Protein Adsorpsiyon ve Polimer Mekaniğinin Kuvars Kristal Mikroterazi Ölçümlerinde Örnek Hazırlama

Özet

Kuvars kristal mikrodengesi mikron veya submikron aralığındaki filmler için doğru kütle ve viskoelastik özellikler sağlayabilir, bu da biyomedikal ve çevresel algılama, kaplama ve polimer bilimi araştırmalarına yöneliktir. Numune kalınlığı, sensörle temas eden malzemeden elde edilebilen bilgileri etkiler.

Özet

Bu çalışmada, kuvars kristal mikrodenge deneyleri için ince film hazırlığının verilerin uygun modellemesini nasıl bilgilendirdiğini ve filmin hangi özelliklerinin ölçülebileceğini nasıl belirlediğine çeşitli örnekler savuruyoruz. Kuvars kristal mikrodengesi, yüksek frekansta salınım sağlayan bir kuvars kristalinin mekanik rezonansındaki değişiklikleri gözlemleyerek uygulanan bir filmin kütlesi ndeki ve/veya mekanik özelliklerindeki ince değişiklikleri ölçmek için benzersiz hassas bir platform sunar. Bu yaklaşımın avantajları arasında deneysel çok yönlülüğü, çok çeşitli deneysel zaman uzunlukları üzerindeki özelliklerindeki değişiklikleri inceleme yeteneği ve küçük örneklem boyutlarının kullanımı sayılabilir. Sensöre yatırılan tabakanın kalınlığı ve kesme modülüne dayanarak malzemeden farklı bilgiler elde edebileceğimizi gösteriyoruz. Burada, bu kavram özellikle tuz konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak şişme sırasında altın ve polielektrolit kompleksleri üzerinde adsorbe kollajen kütle ve viskoelastik hesaplamaları ile sonuçlanan deneysel parametreleri görüntülemek için istismar edilir.

Giriş

Kuvars kristal mikrodengesi (QCM), yüzeye yapışan kütleye bağlı olan rezonans frekansını izlemek için kuvars kristalinin piezoelektrik etkisinden yararlanır. Teknik, bir AT kesim kuvars kristal sensörünün (genellikle 5 MHz aralığında)^1'in rezonans frekansını ve bant genişliğini, bir filmin birikmeden sonra sensörün frekansı ve bant genişliğiyle karşılaştırır. İnce film özellikleri ve arayüzleri incelemek için QCM'yi kullanmanın çeşitli yararları vardır, buna kütleye karşı yüksek duyarlılık ve viskoelastik özellik değişikliklerine potansiyel olarak (örnek tekdüzelik ve kalınlığa bağlı olarak), yerinde^2'deçalışmalar yapabilme ve geleneksel kesme romatolojisinden veya dinamik mekanik analizden (DMA) çok daha kısa bir romatolojik zaman ölçeğini araştırma yeteneği de dahil olmak üzere. Kısa bir reolojik zaman ölçeğini araştırmak, bu zaman ölçeğindeki yanıtın hem son derece kısa (ms)³ hem de uzun (yıl) süreler^4'tenasıl değiştiğini gözlemlemeyi sağlar. Bu yetenek kinetik süreçlerin çeşitli çalışma için yararlı ve aynı zamanda geleneksel reometrik teknikleri yararlı bir uzantısıdır^5,6.

QCM'nin yüksek hassasiyeti, son derece küçük biyomoleküllerin temel etkileşimlerini inceleyen biyolojik uygulamalarda da yoğun kullanımına yol açmıştır. Bir kaplamasız veya fonksiyonel sensör yüzeyi protein adsorpsiyon araştırmak için kullanılabilir; daha da, enzimler arasında karmaşık bağlanma olayları ile biosensing, antikorlar, ve aptamers kütle değişiklikleri dayalı incelenebilir^7,8,9. Örneğin, bu teknik, sıvı içeren veziküllerin sert bir yapıya adsorpsiyonunun iki aşamalı bir işlem olarak düzlemsel lipid çift katmanlı hale dönüşümünün, frekans ve viskoelastisitedeki değişiklikleri gözlemleyerek anlaşılması için kullanılmıştır¹⁰. Son yıllarda, QCM ayrıca veziküller veya nano tanecikleri¹¹tarafından ilaç dağıtımını izlemek için sağlam bir platform sundu. Malzeme mühendisliği ile moleküler ve hücresel biyolojinin kesiştiği noktada, qcm'yi malzemeler ve proteinler, nükleik asitler, lipozomlar ve hücreler gibi biyoaktif bileşenler arasındaki temel etkileşimleri açıklamak için kullanabiliriz. Örneğin, bir biyomateryale protein adsorpsiyonu inflamasyon gibi hücresel yanıtları aşağı aracılık eder ve genellikle biyouyumluluğun olumlu bir göstergesi olarak kullanılırken, diğer durumlarda kanla arabirim infilak eden kaplamalara hücre dışı protein eki damarlarda tehlikeli pıhtılaşmaya neden olabilir^12,13. BU nedenle QCM, farklı ihtiyaçlar için en uygun adayları seçmek için bir araç olarak kullanılabilir.

QCM denemelerinin gerçekleştirmek için iki yaygın yaklaşımı deneyden benzer veriler toplar: ilk yaklaşım, iletkenlik zirvesinin frekans değişimini ve yarım bant genişliğini(Γ)kaydeder. İkinci yaklaşım, QCM dağılım (QCM-D), frekans kayması ve denklem 1,¹⁴ ile Γ ile doğru orantılı dağılım faktörü kaydeder

(1)

D dağılma faktörü ve ƒ frekansı dır. Hem D hem de Γ, filmin sensör üzerindeki sönümleme etkisiyle ilişkilidir ve bu da filmin sertliğinin bir göstergesidir. Subscript n kuvars sensörü (n = 1, 3, 5, 7...) tek rezonans frekansları olan frekans overtone veya harmonik, gösterir. Bir filmin kütle ve viskoelastik özelliklerini elde etmek için birden fazla harmonik kullanarak modellerin daha fazla tartışma Johannsmann tarafından bir inceleme bulunabilir¹⁴ ve Shull grup önceki kağıtları^15,16,17,18.

QCM örnekleri nin hazırlanmasında göz önünde bulundurulması gereken en önemli noktalardan biri, ince filmin sensör yüzeyine nasıl uygulanacağıdır. Bazı yaygın yöntemler spin kaplama, daldırma kaplama, damla kaplama, ya da deneme sırasında sensör yüzeyine filmin adsorpsiyon^{içerir 19,20}. QCM örnekleri için dört bölge vardır: Sauerbrey sınırı, viskoelastik rejim, dökme rejim ve aşırı damped rejimi. Yeterince ince filmler için, Frekans kayması(Δƒ) filmin yüzey kütle yoğunluğunu sağladığı Sauerbrey sınırı uygulanır. Sauerbrey limiti içinde, frekans kayması rezonans harmonik ile doğrusal ölçekler, n, ve sönümleme faktörü değişiklikleri(D veya Γ) genellikle küçüktür. Bu rejimde ek varsayımlar yapmadan katmanın reolojik özelliklerini benzersiz olarak belirlemek için yeterli bilgi mevcut değildir. Bu rejimdeki veriler, filmin yüzey kütlesi yoğunluğunu (veya yoğunluğu bilinen a prioriise kalınlığı) hesaplamak için kullanılır. Kristalle temas eden ortamın yeterince kalın olduğu dökme rejimde, yarıcı kesme dalgası tamamen nemlendirilmeden önce ortama yayılır. Burada Δƒ kullanılarak hiçbir kütle bilgisi elde edilemez. Ancak, bu bölgede viskoelastik özellikler Δ ƒ ƒ ve ΔΓ 15^{, 18}kombinasyonu kullanılarak güvenilir bir şekilde belirlenir. Dökme rejimde, ortam çok sertse, film sensörün rezonansını nemli olarak nemlandırarak QCM'den güvenilir verilerin toplanmasını önler. Viskoelastik rejim, filmin kesme dalgasının film boyunca tam olarak yayılmasını ve sönümleme faktörü için güvenilir değerlere sahip olmasını sağlamak için yeterince ince olduğu ara rejimdir. Sönümleme faktörü ve Δƒ daha sonra filmin viskoelastik özelliklerini ve kütlesini belirlemek için kullanılabilir. Burada, viskoelastik özellikleri yoğunluk ve karmaşık kesme modülü büyüklüğü ürünü tarafından verilir | G*| p ve Φ = arctan(G" / G'tarafından verilen faz açısı). Filmler Sauerbrey sınırında hazırlandığında, birim alan başına^{kütle, 21'in}altında gösterilen Sauerbrey denklemine göre doğrudan hesaplanabilir.

(2)

δƒ_n rezonans frekansındaki değişim, n ilginin overton, ƒ₁ sensörün rezonans frekansı, Δm / A filmin alan başına kütle, ve Z_q kuvars akustik empedans, AT kesme kuvars için Z_q = 8.84 x 10⁶kg / m²s. Viskoelastik rejim polimer filmlerinin incelenmesi için en uygundur ve hacim sınırı viskoz polimer²² veya protein çözeltilerinin incelenmesi için yararlıdır^16. Farklı rejimler, tam viskoelastik ve kütle karakterizasyonu için optimum kalınlık genellikle film sertliği ile artan ilgi malzemenin özelliklerine bağlıdır. Şekil 1, bu tür malzemelerle ilgili olduğu gösterilen faz açısı ile film sertliği arasında belirli bir ilişki varsaydığımız filmin areal yoğunluğu, karmaşık kesme modülü ve faz açısı na göre dört bölgeyi tanımlar. Pratik ilgi birçok film qcm ile viskoelastik özellikleri incelemek için çok kalın, bazı biyofilmler gibi, kalınlıkları mikron yüzlerce onlarca sırada olduğu^23. Bu tür kalın filmler genellikle QCM kullanarak çalışma için uygun değildir, ancak çok daha düşük frekanslı rezonatörler kullanılarak ölçülebilir (burulma rezonatörleri gibi)²³, kesme dalgası film içine daha fazla yaymak için izin.

Belirli bir QCM numunesi için hangi rejimin uygun olduğunu belirlemek için, film kalınlığının(d)kuvars kristal sensörünün mekanik salınımının (λ_n) 15^,16,18'eoranı olan d / λ_n parametresini anlamak önemlidir. İdeal viskoelastik rejim d / λ_n = 0,05 - 0,2¹⁸' dir, 0,05'in altındaki değerlerin Sauerbrey limiti içinde olduğu ve 0,2'nin üzerindeki değerlerin kütle rejimine yaklaştığı yerdir. D / λ_n daha titiz bir açıklama başka bir yerde sağlanır^15,18, ama sauerbrey sınırı ve viskoelastik sınırı delineating bir nicel parametre. Aşağıda kullanılan analiz programları bu parametreyi doğrudan sağlar.

QCM ile ince filmleri analiz etmek için bazı ek sınırlamalar vardır. Sauerbrey ve viskoelastik hesaplamalar filmin hem film kalınlığı boyunca hem de YANAL QCM elektrot yüzeyinde homojen olduğunu varsayar. Bu varsayım boşluklar veya dolgu mevcut olan filmleri incelemek için zor olsa da, aşılı nano tanecikleri oluşan filmlere bazı QCM araştırmalar olmuştur⁶. Heterojenlikler genel film kalınlığına göre küçükse kompozit sistemin güvenilir viskoelastik özellikleri elde edilebilir. Daha heterojen sistemler için viskoelastik analizden elde edilen değerler her zaman dikkatle görülmelidir. İdeal olarak, heterojenliği bilinmeyen sistemlerden elde edilen sonuçlar homojen olduğu bilinen sistemlere karşı doğrulanmalıdır. Bu yazıda açıklanan örnek sistemde aldığımız yaklaşım budur.

Bu yazıda gösterdiğimiz önemli bir nokta, frekans etki alanında (Γ'in raporlandığı yer) QCM ölçümleri ile zaman etki alanı deneyleri (D'nin raporlandığı) arasındaki tam yazışmadır. Her biri farklı ama kavramsal olarak ilişkili bir model sistemi içeren iki farklı QCM deneyinin, bir kez etki alanının ve bir frekans etki alanının sonuçları açıklanmıştır. İlk sistem bir zaman etki alanı (QCM-D) ölçümü sırasında temsili bağlayıcı kinetik ve zaman içinde adsorpsiyon denge göstermek için sensörkolajen eki basit bir örnektir. Kollajen vücutta en bol protein, bağlayıcı davranışlar ve morfoloji onun çok yönlülük için bilinir. Burada kullanılan kollajen çözeltisi adsorpsiyon⁹neden sensörün altın yüzeyinin ek işlevselleştirme gerektirmez. İkinci deneysel sistem, anyonik polistiren sülfonat (PSS) ve katyonik poli (diallyldimethylamumumum) (PDADMA) tarafından Sadman ve ark.²²ile aynı şekilde hazırlanmış polielektrolit kompleksidir .22 . Bu malzemeler şişip tuz (bu durumda KBr) çözeltilerinde yumuşak hale gelir, polimer mekaniğinin bir frekans etki alanı yaklaşımı (QCM-Z) kullanılarak incelenmesi için basit bir platform sunar. Her protokol için, bir ölçümün hazırlanması, alınması ve analiz iå lemi Å il 2'de gösterilmiştir. Şema, QCM-Z ve QCM-D yaklaşımları arasındaki temel farkın veri toplama adımı nda ve deneyde kullanılan enstrümantasyonolduğunu gösterir. Belirtilen tüm numune hazırlama teknikleri her iki yaklaşımla da uyumludur ve her yaklaşım Şekil 1'degösterilen üç bölgede örnekleri analiz edebilir.

Verilerimiz, numunelerin bir ölçümden önce veya ölçüm sırasında sensör kaplaması ile hazırlanmasının, bir sistemin viskoelastik özelliklerini ayıklama yeteneğini gerektirdiğini göstermektedir. Bir deneyin erken aşamalarını uygun şekilde tasarlayarak, analiz adımı sırasında hangi bilgileri doğru bir şekilde toplayabileceğimizi belirleyebiliriz.

Protokol

QCM-D Kollajen Adsorpsiyon

1. Numune Hazırlama ve Sensör Ön Temizliği

1. PH = 5.6 elde etmek için gerekli olan pH'ı HCl ve NaOH ile ayarlayarak 0,1 M asetat tamponunun 20 mL'sini hazırlayın.
2. Steril koşullar altında 20 mL asetat tamponuna fare kuyruğu kollajen çözeltisini 10 μg/mL'lik son konsantrasyona ekleyin.
3. Organik ve biyolojik malzeme^25,26kaldırmak için altın kaplı kuvars sensörü temizleyin.
   1. Sensörüaktif tarafı uv/ozon haznesinde yerleştirin ve yüzeyi yaklaşık 10 dakika boyunca tedavi edin.
   2. Isı 5:1:1 deiyonize su karışımı (dH₂O), amonyağ (%25) ve hidrojen peroksit (%30) 75 °C'ye kadar. Sensörü 5 dk boyunca çözeltiye yerleştirin.
   3. Sensörü dH₂O ile durulayın ve bir azot gazı akışı yla kurulayın.
   4. Sensörüaktif tarafı uv/ozon haznesinde yerleştirin ve yüzeyi 10 dakika boyunca tedavi edin.
      NOT: Sensör yüzeyindeki çevresel kirlenmeyi en aza indirmek için ölçümden önce temizleme işlemi hemen yapılmalıdır.

2. QCM-D Ölçüm Veri Toplama

1. Pompa, elektronik ünitesi ve bilgisayar yazılımı da dahil olmak üzere bir ölçüm almak için gerekli tüm ekipmanları açın.
2. Akış modüllerini oda platformundan çıkarın ve modülü açmak için büyük başparmak vidalarını çıkarın.
3. Sensör ilk temizlemeden sonra (adım 1.3.1-1.3.4) dışarıda bırakılmışsa, yüzeyde kirletici madde olmadığından emin olmak için sensörü deiyonize su (dH₂O) ile durulayın ve azot gazı akışı yla kurulayın.
4. Sensörü akış modülüne maruz kalan O-halkasına yerleştirin, önce bölgeyi bir azot gazı akışıyla kurutun ve O halkasının düz yattığını kontrol edin. Sensör aktif yüzey tarafı aşağı ve akım modülündeki işaretleyiciye doğru yönlendirilmiş çapa şeklinde elektrot ile yerleştirilmelidir.
5. Akış modülünü kapatmak için başparmak vidalarını çevirin ve oda platformunda değiştirin. Akış modülüne ve harici pompaya gerekli PTFE pompa tüplerini takın.
6. Uygun bilgisayar yazılımını kullanarak akış modülünün sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın. İstenilen değerde dengede olduğundan emin olmak için değişen sıcaklığı 10-15 dakika boyunca izleyin.
7. Sensörün ilk rezonans frekanslarını bulun. Yazılım tarafından herhangi bir rezonans frekansı bulunamazsa, akış modülünün oda platformuna doğru şekilde yerleştirilip yerleştirilmediğini kontrol edin veya sensöre merkezi olduğundan ve uygun elektrik selaci nin yapılmasından emin olmak için akış modülüne yeniden monte edin.
8. Giriş pompası borularını 1x fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisine yerleştirin. Harici pompa akışını 25 μL/dk'dan başlatın ve sıvının tüpten aktığından emin olmak için tüpü görsel olarak inceleyin.
   NOT: Sıvı akış hızını anlık olarak 100 μL/dk veya daha fazlaya çıkararak sıvı akışını görmek daha kolay olabilir. Akışkan tüp boyunca hareket ediyor gibi görünmüyorsa, akış modülünün iki parçasının uygun bir mühür oluşturmaması büyük olasılıkla. Başparmak vidalarını sıkmayı, borunun konektörlerini giriş ve prizine kadar sıkmayı veya O-ringin düz ve ortalanmış olduğundan emin olmak için sensörü yeniden monte etmeyi deneyin.
9. 1x PBS'nin akışlı akışının akış modülünden en az 15 dakika boyunca düzgün bir şekilde dengelemesine izin verin.
10. Veri toplamaya başlamak için bilgisayar yazılımındaki ölçümü başlatın. Kararlı bir taban çizgisi sağlamak için frekans ve dağılma değerlerini en az 5 dakika boyunca izleyin.
11. Pompayı durdurun ve giriş boruyu kollajen-asetat tampon çözeltisine taşıyın ve sıvı akışına devam edin. Daha sonraki çözümleme için bu olayın saatini not edin.
12. Yeni frekans ve dağıtım değerlerinin kararlı bir değere dengede durmasını bekleyin. Burada bu stabilizasyonun 8-12 saat sonra gerçekleşmesini bekliyoruz.
13. Pompayı durdurun, giriş borularını 1x PBS çözeltisine geri taşıyın ve sıvı akışına devam edin. Daha sonraki çözümleme için bu olayın saatini not edin.
14. Yeni frekans ve dağıtım değerlerinin kararlı bir değere dengede durmasını bekleyin. Burada bu stabilizasyon 30 dk sonra gerçekleşir.
    NOT: 2.13 ve 2.14 adımları, daha fazla sayıda aşamayla daha zorlu deneylerde her yeni akış dönemi için tekrarlanabilir.
15. Ölçümün veri toplamasını sonla ve verileri kaydet.
16. QCM ekipmanını temizleyin ve sökün.
    1. Dış pompanın sıvı akış hızını 500 μL/dk veya daha fazlaya çıkarın ve giriş borularını en az 20 dakika boyunca %2 Hellmanex temizleme çözeltisi çözeltisine yerleştirin.
       NOT: Diğer deneyleriçin, sensörün daha fazla analizi isteniyorsa, 2.16.1 adımından önce sensörü çıkarın ve modüle başka bir temizleme sensörü yerleştirin.
    2. Pompayı durdurun ve giriş borusu dH₂O'ya taşıyın ve en az 20 dakika boyunca sistemi daha fazla yıkamak için sıvı akışını devam ettirin.
    3. Sıvı akışını durdurun ve sensörü akış modülünden çıkarın. Sensörü ve akış modülünün içini bir azot gazı akışı ile kurulayın. Bilgisayar yazılımını, elektronik üniteyi ve peristaltik pompayı kapatın.
       NOT: Altın kaplı sensörler, 1.3.1-1.3.4 adımlarında ayrıntılı olarak belirtildiği gibi düzgün bir şekilde temizlenebilir ve çeşitli ölçümler için yeniden kullanılabilir. Bir sensörün artık güvenilir ölçümler için yeniden kullanılamayabildiği göstergeler, ilk rezonans frekanslarında büyük değişkenlik ve tampon akışı olan temel ölçümlerde önemli sürüklenmeler içerebilir, ancak bunlarla sınırlı değildir. Veriler, QCM-D ekipmanı konusunda uzmanlaşmış şirketler tarafından sağlananlar da dahil olmak üzere, tercih edilen yazılımda açılabilir ve analiz edilebilir.

QCM Polielektrolit Kompleksi Şişmesi

3. Örnek Hazırlama

NOT: Bu deney, veri toplama ve analiz için Shull araştırma grubu içinde geliştirilen bir MATLAB programı kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

1. İlk olarak, vektör ağı analizörüne ve bilgisayara bağlı bir numune tutucuya çıplak kuvars kristal sensörü yerleştirin. Sensöre salınım gerilimi uygulamak için analizörü açın ve havadaki sensör için bir referans iletkenlik spektrumu toplayın.
2. Numune tutucuyu distile suyla dolu dudaksız 100 mL'lik bir kabın içine batırın ve sudaki çıplak sensör için bir referans iletkenlik spektrumu toplayın.
3. Potasyum bromür (KBr) 0,5 M çözeltisi hazırlayın.
   1. 1,79 g KBr'yi 30 mL distile suda çözün. Eriyene kadar çalkalayın.
   2. KBr çözeltisine küçük bir silikon gofret takın ve filmin sensörden çıkmasını önlemek için kuvars sensörü için bir slayt oluşturun.
4. Sensörü spin kaplamaiçin hazırlayın.
   1. Spin kat parametrelerini 10.000 rpm, 8.000 ivme ve 5 s olarak ayarlayın.
   2. Sensörü spin kaplamaya takın ve vakumu açın.
   3. Sensörün yüzeyini etanolle kapatın ve sensör yüzeyini temizlemek için spin kaplamayı çalıştırın.
   4. PEC (PSS:PDADMA Sadman ve ark ayrıntılı olarak aynı şekilde hazırlananekleyin. ²²) sensörün yüzeyine.
      1. Kompleks iki aşamadaysa (polimer açısından zengin ve polimer fakir), boruyu yavaşça çözeltiye takın. Pipeti daha yoğun polimer zengin faza hareket ettirirken kabarcıkları üfleyerek pipeti boşaltın.
      2. Polimer açısından zengin fazda birkaç kabarcık saldıktan sonra, polimer açısından zengin çözeltinin 0,5-0,75 mL'sini pipete yerleştirin. Polimer zayıf fazın pipete girmesine izin vermemek için pipet ampulü üzerindeki basıncıkorumak, boruyu çözeltiden dışarı çekin.
      3. Kimwipe kullanarak pipetin dışını silin. Kuvars sensörünün yüzeyine yüzeyi tamamen kaplayacak kadar çözelti ekleyin. Sensör yüzeyinde çözeltide görünür kabarcık olmadığından emin olun.
5. PEC numunesini döndürün ve filmde tuz kristalizasyonunu önlemek için sensörü hemen 0,5 M KBr çözeltisine batırın.
   NOT: Bu adımı bazen koordine etmek zordur. En iyi sonuçlar için sensörü KBr çözeltisinin hemen üzerinde bırakın.
6. Filmin en az 12 saat süreyle anneal'a girmesine izin verin.
   NOT: Deneyi gerçekleştirmekolaylığı için, akşam 4.

4. Filmin Hava ve Suda Ölçülmesi

1. Fazla KBr'yi filmden ve sensörün arka tarafındaki kbr'yi çıkarmak için sensörü distile suyla dolu bir kabına aktarın. Sensörü çözeltide 30-60 dk bekletin.
2. Havada filmin bir ölçüm alın. Havadaki çıplak sensöre başvuru. Film verilerinin dengede olmasını bekleyin.
3. Kurutulmuş kalsiyum sülfatı 100 mL dudaksız kabına takın ve tamamen kuru film kalınlığını ölçün. Kabın kalsiyum sülfatını çıkarın ve kabı damıtılmış suyla durulayın.
4. 100 mL dudaksız kabı 30 mL distile su ile doldurun. Suyun filmin etrafında dolaştığından emin olmak için bir karıştırma çubuğu takın. Filmi yaklaşık 30-45 dakika suda veya film verileri dengelenirolana kadar ölçün. Sudaki çıplak sensöre başvuru.
5. Distile suda 3 M KBr'lik 15 mL'lik bir çözelti hazırlayın. 5,35 g KBr'yi mezun olmuş bir silindire ölçün ve distile suyla 15 mL'ye doldurun. Eriyene kadar girdap.
6. KBr çözeltisini 0,1 M'lik artışlarla distile su ile kabına ekleyin. Tablo 1, 3 M KBr çözeltisinin mL'indeki 0,1 M'lik artışları özetler. KBr çözeltisinin suya eklendiği yerden filmle yüzleşin ki film erimesin. KBr çözeltisinin başka bir ekini eklemeden önce sistemin dengede olduğundan emin olun.
7. Tüm veriler elde edildikten sonra, filmi tutucudan çıkarın ve distile su kabına yerleştirin. Tuz film (30-60 dk) bırakın ve hava film kuru.
8. PEC filmini sensörden temizlemek için, kabın üzerine KBr ekleyin ve çözeltiyi yavaşça döndürün. 5-10 dakika oturun. Bu işlemi 2-3 kez tekrarlayın, ardından sensörü distile suyla durulayın.
   NOT: Sensörden gelen yanıt hala iyiyse sensör temizlenebilir ve yeniden kullanılabilir. Bu, ilgi harmonikleri için küçük mutlak bant genişliği okumalarına sahip sensör tarafından kontrol edilebilir (<100 Hz).

5. Veri Analizi

1. Sadman tarafından oluşturulan QCM-D veri analizi MATLAB GUI açın (https://github.com/sadmankazi/QCM-D-Analysis-GUI)²⁷. "Load QCM" seçeneğini seçerek filmi hava veri dosyasında açın.
   NOT: Shull grubu QCM(https://github.com/shullgroup/rheoQCM)için veri toplama ve analiz için benzer bir Python GUI geliştirmiştir. Analiz kodunun bir kısmı, hem verileri çözümleme hem de bu makaledeki şekilleri oluşturmak için ek bilgilerde sağlanır.
2. İstediğinhesaplamayı (3,5,3 veya 3,5,5), gamave hava simgelerinde film seçin. Çizim QCM'yitıklatın.
3. Deneyden en çok eşitedilen veri noktasını (genellikle son veri noktası) kullanarak kuru filmin kalınlığını belirleyin. Bu değeri kaydedin.
4. Filmi su veri dosyasında açın. Adım 5.2'deki gibi aynı parametreleri seçin, havada film yerine sudaki film hariç.
5. Şişme deneyinin her bir denge adımından sonra film kalınlığını, karmaşık kesme modülasyonlarını ve viskoelastik faz açısını belirleyin. Bu değerleri iyonik mukavemetle birlikte kaydedin (0-1 M arasında 0,1 M artışlarla).
6. Yüzde şişlik olarak belirleyin
   (3)
   dp çözeltiden film kalınlığı ve dp_kuru film kalınlığı nerede.

Sonuçlar

Protein adsorpsiyonsırasında zamanla frekans değişimleri Şekil 3A-B'degösterilen karakteristik bir eğri ve plato sergiler. Çıplak sensör yüzeyinde 1x PBS'nin ilk arabellek yıkaması, yalnızca frekans değişikliklerine neden olur ve gelecekteki veri noktaları için bir referans görevi görmek için sabit bir taban çizgisi sunar. Kollajen çözeltisinin piyasaya sürülmesi protein adsorpsiyonunun başlamasına neden olur, zaman içinde sürekli bir frekans d?...

Tartışmalar

Kollajen adsorpsiyon sonuçları Sauerbrey ve viskoelastik rejimleri kapsar. Normalleştirilmiş frekans kaymalarını ilgili harmonik sayıya göre çizerek, Sauerbrey limitinin ölçümün yaklaşık ilk 2 saatiçin geçerli olduğunu gözlemliyoruz. Ancak sensöre artan kütle yapışmasıyla, üçüncü ve beşinci harmonikler için normalleştirilmiş frekans değişimleri birbirlerinden sapmaya başlar(t > 2 h), adsorbe filmin viskoelastik özelliklerini belirleme yeteneğini gösterir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283	For collagen adsorption
Ammonium hydroxide solution	Sigma-Aldrich	221228	For collagen adsorption
Aqueous QCM probe	AWSensors	CLS 00050 A	For polyelectrolyte swelling
Collagen I Rat Protein, Tail	Thermo Fisher Scientific	A1048301	For collagen adsorption
Distilled water	Sigma-Aldrich	EM3234	For polyelectrolyte swelling; generally easy to acquire in research labs, but there is a catalog number in case it is not accessible
Ethanol	Sigma-Aldrich	793175-1GA-PB	For polyelectrolyte swelling
Gibco Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific	20012-027	For collagen adsorption
Hellmanex III	Sigma-Aldrich	Z805939	For collagen adsorption
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	216763	For collagen adsorption
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fisher Scientific	06-666A	For polyelectrolyte swelling
NP2K VNA	Makarov Instruments		For polyelectrolyte swelling
Poly(diallyldimethylammonium chloride), MW 200,000	Sigma-Aldrich	409022	For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al.
Poly(styrene-sulfonate) sodium salt 30% weight in water	Sigma-Aldrich	561967-500G	For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al.
Potassium Bromide	Sigma-Aldrich	793604-1KG	For polyelectrolyte swelling
QSense QCM Explorer System	Biolin Scientific		For collagen adsorption
Sodium acetate, anhydrous	Sigma-Aldrich	S2889	For collagen adsorption
Spin coater, Model WS-650MZ-23NPP	Laurell technologies		For polyelectrolyte swelling