Tek Hücretranskripsiyonel Profillerini Analiz Etmek Için Lazer Yakalama Mikrodisseksive Mikroakışkan QPCR'nin Birleştirilmesi: Opioid Bağımlılığına Sistem Biyolojisi Yaklaşımı

Özet

Bu protokol, lazer yakalama mikrodisseksi kullanarak yüksek doğruluk ve anatomik özgüllük ile amigdala merkezi çekirdeğinden tek nöron, mikroglia ve astrosit toplamak için nasıl açıklar. Ayrıca, bu hücrelerin transkripsiyonu bir alt kümesini ölçmek için mikroakışkan RT-qPCR kullanımımızı açıklarız.

Özet

Anatomik olarak komşu tek hücrelerde derin transkripsiyonel heterojenlik, hücresel fenotip çeşitliliği ile sağlam doku işlevselliğinin sağlanabileceğini düşündürmektedir. Biyolojik sistemlerin ağ dinamiklerini araştıran tek hücreli deneyler, biyolojik olarak anlamlı çözünürlükte çeşitli koşullara hücresel ve doku tepkilerini göstermektedir. Burada, anatomik olarak belirli yerlerden tek hücre toplama ve gen ekspresyonu profillerinin bir alt kümesini doğru bir şekilde ölçme yöntemlerimizi açıklıyoruz. Lazer yakalama mikrodizsikimi (LCM) ile mikroakışkan ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonlarını (RT-qPCR) birleştiriyoruz. Ayrıca bağırsak içeriğinin mikrobiyal bolluğunu ölçmek için bu mikroakışkan RT-qPCR platformlarını kullanıyoruz.

Giriş

Tek hücrelerin gen ekspresyonu profillerinin ölçülmesi doku içinde kapsamlı henotibik heterojenite göstermiştir. Bu karmaşıklık doku fonksiyonlarını yöneten biyolojik ağları anlamamızı karmaşık hale getirmiştir. Grubumuz ve diğerleri birçok doku ve koşullarda bu fenomeni araştırdık^1,2,3,4,5,6. Bu deneyler sadece gen ekspresyonu ağlarının düzenlenmesinin bu tür heterojenliğin altında yattığını değil, aynı zamanda tek hücreli çözünürlüğün doku düzeyinde çözünürlüğün takdir edemediği doku fonksiyonunda bir karmaşıklığı ortaya koyduğunu da göstermektedir. Gerçekten de, hücrelerin sadece küçük bir azınlık belirli bir durum veya meydan yanıt verebilir, ancak genel fizyoloji si bu hücrelerin etkisi önemli olabilir. Ayrıca, birden fazla hücre tipi ve dokulardan gelen yüksek boyutlu veri kümelerine çok değişkenli yöntemler uygulayan bir sistem biyolojisi yaklaşımı, sistem genelinde ki tedavi etkilerini açıklayabilir.

Bu tür veri kümelerini elde etmek için LCM ve mikroakışkan RT-qPCR'ı birleştiriyoruz. Burada floresan aktive hücre sıralama (FACS) yoluyla tek hücre toplama ve transkripsiyon ölçmek için RNA sıralama (RNA-seq) kullanarak aksine bu yaklaşımı almak. LCM'nin FACS'a göre avantajı, tek hücrelerin kesin anatomik özgüllüğünün LCM ile nispeten ve kesinlikle belgelenebilmiş olmasıdır. Ayrıca, RNA-seq rt-qPCR, mikroakışkan RT-qPCR daha az pahalı ve daha yüksek bir duyarlılık ve özgüllük⁷sahip daha fazla özellikleri ölçebilir iken .

Bu temsili deneyde, opioid bağımlılığı ve naltrekson-çökelmiş opioid çekilmesinin sıçan nöronal, mikroglia ve astrosit gen ekspresyonu üzerindeki etkilerini araştırdık. Dört tedavi grubu analiz edildi: 1) Plasebo, 2) Morfin, 3) Naltrekson ve 4) Çekilme(Şekil 1). Opioid bağımlılığının gen ekspresyonunu önemli ölçüde değiştirmediğini, ancak opioid yoksunluğu özellikle Tnf olmak üzere inflamatuar genlerin ekspresyonunu tetiklediğini bulduk. Astrositler en çok etkilenen hücre tipiydi. Bağırsak mikrobiyomu derinden opioid çekilmesi tarafından bteroides oranı Firmicutes bir azalma ile belirtildiği gibi etkilenmiştir, hangi bağırsak dysbiosis kurulan bir belirteçtir^8,9.

Protokol

Bu çalışma Thomas Jefferson Üniversitesi ve Drexel Üniversitesi Tıp Fakültesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) önerileri doğrultusunda yapılmıştır. Protokol Thomas Jefferson Üniversitesi ve Drexel Üniversitesi Tıp Fakültesi IACUC tarafından onaylandı.

1. Hayvan modeli

1. Yetişkin erkek Sprague-Dawley sıçanlarında deri altı iki 75 mg yavaş salınımlı morfin sülfat pelet veya iki plasebo pelet takın.
   1. Küçük steril cerrahi için uygun bir elbise ve eldiven kullanın. Gerekirse makas ile sıçan dorsum tıraş.
   2. Hayvanın gözlerine veteriner merhemi uygulayın. Yaklaşık 20 s isofluran emdirme ile sıçan anestezi. Anestezi bilinç kaybı ile doğrulanır.
   3. Boncuk sterilize künt makas ile sıçan dorsum bir orta hat kesi yapmak ve boncuk sterilize sonda ile vücut duvarından dermis ayırın. Boncuk sterilize forceps ile dermis altında pelet yerleştirin. Kesi steril bir iğne ile kapatılmıştır.
      NOT: Tüm işlem sıçan başına yaklaşık 5 dakika sürer. Taze steril eldiven her sıçan için kullanılır.
   4. Ameliyat sonrası iyileşme için fareyi izolasyon kafesine yerleştirin. Kalp atışı ve düzenli solunum ritmi olup yok. Bilinç geri kazanılına kadar fareyi gözlemleyin. Ameliyat sonrası ağrıları değerlendirin.
   5. Sıçanları 8 saat ameliyat sonrası ve her 12 saat sonra iyileşme ve enfeksiyon için değerlendirin. Onlar tam olarak ameliyattan sonra, yaklaşık 24 saat sonra kurtarıldı zaman kohort geri kalanı ile bir kafese sıçan yerleştirin.
2. 6 gün morfin maruziyetini takiben G ve Çekilme kohortlarına intraperitoneal naltrekson enjeksiyonu (75 mg/kg) verin.
   NOT: Bu temsili deneyde dört fare kohortları vardı (Bkz. Şekil 1).

2. Örnek hasat

1. Pelet insanından 6 gün sonra veya naltrekson enjeksiyonundan sonra 24 saat sonra beyni hasat edin.
   1. Yaklaşık 30 s için bir isoflurane odasına hayvan yerleştirin veya bilinç kaybı meydana gelene kadar, hareket eksikliği ve solunum hızı azalmış gösterilir.
   2. Hızla hayvan ın kafasını kesmek için keskin bir giyotin kullanın.
   3. Beynini hayvanın kafatasından çıkar.
   4. Çıkarılan beyne aşağıdaki brüt kesileri yapmak için keskin bir el jilet kullanın: İlk olarak, beyincik kesi ve atın. İkincisi, beyin sapını ön beyinden enine bir kesi ile ayırın. Üçüncü olarak, hemisect forebrain ve / veya beyin sapı bir orta hat sagittal kesi ile.
   5. Ön beyin ve beyin sapını, kalıbın alt kısmında 3-4 cm Optimum Kesme Sıcaklığı bileşiği (OCT) içeren plastik bir doku gömme kalıbına yerleştirin. Numunenin geri kalanını OCT ile kaplayın.
   6. Hemen kuru buz ve metanol içeren bir banyo içine OCT ile kaplı örnek ile plastik doku gömme kalıp yerleştirin. Metanolün doku katıştırma kalıbına dökülmesine izin vermeyin. Doku toplama (~ 10-15 dk maksimum) bitene kadar metanol-buz banyosunda beyin örneği ile gömme kalıp tutun.
   7. Beyin örneğini mümkün olan en kısa sürede -80 °C'lik bir dondurucuya yerleştirin.
2. Bağırsak örneklerini aynı anda topla.
   1. Hızlı decapitation sonra, bir neşter ile hayvanın karnında bir orta hat kesi yapmak.
   2. Çekiyi bulun ve artan kolonla bağlantısını kes.
   3. Cecal içeriğini 15 mL konik bir tüpe sıkıştırın.
   4. Konik tüpü hemen kuru buzüzerine yerleştirin ve mümkün olan en kısa sürede -80 °C'lik bir dondurucuya koyun.
      NOT: İnce bağırsak içeriği de negatif kontrol ile aynı yöntemlerle toplanabilir.

3. Dilimleme

1. Bir kriyostat kullanarak hemisected sıçan ön beynini dilimleyin.
   1. -80 °C'lik dondurucudan ön beyinli plastik gömme kalıbını çıkarın ve -20 °C kriyostat'a yerleştirin.
   2. OkT gömülü hemisected ön beyin örneğini katıştırma kalıbından çıkarın. Gerekirse plastik gömme kalıbının köşelerini dikey olarak dilimlemek için bir jilet kullanın. EKIM kullanarak bir kriyostat chuck üzerinde kaudal koronal dilimleme rostral için ön beyin Monte.
      NOT: CeA'yı tanımlamak için anatomik işaretler optik sistem ve stria terminalis(Şekil 2B)içerir. Optik kiazma optik sistem dalları ve beyin kaudal rostral dilimlenmiş olarak dorsal-lateral izler. Optik sistem bir sıçan beyin atlas bregma -2.12 mm¹⁰görülen benzer bir morfolojiye sahip olduğunda, test dilimleri bir mikroskop altında görülebilir. Optik sistem ve stria terminalis morfolojisi bregma ve CeA stria terminalleri çevreleyen olup olmadığını belirlemek için bir sıçan beyin^{atlası 10} kontrol edilebilir.
   3. CeA içeren bölümlere ulaşılıncaya kadar hemisected ön beyin rostral'den kaudal kesitlerden 10 μm kalınlığında koronal kesitler.
      NOT: Bölümlerin genişliği ve yüksekliği yaklaşık 200 mm'dir.
   4. Düz cam slaytlar üzerine 10 μm kesitleri eriterek CeA veya tercih edilen beyin bölgesini içeren 10 μm'lik bölümleri toplayın. Cam slaytları hemen kuru buz üzerinde kalan metal bir tavaya yerleştirin. Beyin kesitli slaytları mümkün olan en kısa sürede -80 °C'lik bir dondurucuya koyun.
      NOT: Aynı slayta birden fazla dilim yerleştirilebilir. Aynı slayttaki dilimler için farklı bir hücre tipi leke kullanıyorsanız, dilimler arasında yaklaşık 100 mm bırakın, böylece bir hidrofobik kalem slayttaki hücre tipine özgü antikor çözümlerini ayırmak için kullanılabilir. Dilimin her iki tarafında salının kenarından yaklaşık 20 mm bırakın.

4. İmmünofluoresan boyama

1. İmmünfloresans kullanarak beyin hücresi (örn. nöron, mikroglia, astrosit vb.) için ön beyin bölümlerini lekeleyin.
   1. -80 °C'lik dondurucudan CeA'nın 10 μm'lik kesitli bir veya daha fazla kaydırağı çıkarın.
   2. Slaytları 30 s. Fazla sıvıyı çıkarın% 75 etanol ile düzeltin.
   3. Dilimleri %2 büyükbaş serum antijeni (BSA) ile 1x fosfat tampon salininde (PBS) 30 s'lik olarak bloke edin. PBS ile 1x yıkayın.
   4. 2 dk. %2 BSA çözeltisi ile 1x yıkayın için slayta birincil antikor çözeltisi ekleyin.
      NOT: Primer antikor çözeltisi % 2 primer antikor, %1 RNase Out ve yukarıdaki engelleme adımı için aynı BSA PBS çözeltisinin %96'sı (adım 4.1.3) oluşur. Temsili deneyde aşağıdaki miktarlarda bir anti-NeuN antikor, bir anti-Cd11β antikor ve bir anti-GFAP antikor kullanılmıştır: 3 μL primer, 1.88 μL RNA inhibitörü ve 145.12 μL BSA çözeltisi.
   5. 3 dk. PBS ile 1x yıkayın için slayt ikincil antikor çözeltisi ekleyin.
      NOT: Sekonder antikor çözeltisi 1 μL keçi anti-mouse 488 nm floresan etiketi (1:500), 2.5 μL RNA inhibitörü, 1.3 μL DAPI (1:10.000) ve 196.5 μL 2% BSA oluşur.

5. Etanol ve ksilen dehidratasyon serisi

1. 30 s. Hemen sonra% 75 etanol içine slaytlar daldırma, 30 s. Hemen sonra% 95 etanol slaytlar daldırma, 30 s. Hemen sonra% 100 etanol içine slaytlar daldırma, 30 s için% 100 etanol içeren ikinci bir kap içine slaytlar daldırma.
2. Etanol dehidratasyon serisini takiben, slaytları taze dökülmüş ksilene 1 dk. Hemen sonra, slaytları 4 dk boyunca ikinci bir ksilene kabına batırın.
3. Ksilen banyosundan slaytları çıkarın ve 5 dakika boyunca karanlıkta havanın kurumasını bekleyin.
4. Slaytları 5 dk daha fazla kuruması için bir kurutucuya yerleştirin.

6. Lazer yakalama mikrodisseksi

1. Eğer lekeli, mikroskop içine slayt yerleştirin ve anatomik yerler (yani, optik kiasm ve stria terminalis) kullanarak ilgi bölgesi (CeA) bulmak.
2. Lekeli hücre tipini ve çekirdeğini ilgi bölgesindeki tanımlamak için floresan kullanın. Tek hücreli havuzlu örnekleri yapıyorsanız bir hücre veya birden çok hücre seçin. LCM yazılımını kullanarak ilgi hücrelerini işaretleyin.
3. LCM kapağını dilimin üzerine ilgi çeken bölgeye yerleştirin.
4. Ir lazer gücünü, boyutunu ve süresini ayarlamak için kızılötesi (IR) lazerin test çekimlerini kullanın, böylece LCM kapak yapıştırıcısı yalnızca seçilen tek hücrenin alanı üzerinde erir. Bu, seçilen hücreler dışında başka hücre toplanmamasını sağlar.
   NOT: Bu temsili deneyde, aynı tedavi ile örnekler arasında gen ekspresyonundaki hücre-hücre değişkenliğini sınırlamak için tek bir örnek lem olarak aynı hücre tipinde 10 hücre havuzu kullanılmıştır. Ancak, bu yöntem gerçek tek hücre deneyleri için kullanılabilir^1,3.
5. LCM yazılım araçlarını kullanarak analiz için toplanacak hücreleri seçin(Şekil 2C). Seçilen hücreler sıçan beyin atlası ve bregma¹⁰dayalı CeA anatomik alanda olmalıdır (veya tercih edilen beyin bölgesi). Hücreler bitişik lekeli çekirdeklerden en az 3 μm olmalıdır.
6. Tanımlanan tek hücreleri toplamak için IR lazer ateş.
7. Kapağı kalite kontrol (QC) istasyonuna yerleştirin ve yalnızca istenilen hücrelerin seçildiğinden emin olmak için kapağı görüntüleyin. Diğer hücreler yanlışlıkla seçilirse, kapak QC istasyonunda kalırken istenmeyen hücreleri yok etmek için ultraviyole lazer kullanılabilir.
8. Anatomik özgüllüğünü belgelemek için hücrenin toplandığı doku bölümünün fotoğrafını çekin. Bir referans¹⁰olarak bir sıçan beyin atlası kullanarak uygunsa bregma gelen dilimin mesafekaydedin.
9. LCM kapağını QC istasyonundan çıkarın, numune çıkarma cihazını ve pipet 5,5 μL likte arabelleği numunenin üzerine takın.
   NOT: Lysis tampon çözeltisi 0.5 μL lysis arttırıcı ve 5 μL resuspension tamponundan oluşur.
10. ExtracSure cihazını 0,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve 75 °C'de 15 dakika boyunca bir ocak tabağına yerleştirin.
11. Numuneyi ve lisis tamponu düşük hızda (0,01-0,02 x g)30 s'ye aşağı doğru çevirin ve toplanan numuneyi -80 °C'lik bir dondurucuya yerleştirin.

7. Tek hücreli mikroakışkan RT-qPCR

1. 96.96 Dinamik Dizme Yongası için tek hücreli mRNA preamplifikasyonu
   1. Preamplifikasyon için bir astar havuzunda (her astar 500 nM konsantrasyonu) denentüm genler için ileri ve geri mRNA qPCR gen astarlarını birleştirin. Örneğin, 80 μL artı 120 μL DNA Süspansiyon Tamponunda 1 000°L'lik 100 m'lik astar.
      NOT: Temsili deney için kullanılan astar dizileri O'Sullivan ve ark.^4'tebulunabilir.
   2. Yeni bir 96 x 96 PCR plaka, her kuyuya 1 μL 5x VILO ekleyin.
   3. -80 °C'de depolanan numunelerden LCM tek hücreli numuneleri çıkarın, kısa bir süre çözülsün, düşük hızda (0,01-0,02 x g)kısa bir süre santrifüj edin ve pcr plakasına 5,5 μL'lik tek hücreli numune ekleyin. Her örnek kendi kuyuya eklenir.
   4. PCR plakasını numunelerle birlikte termocycler'a yerleştirin ve 65 °C'de 1,5 dk. Plakayı 1 dk 4 °C'de 1 dk x g'de döndürün ve plakayı buzüzerine yerleştirin.
   5. Her kuyuya 0,15 μL 10x cDNA sentezi ana karışımı, 0,12 μL T4 Gen 32 protein ve 0,73 μL DNA süspansiyon tamponu ekleyin.
   6. PCR plakayı termocycler'a yerleştirin ve aşağıdaki protokolü uygulayın: 5 dk için 25 °C, 30 dk için 50 °C, 25 dk için 55 °C, 5 dk için 60 °C, 10 dk için 70 °C, bitişe kadar 4 °C.
   7. Her kuyuya 7,5 μL Taq polimeraz ana karışımı ekleyin.
   8. Her kuyuya 1,5 μL astar havuzu (yukarıya bakın) ekleyin.
   9. PCR plakayı termocycler'a yerleştirin ve aşağıdaki ön amplifikasyon protokolünü çalıştırın: 10 dk için 95 °C, ardından 5 sn için 96 °C 22 devir, 4 dk için 60 °C.
   10. Her kuyuya 0,6 μL ekoneksikle I reaksiyon tamponu 10x, 1.2 μL ekonükleaz I ve 4.2 μL DNA süspansiyon tamponu ekleyin.
   11. PCR plakayı termocycler'a yerleştirin ve aşağıdaki protokolü uygulayın: 30 dk için 37 °C, 15 dakika boyunca 80 °C.
   12. Her kuyuya 54 μL TE tamponu ekleyin. PCR plakasını 5 dk. Mağaza'da 1.300 x g. 4 °C'de döndürün. Bir sonraki adım için 12 saatten fazla bekliyorsanız -20 °C'de saklayın.
2. Örnek plakayı 96.96 Dinamik Dizi Çipi için hazırlayın.
   1. Yeni bir 96 iyi PCR plaka, her kuyuya 0,45 μL 20x DNA bağlayıcı boya ve 4,55 μL düşük ROX mastermix ekleyin.
   2. Her kuyuya 3 μL önceden güçlendirilmiş numune ekleyin, PCR plakayı 1.300 x g'dadöndürün, sonra plakayı buza koyun.
3. 96.96 Dinamik Dizi Çipi için bir asayasyon plakası hazırlayın.
   1. Yeni bir 96 iyi PCR plaka, her kuyuya 3,75 μL 2x GE istret reaktifi ve 1,25 μL DNA süspansiyon tamponu ekleyin.
   2. Her biri iyi karşılık gelen 10 μM qPCR astar 2,5 μL ekleyin. PCR plakayı 1.300 x g'de 5 dk çevirin.
4. 96.96 Dinamik Dizi Yongasını yükleyin ve çalıştırın.
   1. Çipi kontrol hattı sıvısıyla başedin.
   2. Çipi IFC Denetleyici HX'e yerleştirin ve Prime (136X) komut dosyasını çalıştırın.
   3. PCR numune plakasından numunenin 6 μL'sini 96.96 Dinamik Dizme Yongasındaki ilgili numune kuyularına ekleyin.
   4. PCR test plakasından alınan numunenin 6 μL'sini 96,96 Dinamik Dizi Yongasındaki ilgili test kuyularına ekleyin.
   5. 96.96 Dinamik Dizi Chip kuyularında herhangi bir hava kabarcıkları pop iğneler kullanın.
   6. 96.96 Dinamik Dizi Yongasını IFC Denetleyici HX'e yerleştirin ve Load Mix (136x) komut dosyasını çalıştırın.
   7. Çipi IFC Controller HX'ten çıkarın, koruyucu etiketi çıkarın ve 96.96 Dinamik Dizi Yongasını mikroakışkan RT-qPCR platformuna yerleştirin. GE Fast 96 x 96 PCR protokolünü (30 döngü) çalıştırın.
      NOT: Sonuçların RNA kalitesi ve geçerliliği jel elektroforez, erime sıcaklık eğrileri, numune ve tahkikat çoğaltmaları ve standart seyreltme serisi çizimler yoluyla taht doğrulama dahil olmak üzere birden fazla yöntemle değerlendirilir. Ayrıca transkripsiyonel bulgular, Batı lekeve immünoforesans tahlilleri de dahil olmak üzere beyin hemiseksiyonu üzerinde bağımsız yöntemlerle doğrulanabilir.

8. Mikroakışkan RT-qPCR ile bakteri bolluğunun ölçülmesi

1. Dışkı DNA çıkarma kiti nin yönergelerini izleyerek bakteri DNA'sını ayıklayın.
2. QPCR kullanarak bakteriyel DNA konsantrasyonu tahmin edin.
3. Çıkarılan bakteriDNA'sını yeni bir PCR plakasına ekleyin. 1 μL çıkarılan bakteri DNA'sı ve 9 μL DNA Süspansiyon tamponu ekleyin.
4. 48.48 Dinamik Dizme Yongası için bir adak plakası hazırlayın (bkz. 7.2.1-7.2.2 adımları)
5. Örnek plakayı 48.48 Dinamik Dizme Yongası için hazırlayın (bkz. 7.3.1-7.3.2 adımları)
   1. Yeni bir 96 iyi PCR plaka, 0.45 μL 20x DNA bağlayıcı boya ve 4.55 μL düşük ROX mastermix 48 kuyuekleyin.
   2. 48 kuyuya bakteri DNA'sını içeren PCR plakasından 3 μL numune ekleyin ve PCR plakasını 5 dk. 4 °C'de 1.300 x g'de aşağı doğru döndürün.
6. 48.48 Dinamik Dizi Yongasını yükleyin ve çalıştırın (bkz. 7.4.1-7.4.7 adımları).

Sonuçlar

Tek hücrelerin seçimi hem görsel hem de moleküler olarak doğrulandı. Hücre toplamadan önce hücresel morfoloji sigörüldü. Toplanan hücreler daha sonra QC istasyonunda görüntülendi ve hücresel çekirdek lekesi (DAPI) tek hücre seçim işareti floresanile çakıştı. Şekil 2A, CeA içeren hemisected sıçan ön beyni olan bir slaytın temsili görüntülerini gösterir. Sonraki görüntüler(Şekil 2

Tartışmalar

Tek hücreli biyoloji hücresel fenotiplerin heterojenliğini ve doku fonksiyonunun sağlamlığını göstermiştir. Bu bulgular, biyolojik sistemlerin hem makro hem de mikro ölçeklerde organizasyonu hakkında bilgi verilmiştir. Burada, anatomik özgüllük ve transkripsiyonel doğruluk sağlayan tek hücreli transkripsiyonme ölçüleri elde etmek için iki yöntem, LCM ve mikroakışkan qPCR kombinasyonunu açıklıyoruz(Şekil 1). Grubumuz bir sistem biyolojisi yaklaşımı alır ve g...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
20X DNA Binding Dye	Fluidigm	100-7609	NA
2x GE Assay Loading Reagent	Fluidigm	85000802-R	NA
48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression	Fluidigm	BMK-M-48.48	NA
96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression	Fluidigm	BMK-M-96.96	NA
Anti-Cd11β Antibody	Genway Biotech	CCEC48	Microglia Stain
Anti-NeuN Antibody, clone A60	EMD Millipore	MAB377	Neuronal Stain
ArcturusXT Laser Capture Microdissection System	Arcturus	NA	NA
Biomark HD	Fluidigm	NA	RT-qPCR platform
Bovine Serum Antigen	Sigma-Aldrich	B4287
CapSure Macro LCM Caps	ThermoFisher Scientific	LCM0211	NA
CellDirect One-Step qRT-PCR Kit	ThermoFisher Scientific	11753500	Lysis buffer solution components
DAPI	ThermoFisher Scientific	62248	Nucleus Stain
DNA Suspension Buffer	TEKnova	T0221
Exonuclease I	New Englnad BioLabs, Inc.	M0293S	NA
ExtracSure Sample Extraction Device	ThermoFisher Scientific	LCM0208	NA
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	ThermoFisher Scientific	22-037-246	Plain glass slides
GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube	ThermoFisher Scientific	N8010611
GFAP Monoclonal Antibody	ThermoFisher Scientific	A-21294	Astrocyte Stain
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal™ Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A28175	Seconadry Antibody
IFC Controller	Fluidigm	NA	NA
RNaseOut	ThermoFisher Scientific	10777019
SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox	Bio-Rad	PN 172-5211	Rox master mix
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit	ThermoFisher Scientific	11754250	Contains VILO and SuperScript
T4 Gene 32 Protein	New Englnad BioLabs, Inc.	M0300S	NA
TaqMan PreAmp Master Mix	ThermoFisher Scientific	4391128	NA
TE Buffer	TEKnova	T0225	NA