Stres Tedavileri Altında Bakteriyel Büyümenin Çok Ölçekli Analizi

Özet

Bu protokol, tek hücreli ve hücre popülasyon seviyelerinde stres koşulları altında bakteri üremesinin zaman içinde çözümlenmiş bir tanımını sağlar.

Özet

Stres koşullarında büyüme ve hayatta kalma yeteneğinin analizi çok çeşitli mikrobiyoloji çalışmaları için gereklidir. Bakteri hücrelerinin antibiyotiklere veya diğer antimikrobiyal bileşiklere, ışınlamalara, fizyolojik olmayan pH, sıcaklık veya tuz konsantrasyonuna maruz kalma gibi strese neden olan tedavilere verdiği yanıtı karakterize etmek le ilgilidir. Farklı stres tedavileri hücre bölünmesi, DNA replikasyonu, protein sentezi, membran bütünlüğü veya hücre döngüsü düzenlemesi gibi farklı hücresel süreçleri bozabilir. Bu etkiler genellikle hücresel ölçekte belirli fenotipler ile ilişkilidir. Bu nedenle, strese bağlı büyüme veya canlılık eksikliklerinin kapsamını ve nedenselliğini anlamak, hem tek hücrede hem de popülasyon düzeylerinde çeşitli parametrelerin dikkatli bir şekilde analizini gerektirir. Burada sunulan deneysel strateji, canlı hücrelerde akış sitometrisi ve gerçek zamanlı mikroskopi görüntüleme gibi tek hücreli analiz teknikleri ile geleneksel optik yoğunluk izleme ve kaplama tahlilleri birleştirir. Bu çok ölçekli çerçeve bir bakteri popülasyonunun kaderi üzerinde stres koşullarının etkisi nin zaman çözülmüş bir açıklama sağlar.

Giriş

Bu protokolün genel amacı, popülasyonda ve tek hücreli düzeyde stres tedavisine maruz kalan bakteri hücrelerinin davranışlarını analiz etmektir. Bakteri üremesi ve canlılığı geleneksel olarak, bakteri hücre kitle sentezinin bir vekili olan optik yoğunluk izleme (OD_600nm)veya kültürdeki canlı hücrelerin konsantrasyonunun (mililitre başına koloni oluşturan birim, CFU/mL) belirlenmesi için yapılan kaplama tahlilleri kullanılarak nüfus düzeyinde ele alınır. Normal (stressiz) büyüme koşullarında, OD_600nm ve CFU/mL ölçümleri kesinlikle ilişkilidir, çünkü bakteriyel katlama süresi doğrudan hücre kütlesi artışına bağlıdır^1,2. Ancak, bu korelasyon genellikle hücre kitle sentezini etkileyen koşullar altında bozulur³, hücre bölünmesi⁴, veya hücre lisis tetikleyen. Basit bir örnek, ipliksi bakteri hücrelerinin oluşumuna neden hücre bölünmesi inhibe stres tedavileri tarafından sağlanır^5,6. Filamentli hücreler, hücre kitle sentezinden etkilenmediği için normal olarak uzatırlar, ancak canlı hücrelere bölünemezler. Kültür optik yoğunluğu sonuç olarak normal bir oranda zaman içinde artacak, ancak kaplama tahlilleri (CFU/ mL) tarafından belirlenen canlı hücrelerin konsantrasyonu değil. Bu durumda, diğerleri gibi, optik yoğunluk ve kaplama ölçümleri bilgilendirici ama gözlenen stres kaynaklı etkisi kapsamlı bir anlayış sağlamak için başarısız. Bu topluluk tahlilleri strese bağlı büyüme eksiklikleri derinlemesine karakterizasyonu sağlamak için tek hücreli analiz teknikleri ile kombine edilmesi gerekir.

Burada, dört tamamlayıcı deneysel yaklaşımı birleştiren bir prosedür tanımlanmıştır: (1) hücre canlılığını ve hücre kitle sentezini izlemek için sırasıyla geleneksel kaplama tahlilleri ve temel optik yoğunluk izleme; (2) hücre büyüklüğü ve DNA içerik parametrelerini çok sayıda hücre üzerinde değerlendirmek için akış sitometri; Hücre morfolojisini analiz etmek için mikroskop anlık görüntüleme; ve (4) hücre kaderinin zamansal dinamiklerinin incelenmesi için mikroakışkan odalarda zaman atlamalı tek hücreli görüntüleme. Bu çok ölçekli çerçeve, tek tek hücrelerin davranışları ışığında hücre büyümesi ve canlılığı üzerindeki küresel etkilerin yorumlanmasına olanak sağlar. Bu prosedür, belirli koşullar altında büyüme (örneğin, büyüme ortamı, pH, sıcaklık, tuz konsantrasyonu) veya antibiyotiklere veya diğer maruz kalma da dahil olmak üzere, ilgi hemen hemen her stres, çeşitli bakteri türlerinin tepkisini deşifre etmek için uygulanabilir antimikrobiyal bileşikler.

Protokol

1. Hücre kültürü, stres indüksiyonu ve örnekleme prosedürü

NOT: Arka plan parçacıklarından kaçınmak için steril kültür cam takımları, pipet uçları ve 0,22 m'de filtrelenmiş büyüme ortamı kullanın. Burada, hücre kültürleri düşük otofloresan zengin tanımlanmış ortamda yetiştirilir (Malzeme Tablosubakınız )^7,8.

1. Bir Luria-Broth (LB) agarose plaka (gerekirse seçici antibiyotik ile) ve 37 ° C gecede (17 saat) inkübat üzerinde dondurulmuş gliserol stok ilgi bakteriyel zorlanma çizgi.
   NOT: Burada sunulan örnek deneyde Escherichia coli MG1655 hupA-mCherry kullanabilirsiniz. Bu tür, HU nükleoid ilişkili proteinin floresan etiketli α alt birimini üreterek canlı hücrelerdeki kromozomun ışık mikroskobu görselleştirilmesine olanak sağlar^9.
2. Tek bir koloni ile orta 5 mL aşılamak ve 37 °C dakikada 140 dönüş (rpm) gecede (17 saat) sallayarak büyümek. Çalkalanan kültürün tatmin edici bir şekilde aeretilmesini sağlamak için şişeler (≥50 mL) veya büyük çaplı (≥2 cm) test tüpleri kullanılmalıdır.
3. Ertesi sabah 600 nm (OD_600nm)optik yoğunluğu ölçmek ve 0,01 bir OD_600nm taze orta içeren bir test tüpü içine kültürü seyreltmek. Kültürün toplam hacmi, deney sırasında analiz edilecek zaman noktalarının sayısına bağlı olarak ayarlanmalıdır.
4. Kültürün 200 μL'lik bir örneğini bir mikro plakaya (şeffaf bir alt kısımla çalışma hacminin kuyusu başına 0,2 mL) yükleyin ve 37 °C'de kuluçka sırasında OD_600nm izleme için otomatik bir plaka okuyucusuna (Bkz. Malzeme Tablosunabakın).
5. Aşılanmış test tüpünü 37 °C'de sallayarak (140 rpm) OD_600nm = 0.2'ye inkütün, zengin ortamda tam üstel faza karşılık gelen.
   NOT: Uygun üstel büyüme elde etmeden önce en az 4−5 nesil boyunca hücreleri büyütmek çok önemlidir. Adım 1.3'te kullanılan ilk inokül (OD_600nm = 0,01) daha yoksul ortamda büyüme durumunda (örneğin, üstel fazın OD 0.2'nin altına ulaştığı durumlarda) veya daha fazla nesil isteniyorsa (örn. belirli fizyolojik çalışmalar veya genişletilmiş stres tedavileri için) uyarlanmalıdır.
6. OD_600nm = 0.2'de, t₀ zaman noktasına karşılık gelen aşağıdaki kültür örneklerini alın (stres indüksiyonundan önce katlanarak büyüyen hücreler): (1) Zaman atlamalı mikroskopi görüntüleme için mikroakışkan cihaza hemen yüklenmek üzere 150 μL'lik bir numune (bkz. bölüm 2); (2) Seyreltme ve kaplama taslısı için 200 μL'lik bir numune (bkz. bölüm 3); (3) Akış sitometrisi analizi için buza konulacak 250 μL numune (bölüm 4); (4) Mikroskop anlık görüntüleme için agarose monte edilmiş bir slayta hemen 10 μL'lik bir numune yatırılmalıdır (bkz. bölüm 5).
7. Test tüpünde kalan hücre kültürünü, 37 °C'de titreyerek (140 rpm) araştırmak ve kuluçkaya yatırmak istediğiniz özel stres tedavisine maruz bırakın.
   NOT: OD_600nm izleme için otomatik plaka okuyucuda büyüyen kültür de stres tedavisine tabi tutulmalıdır.
8. Stres tedavisinden sonra ilgili zaman noktalarında (t₁, t₂, t₃, vb.), stresli kültürden aşağıdaki hücre örneklerini alın: (1) Seyreltme ve kaplama tsay için 200 μL numune (bkz. bölüm 2); (2) Akış sitometri analizi için buza konulması gereken 250 μL'lik bir numune (bölüm 3); (4) Mikroskopi enstantane görüntülemesi için agarose monte edilmiş bir slayta hemen 10 μL'lik bir numune yatırılmalıdır (bkz. bölüm 4).
   NOT: Her stresin neden olduğu tedavidoz ve zamana bağlı bir verime sahiptir. Bu nedenle, optimal sonuçlar için kullanılacak tedavinin dozu ve süresini belirlemek için ön testler inyapılması gerekebilir. Bu dozlar ve maruz kalma süreleri bir dizi ile tedavi bir hücre kültürünün otomatik bir plaka okuyucu (potansiyel kaplama tahlilleri ile ilişkili) kullanarak OD izleme gerçekleştirerek yapılabilir. Burada sunulan deneyde hücre kültürü hücre bölünmesi inhibe edici antibiyotik sefalikin (Ceph.) ile 5 μg/mL son konsantrasyonda 60 dk ile tedavi edildi. Cephalexin daha sonra santrifüj (475 g, 5 dk) kullanarak 15 mL'lik bir tüpteki hücreleri peletleyerek, süpernatantı çıkararak, hücre peletini nazik pipetleme ile eşit hacimde taze ortamda yeniden sulandırarak ve temiz bir tüpe aktararak yıkandı. Yıkanan hücreler 37 °C'de, iyileşmek için sallayarak (140 rpm) kuluçkaya yatırıldı. Örnek t₆₀ (60 dk sonra sefaleksin ilavesi 'sefaleksin-60min tedavi' örneğine karşılık gelen, t₁₂₀ (60 dk yıkadıktan sonra) ve t₁₈₀ (yıkamadan sonra 120 dk) olarak alınmıştır.

2. Kaplama tsay

NOT: Kaplama tonu, kültür örneklerinde CFU üretebilen hücrelerin konsantrasyonunu ölçmeye olanak sağlar. Bu işlem, bir hücrenin iki canlı hücreye bölünme hızını ortaya çıkarır ve hücre bölünmesi tutuklamalarını (örn. hücre lizisinin bakteri üretim süresinin artması) saptamaya olanak tanır.

1. 200 μL'lik kültür numunesinin 10^-7'sine kadar 10 kat seri seyreltmeleri taze ortamda hazırlayın. 37 °C'de gece kuluçkadan sonra 3−300 koloni arasında elde etmek için seçici olmayan LB agarose plakaları üzerinde uygun seyreltme plakası 100 μL.
   NOT: Bakteri bölünmelerini sınırlamak için taze ortamda seri seyreltme hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Alternatif olarak, araştırmacılar seyreltme işlemi sırasında hücre bölünmelerini önlemek için bir karbon kaynağı olmadan tuzlu bir çözüm kullanarak düşünebilirsiniz.
2. Ertesi gün, her kültür örneğinde canlı hücrelerin (CFU/mL) konsantrasyonunu belirlemek için kolonilerin sayısını sayın. Tedavi edilmemiş ve tedavi edilen hücre kültürleri için zamanın bir fonksiyonu olarak CFU/mL'yi çizin.

3. Akış sitometrisi

NOT: Aşağıdaki bölümde akış sitometri sitometrisi analizi için hücre örneklerinin hazırlanması açıklanmaktadır. Bu analiz tekniği çok sayıda hücre için hücre büyüklüğü ve DNA içeriğinin dağılımını ortaya koymaktadır. Mümkün olduğunda, akış sitometri örneklerinin hemen işlenmesi tavsiye edilir. Alternatif olarak, numuneler buzüzerinde tutulabilir (6 saate kadar) ve gün sonunda aynı anda analiz edilebilir, kaplama ve mikroskopi görüntüleme yapıldıktan sonra.

1. 250 μL kültür örneğini seyreltin ve 4 °C'de taze ortamda ~15.000 hücre/μL konsantrasyonda (OD_600nm ~0.06'ya karşılık gelen) 250 μL elde edin.
   NOT: Buz üzerinde kuluçka hücrelerin büyüme ve morfolojik modifikasyon usınırlar. Alternatif olarak, kullanıcı genellikle akış sitometri¹⁰için tavsiye edilir, % 75 etanol hücrelerin fiksasyon gerçekleştirmeyi düşünebilirsiniz.
2. DNA boyama için, bakteri örneğini DNA floresan boyanın 10 μg/mL çözeltisi (oran 1:1) ile karıştırın ve numuneyi analiz etmeden önce karanlıkta 15 dakika kuluçkaya yatırın.
3. ~ 120.000 hücre / dk akış hızı ile akış sitometre içine örnek geçirin. Uygun ayarlarla ileriye dağılmış (FSC) ve yan lara dağılmış (SSC) ışığın yanı sıra DNA floresan boya floresan floresan sinyali (FL-1) edinin.
4. FSC ve FL-1 hücre yoğunluğu histogramlarını, hücre popülasyonundaki hücre büyüklüğü ve DNA içeriğinin dağılımını temsil edecek şekilde çizin.

4. Enstantane mikroskopi görüntüleme

NOT: Aşağıdaki bölümde nüfus anlık analizi için mikroskopi slaytlarının hazırlanması ve görüntü edinimi açıklanmaktadır. Bu prosedür, hücrelerin morfolojisi (hücre uzunluğu, genişliği, şekli) ve nükleoid DNA'nın hücre içi organizasyonu ile ilgili bilgi sağlayacaktır.

1. Gözlemlere başlamadan önce sıcaklığı dengelemek için termosesmikroskop haznesini 37 °C'de önceden ısıtın. Bu oda, zaman atlamalı deneyler sırasında mikroskop optiklerinin ve numune aşamasının sıcaklık modülasyonuna izin verir.
2. Lesterlin ve Dubarry^7'deaçıklandığı gibi agarose monte edilmiş slaytları hazırlayın.
   1. Plastik filmi mavi çerçevenin altından çıkarın (Bkz. Malzemeler Tablosu),diğer tarafta içi boş plastik film bırakarak. Mavi çerçeveyi mikroskop cam slaytına yapıştırın.
   2. Pipet ~150 μL eritilmiş % 1 agarose orta çözelti ve mavi çerçeve bölmesi içinde dökün. Hızla aşırı sıvı kaldırmak için temiz bir coverslip ile kapak ve oda sıcaklığında katılaşmak için agarose ped için birkaç dakika bekleyin.
   3. Hücre örneği hazır olduğunda, kapak kayslipini ve plastik filmi mavi çerçeveden çıkarın. Agarose pedüzerine 10 μL'lik hücre örneğini dökün ve damlacığı yaymak için cam kaydırağı hafifçe yatırın. Tüm sıvı adsorbe edildiğinde, numuneyi mühürlemek için mavi çerçeveye temiz bir kapak kaydırın. Mikroskopi slaytı artık mikroskopi için hazır.
3. Slaytı mikroskop aşamasına yerleştirin ve iletilen ışığı kullanarak (faz kontrastı hedefiyle) ve ışık kaynağı uyarma ile uygun dalga boylarında (mCherry için 560 nm) görüntü edinimi gerçekleştirin.
4. Görüntü analizi sırasında otomatik hücre algılamasını kolaylaştırmak için yalıtılmış hücreler içeren görünüm alanlarını seçin. Hücre popülasyonunun sağlam istatistiksel analizine olanak sağlamak için en az 300 hücrenin görüntülendirilediğinden emin olun.

5. Mikroakışkanlar zaman atlamalı mikroskopi görüntüleme

NOT: Aşağıdaki bölümde mikroakışkan plakaların hazırlanması (Bkz. Malzeme Tablosu),hücre yüklemesi, mikroakışkanprogramı ve zaman atlamalı görüntü edinimi açıklanmaktadır. Bu görüntüleme prosedürü gerçek zamanlı olarak tek tek hücrelerin davranışını ortaya koymaktadır.

1. Koruma çözeltisini mikroakışkan plakadan çıkarın ve mikroakışkan yazılım kullanım kılavuzunda açıklandığı gibi önceden ısıtılmış 37 °C'ye kadar taze orta ile değiştirin.
2. Mikroakışkan plakayı manifold sistemine kapatın ve Priming düğmesine tıklayın.
3. Mikroakışkan plakayı manifold sistemi yle mikroskop aşamasına yerleştirin ve mikroskobu edinmeye başlamadan önce 37 °C'de ~2 saat önceden ısıtın.
   NOT: Bu ön ısıtma adımı mikroakışkan haznenin genişlemesini önlemek için önemlidir, bu da zaman atlamalı deney sırasında mikroskobun odaklaşmasını ve görüntü ediniminin tehlikeye atılmasını değiştirir.
4. Mikroakışkan plakayı kapatın. Ortayı kuyu 8'den 150 μL kültür örneği ile değiştirin ve ortayı 1'den 5'e kadar istediğiniz ortamla veya strese neden edici reaktifolmadan değiştirin.
5. Mikroakışkan plakayı kapatın ve mikroskop aşamasına yerleştirin.
6. Mikroakışkan yazılımda (bkz. Malzemeler Tablosu)hücre yükleme işlemini çalıştırın. Aktarılan ışıkta mikroskop altına bakarak hücrelerin yüklenmesinin tatmin edici olup olmadığını kontrol edin. Bölmedeki hücre yoğunluğu yetersizse hücre yükleme işlemini ikinci kez çalıştırın.
7. İletilen ışık modunda dikkatlice odaklanın ve izole edilmiş bakterileri gösteren çeşitli görüş alanlarını seçin. Zaman içinde yalıtılmış hücrelerin büyümesini izleyebilmek için aşırı kalabalık olmayan alanları seçmek önemlidir (~100 μm^2'de ~10−20 hücre önerilir). Bu da görüntü analizi sırasında hücre algılama kolaylaştıracaktır.
8. Mikroakışkan yazılımda Protokol Oluştur düğmesine tıklayın. Hücrelerin uyum sağlaması için 1−2 nesil zaman eşdeğerleri için büyüme ortamının enjeksiyonu program (isteğe bağlı). Daha sonra 2 psi 10 dakika boyunca stres indükleyen orta enjeksiyon programı, stres tedavisi nin istenen süre için 1 psi enjeksiyon ardından. Eğer stres ten sonra hücrelerin iyileşme analiz etmek niyetinde, program taze büyüme orta istenen süre için enjeksiyon.
   NOT: Burada sunulan deneyde sefaleksin 2 psi'de 10 dakika, ardından 1 psi'de 50 dk enjekte edildi. Daha sonra, taze büyüme ortamı 10 dakika için 2 psi enjekte edildi, 1 psi 3 saat izledi.
9. İletilen ışıkta faz kontrastı ve gerekirse mCherry sinyali için 560 nm uyarma ışık kaynağı kullanarak her 10 dakikada bir 1 kare ile hızlandırılmış modda mikroskopi görüntüleme yapın.
   NOT: Mikroskobik enjeksiyon protokolünün başlamasıyla aynı anda mikroskobik görüntü edinimi nin başlatılması önemlidir.

6. Görüntü analizi

NOT: Bu bölümde, anlık görüntü ve hızlandırılmış mikroskopi görüntülerinin işlenmesi ve analiz edilmesinin temel adımları kısaca açıklanmaktadır. Mikroskopi görüntülerinin açılması ve görüntülenmesi açık kaynak ImageJ/Fiji (https://fiji.sc/)¹¹ile yapılır. Kantitatif görüntü analizi ücretsiz MicrobeJ eklentisi¹² (https://microbej.com) ile birlikte açık kaynak ImageJ / Fiji yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir. Bu protokol MicrobeJ 5.13I sürümünü kullanır.

1. Fiji yazılımını ve MicrobeJ eklentisini açın.
2. Anlık görüntü analizi için, görüntüleri bir araya getirmek ve elde edilen görüntü yığınları dosyasını kaydetmek için bir mikroskop slaytına (bir örnek) karşılık gelen tüm görüntüleri MicrobeJ yükleme çubuğuna bırakın. Hızlandırılmış veriler için görüntü yığınını MicrobeJ yükleme çubuğuna bırakmanın.
3. Hücre anahatlarının faz kontrast ı görüntüsünün ve ilgiliyse nükleoidlerin lekeli DNA floresan sinyalinin segmentasyonuna dayalı olarak otomatik olarak algılanmasını çalıştırın. Hücre algılamanın doğruluğunu görsel olarak kontrol edin ve gerekirse düzeltme için MicrobeJ düzenleme aracını kullanın. Elde edilen sonuç dosyasını kaydedin.
   NOT: E. coli hücrelerinin tespiti için kullanılan ayarlar Malzeme Tablosu'nda belirtilmiştir (bkz. MicrobeJ'in Yorumlar/Açıklama sütunu). Diğer bakteri türleri için (özellikle çubuk şeklinde olmayan bakteriler için), kullanıcı algılamadan önce ayarları hassaslaştırmalıdır (Bkz. MicrobeJ öğretici). Hızlandırılmış görüntüler için, microbeJ düzenleme aracını kullanarak hücrelerin yarı otomatik olarak algılanması, tek tek hücrelerin kaderine odaklanılmasıiçin tercih edilebilir (bkz.
4. Analizi tamamlamak ve ResultJ penceresini elde etmek için ResultJ simgesine tıklayın. Bu noktadan birçok farklı türde çıktı grafiği oluşturulabilir. Hücre şekli/uzunluğu ve hücre başına ortalama nükleoid sayısının normalleştirilmiş histogramlarını çizin.

Sonuçlar

Açıklanan prosedür sefaleksin geçici maruzkalma sırasında Escherichia coli K12 hücrelerinin davranışını analiz etmek için kullanılmıştır, özellikle hücre bölünmesi inhibe bir antibiyotik (Şekil 1A)¹³. Kromozom DNA'sı ile ilişkili floresan etiketli HU proteini üreten hupA-mCherry E. coli suşu bu tedavi boyunca kromozomun dinamiklerini araştırmak için kullanılmıştır^8,9. Üssel olarak büyüyen hupA-mCherry E. coli hücreleri önce analiz edildi (t₀) ve 60 dk sonra sefaleksin ile kuluçka (t_60). Daha sonra antibiyotik yıkandı ve hücre popülasyonunun 1 saat (t₁₂₀₎ve 2 saat (t₁₈₀₎sonrası iyileşmesi analiz edildi (Şekil 1B).

Şekil 1: Stres tedavilerine bakteriyel yanıtAnalizi için prosedür. (A) Yöntemin şeması. (B) Zengin ortamda normal büyüme sırasında hücre morfolojisini gösteren karikatür ve sefaleksine geçici maruz kalma sırasında (Ceph.), ek (t₀) ve sefaleksin yıkandıktan sonra (t₆₀) den (t_180). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

OD ve CFU/mL'nin paralel evrimi, stres tedavilerinin etkisini anlamaya yardımcı olan ilk göstergedir. Bu iki parametre kesinlikle tedirgin büyüme sırasında korelasyon ama genellikle uncoupled ve stres altında bağımsız olarak gelişmeye. Sefalosin varlığında büyüyen hücre kültürleri benzer OD_600nm gösterdi gibi stressiz kültürler (Şekil 2A), ilacın hücre kitle sentezini etkilemediğini gösteren. Ancak, sefaleksin hücre bölünmesinin sıkı inhibisyonu nedeniyle mevcut olduğunda canlı hücrelerin konsantrasyonu artmadı (Şekil 2B). Sefalosin çıkarıldığında hücreler tekrar bölünmeye başladı ve sonunda stresli olmayan kültüre eşdeğer bir konsantrasyona ulaştı (t_180). Bu sonuçlar sefaleksin bakteriyostatik etkisini yansıtır, hangi hücre bölünmesi tamamen geri dönüşümlü inhibisyonu neden olur. Farklı gerilmeler, indüklenen etkiye bağlı olarak OD ve CFU/mL eğrilerinin farklı bir şekilde ayrılmasına neden olur (örneğin, filamentasyon veya şişkinlik gibi hücre morfolojisinin değiştirilmesi, hücre ölümü ile veya lysis olmadan). Farklı strese bağlı etkileri gösteren olası sonuç sonuçlarının kapsamlı olmayan bir listesi Şekil 2C'devermiştir.

Şekil 2: İşlenmemiş ve sefaleksin tedavi edilen hücrelerin popülasyon düzeyinde bakteri üremesi izlenmesi. (A) Optik yoğunluk izleme (OD_600nm/mL). (B) Tedavi edilmeyen ve sefaleksin-60dk tedavi edilen kültürlerde canlı hücre konsantrasyonu (CFU/mL). Hata çubukları, deneysel bir üçleme için standart sapmayı gösterir. (C) Olası sonuçların şemaları ve ilişkili stres etkileri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Nüfus düzeyinde gözlenen stres yanıtını doğru bir şekilde yorumlamak için tek hücreli analiz gereklidir. Akış sitometrisi hücre büyüklüğü ve dna içeriğinin binlerce hücrenin incelenmesini sağlar^14,15 (Şekil 3). Sefaleksin maruz hücre büyüklüğü ve DNA içeriği (t₆₀₎paralel artış açıktı. Sefaleksin çıkarıldığında, popülasyon hücre büyüklüğü ve DNA içeriği yavaş yavaş azaldı ve t_180'dekistressiz popülasyona benzer hale geldi. Bu sonuçlar, sefateksin DNA replikasyonünü inhibe etmediğini ve çeşitli kromozom eşdeğerleri içeren ipliksi hücrelerin oluşumunu tetiklediğini göstermektedir. Bu iplikler ilaç yıkandığında normal hücre büyüklüğü ve DNA içeriği olan hücrelere ayrılmıştır. Akış sitometri sonuçları DNA sentezini inhibe eden stresler için çok farklı olacaktır, bu da sadece bir tane çoğalmayan kromozom içeren ipliksi hücrelerin oluşumuna yol açar. Bu durumda, hücre boyutu benzer şekilde artacak ama DNA içeriğinde artış ile ilişkili olmaz.

Şekil 3: Tedavi edilmeyen ve sefaleksin-60dk tedavi edilen hücrelerin temsili akış sitometri analizi. (A) Hücre büyüklüğü dağılımı histogramları (FSC-H). (B) DNA içeriği histogramları (FL1-SYTO9). n = 120.000 hücre analiz edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Kanaat mikroskobu görüntülemesi, HÜCRE MORfolojisi ve HU-mCherry lokalizasyonu ile gösterilen DNA'nın hücre içi organizasyonunu incelemek için kullanılmıştır(Şekil 4A). Sefaleksin normal hücre genişliği ve bölünme septa ile uzun hücrelerin oluşumunu kışkırttı. Bu pürüzsüz filamentler düzenli olarak çekirdekoid adı verilen aralıklı DNA yapıları içeriyordu, sefaleksin kromozom replikasyon ve segregasyon etkilemediğini doğrulayan. Kantitatif görüntü analizi büyük ölçüde hücre büyüklüğü ve DNA içeriği artış daha önce akış sitometrisi ile gözlenen doğruladı(Şekil 4B,C). DNA hasarına neden olan ve çoğalmanın devam ettiği ancak segregasyonun bozulduğu ipliksi hücrelerin oluşumuna yol açan stresler için sonuçlar çok farklı olacaktır. Bu durumda, hücre büyüklüğü ve DNA içeriği benzer şekilde artacaktır, ancak hücreler tek bir yapılandırılmamış DNA kütlesi barındırır. Anlık görüntüler de anormal hücre şekilleri veya mini, anükleat veya lysed hücrelerin (hayalet hücreleri) varlığını diğer tür ortaya çıkarabilir.

Şekil 4: Tedavi edilmeyen ve sefaleksin-60dk tedavi edilen hücrelerin mikroskopi enstantane analizi. (A) Faz kontrastı (gri) ve HU-mCherry sinyalini (kırmızı) gösteren temsili mikroskopi görüntüleri. (B) Hücre uzunluğu dağılımı histogramları. Ölçek Çubuğu = 5 μm. (C) Hücre başına nükleoid sayısının histogramları. Her örnek için 800 ila 2.000 hücre analiz edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Mikroakışkan cihaz¹⁶ ile ilişkili hızlandırılmış mikroskopi daha önce gözlenen fenotiplerin belirlenmesine yardımcı oldu ve büyüme eksikliğinin gelişimi ve nedenselliği ile ilgili ek bilgiler sağladı. Zaman atlamalı görüntüler(Şekil 5A ve Film 1)hücre uzaması (hücre kitle sentezi) ve kromozom replikasyonu ve segregasyonusefaleksine maruz kalarak inhibe olmadığını doğruladı. Buna ek olarak, sefaleksin çıkarıldığında iyileşme sürecini ortaya koymuştur. Filamentli hücre soyundan gelen analizler, hücre bölünmesinin ilacı yıkadıktan sonra ~20 dk yeniden başladığını göstermiştir(Şekil 5B). Ortaya çıkan bölünmüş hücreler, onlar sırayla bölünmüş, sonunda normal boyut ve DNA içeriği sergileyen 33 hücre oluşumuna yol açan, çünkü canlı idi. Bu, CFU/mL ölçümlerinden (~33 dk) elde edilen stressiz popülasyon için hesaplanan üretim süresine benzer olan 180 dakika boyunca toplam 31 dk'lık bir üretim süresinin hesaplanmasına olanak sağladı.

Şekil 5: Sefaleksin-60min-tedavi edilen hücrelerin mikroskopi zaman atlamalı analizi. (A) Faz kontrastı (gri) ve HU-mCherry sinyalini (kırmızı) gösteren temsili mikroskopi görüntüleri. İzlenen ipliksi hücre beyaz anahat ile gösterilir ve farklı renklere göre hücreleri bölünür. Ölçek Çubuğu = 5 μm. (B) Panele (A)ve Film 1'ekarşılık gelen ipliksi hücre soyundan gelen şematik gösterimi . Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Film 1: E. coli HU-mCherry ve sefaleksin ile tedavi Mikroakışkan film. Sefaleksin 60 dakika sonra enjekte edildi, taze RDM orta enjeksiyonu takip 3 saat. Zaman sarı (1 kare her 10 dakika) gösterilir. Ölçek Çubuğu = 5 μm. Bu videoyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).

Tartışmalar

Bu işlem sırasında hücrelerin büyüme durumuna dikkat etmek esastır. Tam bir üstel aşamaya ulaşmadan önce birkaç nesil boyunca hücreleri büyütün. Bu yöntemin başarısı için, tüm hücre örneklerinin aynı anda toplanması önemlidir ve aynı anda sadece bir tedavi ve bir işlenmemiş kültürü analiz etmek en iyisidir. Mikroskopi görüntüleme için hücre örnekleri işlem boyunca deneysel sıcaklıkta muhafaza edilmelidir. Daha sonra deney başlamadan önce mikroskop odası ve mikroakışkan oda önceden ısıtmak için gereklidir. Akış sitometrisi için hücre örnekleri kolayca analiz edilemezse, 6 saate kadar buzda tutulabilir. Alternatif olarak, kullanıcı genellikle akış sitometri¹⁰için tavsiye edilir etanol% 75, hücrelerin fiksasyon kullanarak düşünebilirsiniz. Protokol, potansiyel anormal hücrelere zarar vermemek için stres indüktörünü orta, santrifüj ve pipet hücrelerinden çok dikkatli bir şekilde yıkamayı gerektiriyorsa.

Hem akış sitometrisi hem de anlık görüntü analizi hücre büyüklüğü ve DNA içerik parametrelerine erişim sağlar ve anlık görüntüler hücre morfolojisinin ek gözlemini sağlar. DAPI¹⁰ (4',6-diamidino-2-fenilindole) veya diğer stabil DNA boyaları ile DNA boyama ilgi organizmasındanü gözlemlemek için floresan füzyon mevcut değilse yapılabilir. Akış sitometrisi analizi yapılamıyorsa, çok sayıda hücrenin mikroskopi ile görüntülemesi ve analiz edilmesi önemlidir.

Mikroskopi görüntüleme, belirli ilgi yollarında yer alan proteinlere floresan füzyon taşıyan suşlar kullanılarak da yapılabilir. Bu çoğaltma, transkripsiyon, hücre duvarı sentezi veya hücre bölünmesi gibi hücresel süreçlerin çeşitli stresetkisini ortaya yardımcı olacaktır. Bu yöntem bir dizi bakteri türüne uygulanabilir, tek gereklilik mikroakışkan aygıtın hücrelerin morfolojisi ile uyumlu olmasıdır. Standart mikroakışkan plakalar, hücre genişliği 0,7 ila 4,5 m arasında olan çubuk şeklindeki bakteriler için uygundur. Ancak, kok, ovokok veya kendine özgü şekillere sahip diğer bakteri suşlarının test edilmesi gerekir. Alternatif olarak, ekipmanın yetersizliği veya uyumsuz bakteriyel suşlar nedeniyle mikroakışkan deneyler yapılamıyorsa, agarose monte edilmiş slaytlarda maksimum 2 saat süreyle hızlandırılmış görüntüleme yapılabilir.

Bu çok ölçekli analizin genel avantajı, stres indüksiyonunun bakteri üreme yeteneğinin çeşitli yönleri (yani, kitle sentezi, hücre canlılığı, hücre morfolojisi, membran bütünlüğü, DNA içeriği) üzerindeki etkisinin küresel bir vizyon sağlamasıdır. bu stres koşulları altında büyüyen bir bakteri popülasyonu zamanla gelişir. Aynı zamanda tek hücreli ve nüfus düzeyinde normal büyümenin restorasyon analiz sağlar. Bu yaklaşım, çok çeşitli bakteri türlerine ve antibiyotik veya diğer antimikrobiyal bileşiklere maruz kalma, diğer organizmalarla etkileşimin çok türdeki etkisinin analizi gibi hemen hemen her türlü stres tedavisi için geçerlidir. popülasyonları, ya da genetik mutasyonun etkisi.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	BioRad	1613100	Certified molecular biology agarose
Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer	ThermoFisher scientific	A24858	Cytometer
CellASIC ONIX Microfluidic System	Merck Millipore	CAX2-S0000	Microfluidic system
CellASIC ONIX2 FG	Merck Millipore	ONIX2 1.0.1	Microfluidic software
CellASIC ONIX2 Manifold Basic	Merck Millipore	CAX2-MBC20	Manifold system
CytoOne 96-well plate with lid	Starlab	CC7672-7596	Microplate with 0,2 mL well working volume and clear flat bottom, for automated plate reader
E. coli strain carrying a chromosomal insertion for a hupA-mCherry fusion			Created by P1 transduction of hupA-mCherry in E. coli MG1655
Fiji	ImageJ	https://fiji.sc/	Image software. Cite Schindelin et al. if used in publication
Gene Frame	Thermo Scientific	AB-0578	Blue frame (125 μL, 1,7 x 2,8 cm)
Luria-Broth agarose medium	MP Biomedicals	3002232	Growth medium for plating assay
MicrobeJ	Imagej/Fiji plugin	https://www.microbej.com/	Microscopy image analysis plugin. Cite Ducret et al. If used in publication; Detection settings: For bacteria : Area (μm2): 0,1-max; Length (μm): 0,5-max; Width (μm): 0,6-max; Range (μm): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters. For nucleoid: Tolerance: 500; Threshold: Local; 0-max for all other parameters
Microfluidic Plates CellASIC ONIX	Merck Millipore	B04A-03-5PK	Plate for Microfluidic system
Microscope Nikon eclipse Ti	Nikon		Fluorescence microscope
MOPS EZ Rich Defined Medium (RDM)	Teknova	M2105	Growth rich medium, 10x MOPS Mixture, 0,132 M K2HPO4, 10x AGCU, 5x Supplement EZ, 20% Glucose. Filtered at 0,22 μm
SYTO9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain	ThermoFisher scientific	S34854	DNA fluorescent dye
TECAN Infinite M1000	TECAN	30034301	Automated plate reader