Farelerin Hindlimb Sekonder Lenfödem Indükleme için Gözden Geçirilmiş Bir Yöntem

Özet

Bu hayvan modeli, araştırmacıların farelerin arka eklerinde en az 8 hafta süren istatistiksel olarak anlamlı sekonder lenfödemi indüklemelerini sağlar. Model lenfödem patofizyolojisi çalışma ve yeni tedavi seçenekleri araştırmak için kullanılabilir.

Özet

Hayvan modelleri hastalığın patofizyolojisini anlamak için lenfödem araştırmalarında ve aynı zamanda potansiyel tedavi seçeneklerini araştırmak için büyük önem taşımaktadır. Bu fare modeli araştırmacılar ın en az 8 hafta süren önemli lenfödem neden sağlar. Lenfödem fraksiyonlu radyoterapi ve lenfatiklerin cerrahi ablasyon kombinasyonu kullanılarak indüklenir. Bu model fareler ameliyat öncesi ve sonrası 10 Gri (Gy) radyasyon bir doz almak gerektirir. Modelin cerrahi kısmı üç lenf damarlarının ligasyonu ve fare arka limb iki lenf düğümleri çıkarma içerir. Farelerin küçük anatomik yapıları nedeniyle mikrocerrahi aletlere ve mikroskoba erişim esastır. Bu modelin avantajı istatistiksel olarak anlamlı lenfödem sonuçları, hangi farklı tedavi seçenekleri değerlendirmek için iyi bir temel sağlar. Aynı zamanda mikrocerrahi eğitim için büyük ve kolay kullanılabilir bir seçenektir. Bu modelin sınırlaması, yordamın özellikle önceden uygulanmadıysa zaman alıcı olabileceğidir. Model farelerde objektif olarak ölçülebilir lenfödem ile sonuçlanır, ciddi morbidite neden olmadan ve üç ayrı projede test edilmiştir.

Giriş

Lenfödem lokalize doku şişmesine yol açan lenf sıvısı birikimi ile karakterizedir, esas olarak lenf damarlarında lenf sıvısının bozulmuş veya bozulmuş akışı nedeniyle oluşur¹. Lenf akışı, lenf atik sisteminde enfeksiyon, obstrüksiyon, yaralanma veya konjenital defektler nedeniyle bozulabilir veya bozulabilir². Bu etyolojiler lenfatik sıvı birikimi ile sonuçlanır, hangi inflamasyon kronik bir devlet yol açar, sonraki fibrozis ile sonuçlanan, yanı sıra yağ dokusu birikimi³. Lenfödem primer veya sekonder lenfödem olarak kategorize edilebilir. Primer lenfödem gelişimsel anormallikler veya genetik mutasyon neden olur^2,4. Sekonder lenfödem altta yatan sistemik hastalık, cerrahi veya travma^2,4nedeniyle oluşur. Sekonder lenfödem dünyada lenfödemin en sık görülen şeklidir². Gelişmiş ülkelerde sekonder lenfödemin en sık nedeni adjuvan radyoterapi ve lenf nodülüdiseksiyonu 5 gibi onkolojik tedavidir. Lenfödem meme kanseri hastaları arasında en sık, ama aynı zamanda jinekolojik hastalarda gelişebilir, melanom, genitoüriner veya boyun kanseri⁶. Meme kanseri tanısı konan tüm kadınların %21'inde lenfödem^7.

Lenfödem hasta için hem fiziksel hem de psikolojik olarak stresli olabilir. Lenfödem olan hastalar enfeksiyon riski var^5,8,9, yaşam kalitesi düşük ve sosyal anksiyete ve depresyon belirtileri gelişebilir¹⁰. Kronik lenfödem komplikasyonları bakım yüksek maliyet ve artan bir hastalık yükü yol^9,11. Bulgular da lenfödem meme kanseri tedavisi sonrası ölüm riski ile ilişkili olabileceğini ileri sürmüşlerdir¹². Etkilenen bölgenin sıkıştırığı, manuel lenf drenajı ve genel cilt bakımı gibi konservatif yönetim ilk basamak yaklaşımı olmaya devam etmektedir. Şu anda hiçbir iyileştirici tedavi⁶. Cerrahi ve medikal tedavi alanında ilerleme kaydedilmiş olsa da, hala gelişme için yer vardır. Daha fazla araştırma, patofizyoloji ve hastalığın ilerlemesi içgörü sağlayan, klinisyenler hastalar için daha iyi tedavi seçenekleri sağlamak için gereklidir⁵.

Hastalıkların patofizyolojisini anlamak ve potansiyel tedavi seçeneklerini geliştirmek için klinik öncesi araştırmalarda hayvan modelleri kullanılmaktadır. Birkaç farklı lenfödem hayvan modelleri köpekleri^13,14, tavşan 15 , koyun¹⁶, domuz^17,18 ve kemirgenler^{19,20, 21,22,23,24}. Kemirgen modeli en uygun maliyetli model gibi görünüyor, lenfatik fonksiyonun rekonstrüksiyonu araştırırken, kemirgenler nedeniyle kolayca erişilebilir ve nispeten düşük fiyatlı²⁵. Fare modellerinin çoğunluğu farelerin kuyruğunda lenfödem indükleyen odaklanmıştır^21,22,23. Kuyruk modeli çok güvenilirdir ancak lenfödemi indükleyen tam cerrahi teknik önceki yayınlanmış materyalde önemli ölçüde farklılık gösterir. Bu durum, bilinen litterature^25'tesunulan gelişmiş lenfödemin süresi ve sağlamlığında dalgalanmalara neden olabilir. Farklı teknikler de hindlimb modelinde lenfödem indüklemek için kullanılmaktadır ve onlar da değişen sonuçlar verim, ancak hindlimb modeli çevirisel bir perspektiften anlamak daha kolay olabilir. Önceki lenfödem modelleri spontan lenfödem çözünürlüğü ile engellenmiş ve bu nedenle tekrarlanabilir ve kalıcı lenfödem modeline ihtiyaç duyulmaktadır²⁵. Araştırmacılar daha önce radyasyon dozu artırmak için çalıştık, spontan lenfödem çözünürlüğünü önlemek için, ama bu genellikle sonraki şiddetli morbidite yol açmıştır²⁵.

Bu model, mikrocerrahi ile radyasyonu birleştirerek, ciddi morbiditeye neden olmadan istatistiksel olarak anlamlı lenfödem ile sonuçlanır. Model lenfödem neden ışınlama bir doz ekleyerek önceki bir cerrahi modelden revize edilmiştir, ciddi morbidite neden olmadan²⁶. Ayrıca mikrocerrahi eğitimi için büyük bir fırsat sunuyor. Farelerin küçük anatomik yapıları nedeniyle mikrocerrahi ekipmana ve mikroskopa erişim gereklidir. Cerrahi işlem, kullanıcıya mikrocerrahi aletlerle dikiş gibi temel mikrocerrahi teknikler öğretildiğinde yapılabilir. Bu prosedürü gerçekleştiren operatörler, Acland'ın mikrocerrahi becerileri (1981) ve temel mikrosutür tekniği (1985) ön koşulları üzerine eğitim videolarını izlediler. Araştırmada kullanmadan önce cerrahi işlemi 8−10 kez uygulamanızı öneririz. Yordamın uygulanması, daha az hata yapılmasını ve yordamın daha verimli bir şekilde gerçekleştirilmesini sağlar. Mastered zaman, cerrahi işlem 45 dakika içinde yapılabilir.

Protokol

Hayvanlar, kurumsal kurallara göre Güney Danimarka Hayvan Bakım Tesisi'nde barınDı. Hayvan denekleri ile ilgili tüm prosedürler Hayvan Deneyleri Müfettişliği, Danimarka Çevre ve Gıda Bakanlığı tarafından onaylanmıştır.

1. Ameliyat öncesi ışınlama

NOT: Ameliyat öncesi ışınlama ameliyattan 7 gün önce gerçekleşir.

1. Anesteziyi teşvik edin.
   1. Fareyi bir indüksiyon kutusuna yerleştirin ve inhalasyon anestezisini sağlamak için buharlaştırıcıyı 0,8−1,2 L/dk oksijen akış hızıyla %3 izoflurana ayarlayın.
      NOT: Alternatif olarak, enjektabl anesteziler kullanılabilir ancak ışınlama indükleme indükleme anestezisi kısa süreli için yeterli ydi. Bu makalede sunulan sonuçların elde edilmesi için 9 haftalık dişi C57BL6 fareler kullanılmıştır.
   2. Farenin kuyruk veya pençe kıskaç testi ile tamamen anestezi aldığından emin olun.
2. Işınlama için fareyi konumlandırın.
   1. Tamamen sakinleştirilmişse, fareyi indüksiyon kutusundan hareket ettirin ve supine pozisyonunda radyasyon kaynağının altına yerleştirin ve arka uzuvları bantla hafifçe sabitleyin.
      NOT: Fare radyasyonkısa süre boyunca sakin kalacaktır.
   2. Sadece ameliyat olan alanın (yani diz çevresinde 25 mm çapında dairesel alanın) ışınlanmış olmasını sağlamak için 1,5 mm kalınlığında bir kurşun ped yerleştirin.
3. 5.11 Gy/dk (100 kVp, 10 mA) doz hızında 10 Gy radyasyon uyguluyorum.
   DİkKAT: Radyasyonla çalışırken güvenlik önlemleri alınmalıdır. Bu deney sırasında, tüm ışınlama radyasyon yalıtımlı bir odada yapıldı ve radyasyon kaynağı sadece tüm personel ayrıldı ve oda mühürlü zaman açık oldu.
4. Fareyi kafesine geri yerleştirin.

2. Ekipman kurulumu

NOT: Cerrahi işlemlere adanmış bir odada yapılmalıdır. Ameliyat yüzeyi steril olmalıdır.

1. Tüm ameliyat yüzeylerini %70 etanol ile iyice temizleyin. Saç ağı ve tulum takın. Steril cerrahi aletler ve steril eldivenler kullanın.
2. Anestezi hazırlayın.
   1. 1 mL fentanil (0.315 mg/mL), 1 mL midazolam (5 mg/mL) ve 2 mL steril su çekin. Farklı bileşenler için farklı şırıngalar ve iğneler kullanın.
   2. Şırıngaları yavaşça steril cam bir tüpe boşaltarak fentanil ve steril suyu karıştırın. Karıştırıldığında, çalışma çözüm tamamlamak için midazolam ekleyin.
3. Analjezi hazırlayın.
   1. 0.2 mL buprenorfin (0.3 mg/mL) ve 2 mL tuzlu su.
   2. Çalışma çözümünü tamamlamak için şırıngaları steril cam bir tüpe yavaşça boşaltarak hacimleri karıştırın.
4. Mikroskobu açın ve aydınlatmanın yeterli olduğundan ve mikroskobun operatörün gözlerine iyi ayarlandıklarından emin olun.
   NOT: Tüm cerrahi işlemler bir işletim mikroskobu altında yapılmalıdır. 4x−25x arasında bir büyütme aralığı yeterlidir.

3. Hazırlık

1. Fareyi temizlenmiş bir ölçekte boş bir kapta yerleştirerek fareyi ameliyat öncesi tartın.
2. Anestezi uygulayın.
   1. Fare vücut ağırlığının 10 g'ı başına 0,1 mL anestezi kçekini çizin. Anesteziye bolus enjeksiyonu olarak deri altı enjekte edin.
   2. Fare tamamen uyuşturulmuş kadar yaklaşık 10 dakika boyunca bol yatak ve barınak ile bir kafes içinde dinlenmeye bırakın. Kas gevşemesi değerlendirerek anestezik derinliği incelemek ve pençe veya kuyruk çimdik testi yapmak.
3. Tamamen sakinleştirildiğinde, elektrikli makasları kullanarak işlem için seçilen arka ekstremitetıraş. Fazla saç silme emin olun.
4. Isıtma yastığı gibi ısıtma cihazını açın ve üzerini cerrahi bir bezle kapatın.
5. Oksijen akışını 0,8 L/dk'ya ayarlayın ve nosecone ile bağlayın. %100 oksijen kullanın.
   NOT: Nosecone sadece oksijen iletimi için değil, anestezi içindir.
6. Ameliyat sırasında hipovolemi önlemek için oftalmik merhem uygulayın ve tercihen farenin pasaklı 0.5 mL'lik salin altı enjekte edin.
7. Ameliyat için fareyi yerleştirin.
   1. Fareyi cerrahi bezin üzerine supine pozisyonunda yerleştirin. Nosecone'u buruna yerleştirin.
   2. Farenin ameliyat sırasında kaymasını önlemek için arka bacakların ucunu bantla hafifçe sabitleyin.
   3. Alkol/klorheksidin veya alkol/povison iyot kullanarak cildi sterilize edin.

4. Cerrahi

NOT: Bu örnekte, sol arka ekstremite (fare supine pozisyonunda görüntülendiğinde), yordam için seçilmiştir.

1. Dairesel bir kesik yap.
   1. Pürüzsüz forseps ile cildi kaldırın ve popliteal fossa yaklaşık 5 mm proksimal küçük bir açıklık klip.
   2. Keskin makasları açıklığa doğru kaydırın ve kesi diz den hemen yukarıda durmasını sağlayacak şekilde dize doğru klip çekin. Kırpma sırasında forseps ile cildi kaldırarak altta yatan damarları delmemeyen emin olun.
   3. Fareyi yatkın konuma getirin ve çevresel kesi tamamlanana kadar dizden popliteal fossa doğru klipsdevam edin.
2. Diz altındaki deriyi inceleyin.
   1. Yavaşça künt ayak bileği üzerinde milimetre bir çift diz altında alanı incelemek, yavaş yavaş açarak ve forceps ile cilt kaldırırken mikrosk kapatarak.
   2. Mikrosksörler kullanarak görünür yapışıklıkları dikkatlice sikiler. Tüm işlem sırasında doku nemli tutmak için düzenli olarak steril salin kullanın.
3. Elastik bir retraktör ile geri çekilebilir böylece çevresel kesi proksimal kenarında cilt diseksiyon.
   NOT: Retraktör operatöre proksimal lenf damarının daha iyi bir görünümünü sağlar ve ameliyat sırasında proksimal jantın kaymasını önler.
4. Hala eğilimli pozisyonda yken, arka ekstremiteyi hafifçe döndürün ve bantla sabitleyin, böylece ischiatik ven maruz kalan alanın en proksimal noktasından en distal noktaya kadar görünür.
5. 30 G iğne ile 0,5 mL şırınga kullanarak ikinci ve üçüncü ayak arasında yaklaşık 0,01 mL Patent Blue V deri altı enjekte edin. Patent Mavi V.'yi mikroskop aracılığıyla görselleştirmek için pençeye birkaç kez basın.
   NOT: İşlem sırasında lenf damarlarının mavi rengi soluksa, daha fazla Patent Mavi V. Patent Mavi V fazla kullanımı enjekte yerine, yavaşça alımı teşvik pençe masaj sızıntı ve lenf damarları çevreleyen doku renklendirmeyol açabilir prosedürü tehlikeye atmak.
6. Önemli yapıları bulun: popliteal lenf düğümü (PLN), lenf düğümüne distal iki lenf damarları (DLV1 ve DLV2), ve lenf düğümüne proksimal bir lenf damarı (PLV).
   NOT: Tüm lenf damarları ischiatic ven bitişik bulunabilir. Proksimal lenf damarı genellikle vene medial bulunur, iki distal lenf damarları medial ve ven lateral bulunur. Yapıların kısaltmaları eşlik eden videoda kullanılır.
7. PLV'yi net bir şekilde görselleştirmek ve mikro iğne tutucu ve mikrokosepler kullanarak 10-0 naylon dikişle etkisiz hale getirmek için büyütün. Hiçbir Patent Mavi V dikiş proksimal geçer emin olmak için pençe birkaç kez basın.
   NOT: Lenf damarını çevreleyen yağın kesilmesi gerekli olabilir.
8. Tekrar adım 4.7 iki distal lenf damarları ligate. Hiçbir Patent Blue V ligatür proksimal geçer emin olmak için pençe birkaç kez basın. Lenf damarları ischiatic vene yakın yalan varsa, daha da distal diseksiyon deneyin.
   NOT: Bu örnekte, lenf damarlarından birinin lenf akışını engelleyen bağ nedeniyle patlar olduğu görülebilir. Lenf damarları genellikle daha aşağı damardan bölünecektir.
9. Popliteal lenf düğümlerini çıkarın.
   1. Popliteal lenf düğümü bulmak ve mikroskalorsile küçük bir delik kesmek erişmek ve mikroforps ve mikroskalsorsile kaldırmak.
      NOT: Lenf düğümü, çevredeki yağ dokusunun aksine yumuşak inci benzeri bir yüzeye sahiptir.
   2. Çıkarılan doku bir lenf düğümü olup olmadığını test etmek için, su dolu bir test tüpü yerleştirin.
      NOT: Doku yağ oluşursa, doku yüzer. Doku lenf düğümü ise, dibe batar.
10. Inguinal yağ yastığı ve lenf düğümü çıkarın.
    1. Inguinal yağ yastığı çıkarmadan önce, yağ ile çalışan damarları cauterize etmek için bir bipolar koagülatör kullanın.
    2. Mikroforceps ve mikrosisepsörler kullanarak inguinal yağ yastığı rezeksiyon. Yavaşça yağ ile çalışan kapları kes. Sonra yavaşça inguinal bölgede yağ dokusu rezeksiyon.
       NOT: Yağ bulunan lenf düğümü nadiren Patent Mavi V ile renkli ve yağ ayırt etmek zor olabilir. Tek parça halinde yağ yastığı çıkarma lenf düğümü kaldırıldı sağlamak için en iyi yoldur.
11. Bacağı steril salinle iyice durulayın ve yara kontaminasyonunu ve enfeksiyonunu önlemek için küçük kılların ve partiküllerin cerrahi alandan iyice çıkarıldığını mikroskop la doğrulayın. Aktif kanama olmadığından emin olun.
12. Forseps ve iğne tutucu kullanarak 6-0 naylon dikiş ile kas facia aşağı cilt kenarları dikiş, yüzeysel lenf akışını kısıtlamak için 2−3 mm boşluk bırakarak.
    NOT: Eşlik eden video bitmiş dikişbir örnek gösterir.
13. Analjezi uygulayın. Fare vücut ağırlığı nın 30 g'ına göre 0,1 mL analjezi çizin. Analjeziyi bolus enjeksiyonu olarak subkutan olarak enjekte edin.
14. Karşılaştırma için ameliyat sonrası için fareyi tartın.
15. Kurtarma için ısıtılan bir dolap içinde bir kafesiçinde fare yerleştirin.

5. Ameliyat sonrası bakım

1. Su ve gıda reklam libitum ile ameliyattan sonra kurtarmak için fareler bireysel kafesler verin.
2. Analjezi için günde 3 gün boyunca günde 0.02 mL buprenorfin bolus subkutan dozu uygulayın.
3. Uygun yara iyileşmesi, ağrı ve enfeksiyon belirtileri için hayvan günlük izleyin. Enfeksiyon belirtileri varsa, antibiyotik merhem kullanın.

6. Ameliyat sonrası ışınlama

1. Ameliyattan üç gün sonra ameliyat öncesi ışınlama işlemini tekrarlayın (adım 1.1−1.4).

Sonuçlar

Bu yordam daha önce üç ayrı denemede kullanılmıştır. Tüm deneyler tüm bu makalenin ortak yazarları olan farklı kurşun araştırmacılar tarafından yapılmıştır. Her üç deneyde de, bu protokolde açıklandığı gibi aynı prosedüre uymak için büyük özen alınmıştır. Her üç deneyde de sekonder lenfödem bir arka ekte indüklenirken, diğer arka ekstremite kontrol olarak görev yaptı. Arka uzuvların hacimleri her üç deneyde de birincil sonuç oldu.

Tartışmalar

Bu protokolde birkaç kritik adım vardır. İlk olarak, araştırmacıların radyoaktivite ile çalışırken güvenlik önlemleri almaları önemlidir. İkinci olarak, bu protokolün cerrahi kısmı sırasında, fare anestezi edildikten sonra işlemi başlatmak ve gereksiz molalar vermeden bitirmek önemlidir. Bu hayvan için aşırı uzun bir cerrahi süre önlemek ve anestezi ameliyat sırasında etkisini kaybetmesini önlemek için önemlidir. Sadece bir adet anestezi enjeksiyonunun yapılması ve cerrahi işlemin t...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 Nylon suture	S&T	12051-10
6-0 Nylon suture - Dafilon	B Braun	C0933112
Coagulator - ICC 50	ERBE
Cotton tipped applicators	Yibon medical co
Dissecting forceps	Lawton	09-0190
Elastic retractors	Odense University Hospital
Electrical clipper	Aesculap	GT420
Fentanyl 0,315 mg/ml	Matrix
Heating pad - PhysioSuite	Kent Scientific Corp.
Isoflurane 1000mg Attane	Scan Vet
Isoflurane vaporizer - PPV	Penlon
Micro jewler forceps	Lawton	1405-05
Micro Needle holder	Lawton	25679-14
Micro scissors	Lawton	10128-15
Micro tying forceps	Lawton	43953-10
Microfine U-40 syringe 0,5ml	BD	328821
Microlance syringe 25g	BD
Microlance syringe 27g	BD
Midazolam 5 mg/ml (hameln)	Matrix
Needle holder - Circle wood	Lawton	08-0065
Non woven swabs	Selefa
Opmi pico microscope F170	Zeiss
Patent blue V - 25 mg/ml	Guerbet
Scissors - Joseph	BD	RH1630
Siemens INVEON multimodality pre-clinical scanner	Siemens pre-clinical solutions
Source of radiation - D3100	Gulmay
Stata Statistical Software: Release 15	StataCorp LLC
Temgesic - 0,2 mg	Indivior
Vet eye ointment - viscotears	Bausch & Lomb