımı rahatsız edilmeden bırakın.
4. 10 dk için 8000 × g santrifüj tarafından karışımdan fazla reaktifler çıkarın ve supernatant atın.

9. AuNR'ların Soliman, M.G., ve diğerleri tarafından hidrofobikleştirilmesi⁹

1. 1 mM sodyum hidroksit (NaOH) kullanarak sentezlenmiş CTAB stabilize AUNR'ların 1,5 mL'lik pH'ını 10'a ayarlayın.
2. Çözeltiyi 0,1 mL 0,3 mM metillenmiş PEG (mPEG) tiol ile bir gecede 400 rpm'de karıştırın.
3. 4 gün boyunca 500 rpm kloroform 0.4 M dodecylamine (DDA) ile PEGYlated AuNRs karıştırın.
4. Hidrofobik AUNR içeren üst organik katmanı dışarı boru ve 4 ° C'de saklayın ileride kullanıma kadar.

10. Polikasıların NIR aktivasyonu

1. Polimer (PLGADA veya PCL/PCLTA) çözeltisini hidrofobik AUNR ile 1:9 (vol/vol) karıştırın.
2. 0.005:1 (vol/vol) ile polimer-AuNR karışımına fotoinitiator ekleyin.
3. Polimer-AuNR karışımını %10 CMC (wt/vol) ile 0,92 mL cam şişeye enjekte ederek polikabarcıklar oluşturur (adım 2'ye bakın).
4. 2^W/cm2'de 60 s için 254 nm dalga boyunda polikabarcıkları iyileştirin.
5. 30 s için sıvı nitrojen de flaş dondurma ve 0.010 mBar vakum gecede lyophilize ve -85 °C.
6. Forseps kullanarak kurutulmuş polikabarcıkları ayırın ve artık CMC'yi çıkarmak için DI suyuyla yıkayın.
7. Polikasını 37 °C'de 400 μL PBS'de kuluçkaya yatırın.
8. Her Pazartesi, Çarşamba ve Cuma 5 dakika boyunca 8A 801 nm NIR lazer kullanarak polibubbles etkinleştirin.
9. Sıcaklık değerlerini elde etmek için lazer aktivasyonundan önce ve sonra polikasının ileriye dönük kızılötesi (FLIR) görüntülerini alın.
10. FLIR görüntülerinden alınan sıcaklık değerlerini temel alan, lazer aktivasyonu öncesi ve sonrası arasındaki sıcaklık farklarını hesaplayın.

Sonuçlar

Polybubbles yaygın SEM ve NAA kullanılarak karakterize edildi. Kargo başarılı bir gecikme li serbest bırakılması ile sonuçlanması için ortalandı. Polikabarcıklar da başarılı bir şekilde lazer aktive polikabarcıklar içinde AuNR varlığı nedeniyle aktive edildi.

Polybubble karakterizasyonu
CMC olmadan sulu bir çözeltiye enjekte edilen polikalar, cam şişenin alt kısmıyla temasları ned...

Tartışmalar

Güncel teknolojiler ve zorluklar
Emülsiyon bazlı mikro ve nano tanecikleri yaygın olarak ilaç dağıtım taşıyıcıları olarak kullanılmaktadır. Bu cihazlardan kargo serbest kinetik kapsamlı olarak çalışılmıştır rağmen, patlama serbest kinetik kontrol büyük bir sorun olmuştur¹¹. Kargo çok yönlülüğü ve işlevselliği, aşırı sulu ve organik çözücülere maruz kalma nedeniyle emülsiyon tabanlı sistemlerde de sınırlıdır. Protein bazlı kargo g...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Step Ultra Tetramethylbezidine (TMB)-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Substrate Solution	Thermo scientific	34028
2-Hydroxy-2-methylpropiophenone	TCI AMERICA	H0991
450 nm Stop Solution for TMB Substrate	Abcam	ab17152
Acryloyl chloride	Sigma Aldrich	A24109-100G
Acriflavine	Chem-Impex International	22916
Anhydrous ethyl ether	Fisher Chemical	E138-500
Anti-HIV1 gp120 antibody conjugated to horseradish peroxidase (HRP)
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher BioReagents	BP9700100
BSA-CF488 dye conjugates	Invitrogen	A13100
Bromosalicylic acid	Acros Organics	AC162142500
Carboxymethylcellulose (CMC)	Millipore Sigma	80502-040
Centrimonium bromide (CTAB)	MP Biomedicals	ICN19400480
Chloroform	Fisher Chemical	C2984
Coating buffer	Abcam	ab210899
Dichloromethane (DCM)	Sigma Aldrich	270997-1L
Diethyl ether	Fisher Chemical	E1384
Dodeacyl Amine	Acros Organics	AC117665000
Doxorubicin hydrochloride	Fisher BioReagents	BP251610
L-ascorbic acid	Acros Organics	A61 100
Legato 100 Syringe Pump	KD Scientific	14 831 212
mPEG thiol	Laysan Bio	NC0702454
Nonfat dry milk	Andwin Scientific	NC9022655
Potassium carbonate	Acros Organics	AC424081000
Phosphate saline buffer	Fisher BioReagents	BP3991
(Poly(caprolactone)	Sigma Aldrich	440744-250G
(Poly(caprolactone) triol	Acros Organics	AC190730250
Poly (lactic-co-glycolic acid) diacrylate	CMTec	280050
Potassium carbonate	Acros Organics	AC424081000
Recombinant HIV1 gp120 + gp41 protein	Abcam	ab49054
Silver nitrate	Acros Organics	S181 25
Sodium borohydride	Fisher Chemical	S678 10
Tetrachloroauric acid	Fisher Chemical	G54 1
Trehalose	Acros Organics	NC9022655
Triethyl amine	Acros Organics	AC157910010