JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Açıklanan yaklaşım, akciğerlerdeki metastaz sayısı ve boyutunun ölçülmesine ek olarak meme kanseri metastazı oluşumunun ve büyümesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak sağlamak için deneysel kuyruk ven metastazı tahlillerini in vivo canlı hayvan görüntülemeile birleştirir.

Özet

Metastaz kansere bağlı ölümlerin ana nedenidir ve metastatik hastalığı olan hastalar için sınırlı tedavi seçenekleri vardır. Metastatik hastalık için daha iyi tedavilerin geliştirilmesini kolaylaştıracak yeni tedavi hedeflerinin tanımlanması ve test edilmesi, in vivo modellerinde preklinik preklinik gerektirir. Burada gösterilen meme kanseri metastatik kolonizasyon ve sonraki büyüme atamak için bir syngeneic fare modelidir. Metastatik kanser hücreleri, ateş böceği luciferase ve ZsGreen proteinlerini kodlayan viral vektörlerle şantiye edilir. Aday genler daha sonra koably luciferase / ZsGreen ifade kanser hücrelerinde manipüle edilir ve daha sonra hücreler metastatik kolonizasyon ve büyüme saymak için lateral kuyruk damarı ile fareleriçine enjekte edilir. Bir in vivo görüntüleme cihazı daha sonra zaman içinde metastatik yük değişiklikleri ölçmek için canlı hayvanlarda tümör hücrelerinin biyolüminesans veya floresan ölçmek için kullanılır. Floresan proteinin ekspresyonu, deney sonunda kesit veya histolojik boyama ya da metastaz gerekkalmadan akciğerlerdeki metastazların sayısının ve boyutunun ölçülmesine olanak tanır. Bu yaklaşım, metastatik kolonizasyon ve büyüme aday genlerin rolünü test etmek için nispeten hızlı ve kolay bir yol sunuyor, ve geleneksel kuyruk ven metastazı tahlilleri çok daha fazla bilgi sağlar. Bu yaklaşımı kullanarak, meme kanseri hücrelerinde PDZ bağlayıcı motifli (TAZ) ile Evet ilişkili protein (YAP) ve transkripsiyonel koaktivatörün aynı anda yıkılması nın akciğerlerde metastatik yükün azalmasına yol açtığını ve bu azaltılmış yükün metastatik kolonizasyonun ve metastazların büyümesinin azalmasısonucu olduğunu göstermektedir.

Giriş

Kanser ölüm dünya çapında ikinci önde gelen nedeni olmaya devam etmektedir1 ve metastaz bu ölümlerin çoğunluğu sorumludur2,3. Ancak, metastatik kolonizasyon ve sonraki büyüme yöneten moleküler mekanizmaların sınırlı bir anlayış metastatik hastalık için etkili tedavilerin gelişimini engellemiştir. Yeni terapötik hedeflerin belirlenmesi, bir aday genin metastaz oluşumunu ve büyümesini nasıl etkilediğini test etmek için bir test gerektirir. Otokton fare modellerinin avantajları olsa da, zaman alıcı dır ve oluşturmak pahalıdır, bu da onları hedef bulma yerine hedef doğrulama için daha uygun hale getirir. Aday genin kanser hücrelerinde in vitro olarak tedirgin olduğu ve metastatik potansiyel üzerindeki etkilerinin in vivo olarak değerlendirildiği nakil modeli sistemleri, otokton modellere göre daha ucuz ve daha yüksek iş âldeki sistemlerdir. Buna ek olarak, RNAi, CRISPR/CAS9 ve transgenlerin istikrarlı teslimatı için viral vektörler yaygın olarak mevcuttur, bu da kanser hücresi hatlarında ilgi çeken hemen hemen her geni veya geni tedirgin etmeyi nispeten kolaylaştırır. Bu yaklaşım aynı zamanda insan kanser hücresi hatlarında metastatik kolonizasyon ve büyüme de immünozveya insanlaşmış fareler içine hücreleri naklederek aday genlerin rolünü titretmek için kullanılabilir.

Nakledilen kanser hücrelerinin in vivo tarafından metastaz oluşumunu test etmek için kullanılan iki tip tahlilssi spontan metastaz tahlilleri ve deneysel metastaz tahlilleridir. Spontan metastaz tahlillerinde4,5, kanser hücreleri farelere enjekte edilir, primer tümör oluşturmasına izin verilir, ve daha sonra spontan metastaz oluşumu ve sonraki büyüme tahlil edilir. Bu modelin gücü hücrelerin metastatik tümörler oluşturmak için metastatik sürecin tüm adımlarını tamamlamak gerekir. Ancak, birçok kanser hücre hatları spontan metastaz modellerinde verimli metastaz yok, ve primer tümör büyümesini etkileyen hücrelerin herhangi bir manipülasyon metastaz tahsin sonuçlarını şaşırtmak olabilir. Kanser hücrelerinin doğrudan dolaşıma enjekte edildiği deneysel metastaz tahlilleri bu tuzakları önlemek için kullanılır. Yaygın deneysel metastaz tahlilleri kuyruk ven enjeksiyonuiçerir 6,7,8 (ve burada gösterilmiştir), intrakardiyak enjeksiyon9, ve portal venenjeksiyonu 10.

Burada sunulan protokolün amacı, bir araştırmacının metastaz oluşumunu ve büyümesini gerçek zamanlı olarak izlemesine olanak tanıyan in vivo deneysel metastaz testi sağlamak ve aynı farenin akciğerlerindeki nokta metastaz sayısını ve boyutunu ölçmektir. Bunu başarmak için, geleneksel deneysel kuyruk ven metastaz tahlilleri6,7,8 canlı hayvan görüntüleme ile birleştirilir, in vivo görüntüleme cihazı kullanarak9,11,12,13,14. Hem luciferase hem de floresan proteini ifade eden tümör hücreleri lateral kuyruk damarı ile farelere enjekte edilir ve daha sonra in vivo görüntüleme cihazı zamanla akciğerlerdeki metastatik yükteki değişiklikleri ölçmek için kullanılır(Şekil 1). Ancak, in vivo canlı hayvan görüntüleme cihazı ayırt edemez veya bireysel metastaz boyutunu ölçmek. Bu nedenle, deney sonunda, bir floresan stereomikroskop sayısını saymak ve kesit ve histoloji veya immünohistokimya gerek kalmadan akciğerlerde floresan metastaz boyutunu ölçmek için kullanılır(Şekil 1). Bu protokol, aday genin ekspresyonunun veya işlevinin değiştirilmesinin metastaz oluşumunu ve büyümeyi nasıl etkilediğini test etmek için kullanılabilir. Küçük moleküller veya fonksiyon bloke antikorlar gibi potansiyel terapötik bileşikler de test edilebilir.

Bu yaklaşımı göstermek için, ilk olarak metastatik fare meme kanseri hücrelerinde temel replikasyon faktörü olan replikasyon proteini A3'ün (RPA3) yıkıldığı kavram deneyinin bir kanıtını gerçekleştirdik. RPA3 nakavt hücreleri enjekte edilen farelerin kontrol hücreleri ile enjekte edilen farelere kıyasla her zaman önemli ölçüde daha az metastatik yüke sahip olduğunu gösteriyoruz. Metastaz içeren akciğerlerin analizi, bu azalan metastatik yükün metastatik kolonizasyonun önemli ölçüde azalması ve oluşan metastazların büyüme bozukluğunun bir sonucu olduğunu göstermektedir. Bu tekniği daha da göstermek için, EVET ilişkili proteinin (YAP) ve transkripsiyonel koaktivatörün PDZ bağlayıcı motifli (TAZ) aynı anda yıkılması metastatik kolonizasyonu mu yoksa sonraki büyümeyi mi bozduğunu test ettik. YAP ve TAZ, Hippo Pathway'in kritik downstream efektörleri olan iki ilgili transkripsiyonel ko-aktivatörlerdir. Biz15,16 ve diğerleri metastaz YAP ve TAZ karıştığı var(17içinde gözden ,18,19),Bu proteinleriyi tedavi hedefleri olduğunu düşündüren. Sürekli olarak, YAP/TAZ nakavt hücrelerine enjekte edilen farelerin metastatik yükü önemli ölçüde azalttığını gördük. Akciğerlerin analizi YAP/TAZ knockdown hücrelerinin çok daha az metastaz oluşturduğunu ve oluşan metastazların daha küçük olduğunu gösterdi. Bu deneyler, deneysel metastaz tahlillerinin bir araştırmacının metastaz oluşumu ve büyümesinde aday genin rolünü hızlı ve ucuz bir şekilde test etmesine nasıl olanak sağladığını göstermektedir. Ayrıca canlı hayvan görüntüleme ve tüm akciğerlerde metastaz floresan nicel kombine kullanımı nın araştırmacının metastatik kolonizasyon sırasındaki adımları daha iyi anlamasına nasıl olanak sağladığını göstermektedir.

Protokol

Bu protokol farelerin ve biyolojik tehlikeli maddelerin kullanımını içerir ve ilgili kurumsal güvenlik komitelerinin onayını gerektirir. Burada açıklanan tüm in vivo çalışma Albany Tıp Koleji kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

NOT: Protokole genel bakış için Şekil 1'dekişema'ya bakın.

1. Gerekli tüm retrovirüslerin ve lentivirüslerin paketlenmesi

NOT: Açıklanan protokol, bir luciferase enzimini ve floresan proteini stably ifade etmek ve aday genin ekspresyonunu manipüle etmek için lentiviral veya retroviral vektörler kullanır. Bu virüsler aşağıda açıklandığı gibi HEK-293FT hücrelerde paketlenir.

  1. 1. Gün: Tam büyüme ortamının 2 mL'lik 6 kuyulu plakalı plakalı HEK-293FT hücreleri (DMEM'de %10 FBS, %1 penisilin/streptomisin ve 2 mM L-Glutamin) böylece 2. 37 °C'de kuluçka, bir gecede %5 CO2.
  2. 2. Gün: Her viral vektörün paketlenmesi için, retroviral veya lentiviral vektör ve viral kat ve ambalaj proteinlerini kodlayan uygun vektörler ile HEK-293FT hücrelerin %40-60'lık bir konfluent kuyusunu transfect.
    NOT: Bu protokolde kat proteini olarak VSVG, lentiviral ambalaj için psPAX2 ve retroviral ambalajlar için gag-pol kullanılır (vektör listesi için Ek Tablo 1'e bakınız).
  3. Aşağıdaki gibi her biri için bir co-transfection karışımı olun:
    1. Transfeksiyonlar için 4 μL lipid çözeltisini (Bkz. Malzeme Tablosu)ve 96 μL transfeksiyon tamponu ve kuluçka 5 dakika boyunca birleştirin.
    2. 1 μg viral vektör, 0,5 g kat protein vektörü (VSVG) ve 0,5 g ambalaj protein vektörü (psPAX2 veya gag-pol) ekleyin ve 20 dakika kuluçkaya yatırın.
    3. 1.3.2 adımdan itibaren co-transfection karışımını adım 1.1'de kaplanmış HEK-293FT hücrelere hafifçe ekleyin ve bir gecede %5 CO2 ile 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
  4. 3. Gün: Transfeksiyon içeren medyayı her kuyudan çıkarın ve her kuyuya 2 mL'lik tam büyüme ortamı ekleyin. 37 °C'de kuluçka, yaklaşık 24 saat boyunca %5 CO2.
  5. 4. Gün: 3 mL şırınga kullanarak her kuyudan viral süpernatant toplayın ve 0,45 μm'lik bir filtreden 2 mL mikrosantrifüj tüpüne filtre uygulayın.
  6. İsteğe bağlı: İkinci bir virüs grubu isteniyorsa, her kuyuya 2 mL tam büyüme ortamı ekleyin ve yaklaşık 24 saat boyunca %5 CO2,% 5'te 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
  7. Gün 5 (İsteğe bağlı): adım 1.5 gibi viral supernatant ikinci bir tur toplamak.
    NOT: Protokol viral supernatant dondurularak duraklatılmış olabilir.

2. Kanser hücrelerinin oluşumu luciferase ve floresan proteini ifade

NOT: Aşağıdaki protokol, 4T1 hücrelerini ilk olarak ateş böceği luciferase ve floresan protein (ZsGreen) ile benzersiz seçim genlerine sahip iki vektör kullanarak nasıl etiketlenerebildiğini açıklamaktadır. Daha sonra bir aday genin ekspresyonunu manipüle etmek için 3.viral vektör kullanılır. Ancak, aynı anda bir floresan protein ve genetik manipülasyon teslim viral vektörler de alternatif olarak kullanılabilir (aşağıdaki temsili deneylerde olduğu gibi). Diğer kanser hücreleri kullanılabilir, ancak hücre numaraları adımlar 2.1 ve 2.7.1 için optimize edilmelidir.

  1. Plaka 4T1 hücreleri 1.5 x 105 hücreleri / iyi tam büyüme medya 12-iyi plaka (1% penisilin / streptomisin ile DMEM% 10 FBS ve 2 mM L-Glutamin) ve kuluçka 37 °C, 5% CO2 gecede.
  2. 4T1 hücrelerini aşağıdaki gibi adım 1'de üretilen viral supernatant ile enfekte edin.
    1. Hücrelerden büyüme ortamını aspire edin ve 500 μL luciferase viral supernatant ve 500 μL floresan protein viral supernatant ekleyin aynı anda hem luciferase ve floresan protein viral supernatants ile hücreleri enfekte.
    2. 8 mg/mL hekaksimethrine bromür 1 μL ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu).
    3. Hücreleri 37 °C'de , %5 ila %75-90 oranında (genellikle 24-48 saat) kuluçkaya yatırın.
  3. 4T1 hücrelerini 500 μL trypsin ile 2-5 dakika trypinlayın (hücreler kuyunun alt kısmında serbestçe durulanmalıdır). Tüm hücreleri 4 mL'lik seçim ortamında (uygun antibiyotikleri içeren komple büyüme ortamı) 6 cm'lik bir tabağa aktarın ve bu da tripsinin söndürülmesini sağlar. Aynı seçim ortamlarında 6 cm'lik enfekte olmayan kontrol hücrelerini kaplayın.
    NOT: Uygun antibiyotik konsantrasyonu birkaç doz test edilerek önceden belirlenmelidir. Ayrıca, floresan aktive hücre sıralama da ilaç seçimi yerine floresan etiketli hücreleri seçmek için kullanılabilir.
  4. Hücreleri 37 °C,% 5 CO2 seçim ortamlarında kuluçka ve tüm enfekte olmayan kontrol hücreleri ölü kadar gerektiğinde hücreleri bölmek (seçim geni ve hücre hattı na bağlı).
  5. Enfekte 4T1 hücreleri yeşil bir uyarma (450-490 nm)/emisyon (500-550 nm) filtre 50-100x büyütme bir ters floresan mikroskop üzerinde ayarlanmış kullanarak ZsGreen floresan protein ifade olduğunu onaylayın.
  6. Enfekte 4T1 hücrelerinin aşağıdaki gibi ticari olarak kullanılabilen luciferase aktivite kiti ni kullanarak luciferase ifade ettiğini doğrulayın.
    1. Luciferase ifade eden 4T1 hücrelerini lyse ve luciferase ifade etmez 4T1 hücreleri kontrol etmek için 1x pasif lysis tampon minimal hacim kullanın, yavaşça 30 dakika sallayarak.
    2. Beyaz alt 96-iyi plaka ya da luciferase aktivite kitinden luciferase asay reaktifinin 50 μL'sini ekleyin.
    3. Parlaklık ayarını kullanarak spektrumdaki tüm dalga boylarındaki hücrelerden gelen Parlaklığı ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın.
      NOT: Protokol, stably-transduced hücreleri dondurarak duraklatılmış olabilir.
  7. Aday genin ifadesini aşağıdaki gibi manipüle edin:
    1. Plaka 6 x 105, tam büyüme ortamının 4 mL'inde 60 mm'lik bir çanak üzerinde adım 2.6'dan 4T1 hücreleri etiketlenmiş ve 37 °C,%5 CO2 gecede kuluçkaya yatırılır.
    2. Her kuyudan büyüme ortamını aspire edin ve 4 μL 8 mg/mL heksadimethrine bromür içeren 2 mL tam büyüme ortamı ekleyin.
    3. Adım 1'den 2.7.2'den kaplanmış hücrelere 2 mL viral süpernatant ekleyin ve bir gecede %5 CO2'de 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
    4. 4T1 hücrelerini 500 μL trypsin ile 2-5 dakika trypinlayın (hücreler kuyunun alt kısmında serbestçe durulanmalıdır). Tüm hücreleri 10 mL'lik seçim ortamında (uygun antibiyotikleri içeren komple büyüme ortamı) 10 cm'lik bir tabağa aktarın ve bu da tripsinin söndürülmesini sağlar. Aynı seçim ortamlarında 4T1 hücreleri etiketli bazı enfekte olmayan kontrol plakası.
    5. Hücreleri 37 °C,%5 CO2'de seçim ortamlarında kuluçkaya yatırın ve enfekte olmayan tüm hücreler ölünceye kadar gerektiğinde hücreleri bölün.
    6. Aday genin ekspresyonunun western blot20 veya qPCR21gibi standart bir yaklaşımla değiştirildiğini doğrulayın.
    7. 2.5-2.6 adımlarında olduğu gibi parlaklık ve floresanları kontrol ve devirme hücrelerinde ne kadar benzer olduklarını belirlemek için, bu değişebildiği için parlaklık ve floresanlığı belirleyin (bkz. Tartışma).
      NOT: Protokol, stably-transduced hücreleri dondurarak duraklatılmış olabilir.

3. In vivo deneysel tasarımın optimizasyonu

  1. İstenilen metastatik yük için uygun hücre numarasını ve deneme süresini aşağıdaki gibi optimize edin.
    1. Aşırı hücreler enjeksiyon istenilen gün kullanılabilir böylece tam büyüme medya adım 2.6 floresan ve biyolüminesans 4T1 hücreleri genişletin.
    2. Adım 4.2'de açıklandığı gibi kuyruk damar enjeksiyonları için hücreleri hazırlayın. Enjeksiyonlar için en uygun hücre numarasını belirlemek için, 100 μL 1x PBS'de birkaç farklı konsantrasyonda hücreleri yeniden askıya alın.
      NOT: 25.000 ile 500.000 arasında bir dizi hücre numarası/fareyi test etmenizi öneririz.
    3. İğne yenene kadar hücre süspansiyonlarını buzda tutun.
    4. Adım 4.3'te açıklanan lateral kuyruk damarı aracılığıyla adım 3.1.2'den 3-4 fareye 4T1 hücrelerinin her seyreltmesini enjekte edin (aşağıya bakın).
    5. Tam bir iyileşme sağlamak için fareyi kafesine ve monitöre 15 dakika döndürün. Fareler ağrı veya sıkıntı 3x haftalık belirtileri için kontrol edilmelidir.
    6. In vivo canlı hayvan görüntüleme cihazı kullanarak 3-6 hafta boyunca metastaz oluşumu ve büyüme için fareleri izleyin (bkz. 5 ve 6. adımlar).
      1. Standart kurumsal kurallara göre kuyruk damar enjeksiyonundan 3-6 hafta sonra farelere ötenazi.
      2. Akciğerleri hazırlayın ve 7.
      3. Metastazların istenilen metastatik yük için büyümesi için uygun süreyi seçin (tartışmaya bakın).

4. Etiketli kanser hücrelerinin kuyruk ven enjeksiyonu

NOT: Adım 4.2.4 sinjenik BALB/c farelerde büyüyen 4T1 hücreleri için optimize edilmiştir. Diğer kanser hücresi hatları ve fare suşları kullanılırsa, enjekte edilen hücre sayısı ve töz uzunluğu öncelikle optimize edilmelidir.

  1. Enjeksiyon gününde fazla hücrelerin kullanılabilmesi için tam büyüme medyasında iki 15 cm'lik tabaklarda adım 2'de oluşturulan 4T1 hücre hatlarını genişletin.
  2. Aşağıdaki gibi kuyruk ven enjeksiyonu için hücreleri hazırlayın:
    1. Ortamı aspire edin ve hücre plakalarını 1x PBS ile durula.
    2. Hücreleri 15 cm'lik tabak başına 5 mL trypsin ile 2-5 dakika boyunca trypin ile tarar (hücreler kuyunun alt kısmında serbestçe durulanmalıdır). Tüm hücreleri konik bir tüpe aktarın. Tripsini söndürmek ve aynı konik tüpe yıkama eklemek için yeterli tam büyüme ortamı ile doku kültürü çanak kalan hücreleri yıkayın.
    3. Toplam hücre sayısını belirlemek için otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri say.
    4. Hücreleri 122 x g'de 3 dakika santrifüj edin, süpernatantı aspire edin ve 1x PBS'deki hücreleri istenilen konsantrasyonda yeniden askıya alın. Burada, 2.5 x 104 hücre pbs 100 μL her fare içine enjekte edilir, böylece 2.5 x 105 hücreleri / mL resuspend hücreleri. İğne yenene kadar hücre süspansiyonlarını buzda tutun.
      NOT: Hücrelerin tripsinizasyonu ile kuyruk damar enjeksiyonu arasındaki süreyi yaklaşık 1 saat ile sınırlamak önemlidir.
  3. Aşağıdaki gibi yanal kuyruk damarı ile fareleriçine adım 4.2.5 4T1 hücreleri enjekte:
    1. Hayvan tesisinde bir başlık içinde çalışmak, tüpleri ters çevirerek veya 1 mL şırınga kullanarak hücreleri eşit bir şekilde yeniden askıya alındıktan emin olarak hafifçe ancak iyice karıştırın. Şırıngayı yüklemeden önce hücrelerin her zaman askıya alınmasını sağlayın.
    2. Hücre süspansiyonu ile 1 mL Luer-lock şırınga yükleyin ve aşırı hava kabarcıkları dışarı. 1/2 inç, 30-gauge iğne yontucu ile şırınga yerleştirin ve hava kabarcıkları dışarı.
    3. Fareyi nazikçe bir kemirgen dizginleyiciye yerleştirin.
    4. Lateral kuyruk damarları görünür ve genişlemiş olmalıdır. Değilse, yavaşça kuyruk tabanı çimdik ve damarları dilate için sıcak musluk suyuna kuyruk daldırma.
      NOT: Fare kafesinin ısıtma lambasının altına ve/veya ısıtma yastığının üzerine yerleştirilerek damarların genişlemesi de sağlanabilir.
    5. Kuyruğu temizlemek için alkol mendil kullanın. İğneyi kuyruk damarına takın, eğimli tarafı yukarı doğru ve 100 μL hücre süspansiyonu enjekte edin.
      NOT: İğne damara düzgün bir şekilde yerleştirilirse, kolayca ileri ve geri kaydırmalı ve piston itildiğinde direnç olmamalıdır. Başarılı enjeksiyonlar da hangi ven mavi renk enjeksiyondan sonra birkaç saniye için beyaz döner bir "floş" neden olmalıdır.
  4. Yavaş yavaş iğne kaldırmak ve steril bir gazlı bez kullanarak, herhangi bir kanamayı durdurmak için enjeksiyon bölgesine basınç uygulayın.
  5. Tam iyileşmesağlamak için fareyi kafesine ve monitöre 15 dakika döndürün. Fareler ağrı veya sıkıntı 3x haftalık belirtileri için kontrol edilmelidir.
  6. In vivo canlı hayvan görüntüleme cihazı kullanarak 3-6 hafta boyunca metastaz oluşumu ve büyüme için fareleri izleyin (bkz. 5 ve 6. adımlar).

5. Metastatik yükün floresan ile in vivo canlı hayvan görüntüleme cihazı ile izlenmesi

NOT: Aktif parlak sinyalile floresan için hayvan görüntüetmeyin.

  1. Eğer sadece görüntüleme biyolüminesans, adım 6 atlayın.
  2. In vivo canlı hayvan görüntüleme cihazını açın.
  3. İn vivo canlı hayvan görüntüleme anestezi sistemini üreticinin yönergelerine göre kurup anestezi odasına ve görüntüleme odasına %1,5 ila %2 isofluran e-posta ile tonuyla teslim edin.
  4. 4. basamaktan floresan etiketli metastazlı fareleri anestezi odasına yerleştirerek ve %1,5-2,5 izofluran vererek anesteize edin.
  5. Resim yazılımını açın (bkz. Malzemeler Tablosu)ve oturum açın.
  6. Initialize düğmesini tıklatın ve makinenin başlatılmasını bekleyin.
  7. Görüş Alanını Dolarak değiştirin.
    NOT: Bir farenin daha yakın bir görünümü gerekiyorsa C Görüş Alanı da kullanılabilir, ancak bu aynı anda görüntülenebilir fare sayısını sınırlar.
  8. Yazılım kameranın uygun sıcaklığa ulaştığını belirttikten sonra Görüntüleme Sihirbazı düğmesini tıklatın, Floresan'ı seçin ve açılan menüden uygun filtre çiftini seçin.
    NOT: Kullanılan florofor bir seçenek değilse, GIRIŞ EX/E M'yi seçin ve gerekli uyarma ve emisyonu yazın.
  9. Fareyi adım 3.2.4'te açıklandığı gibi odaya yerleştirin.
  10. Sıra Yı Edinin'itıklatın.
  11. Görüntülemeden sonra, tam iyileşmesağlamak için fareyi kafesine ve monitöre 15 dakika döndürün.
  12. Metastaz içermeyen en az bir fare ile adım 5.2 ve adımları 5.7-5.9 tekrarlayın. NOT: Bu fare, analiz sırasında arka plan sinyalini ölçmek ve çıkarmak için kullanılacaktır (adım 8).
  13. Resim deneme süresi boyunca haftada 2-3 kez.

6. Bir in vivo canlı hayvan görüntüleme cihazı ile biyolüminesans ile metastatik yükün izlenmesi

  1. In vivo canlı hayvan görüntüleme cihazını açın ve programı aşağıdaki gibi kurlayın.
    1. Resim yazılımını açın (bkz. Malzemeler Tablosu)ve oturum açın. Initialize düğmesini tıklatın ve makinenin başlatılmasını bekleyin. Görüş Alanını Dolarak değiştirin.
      NOT: Görüş Alanı C tam fare gövdesi görüntü lemek için daha yakın bir görünüm için kullanılabilir; ancak, bu aynı anda görüntülenebilir fare sayısını sınırlar.
    2. İlk kez kullanım için pozlama ayarlarını aşağıdaki gibi edin: Edit | Tercihler | Satın Alma | Otomatik Pozlama ve varsayılan 60 saniyeden 300 saniye maksimum pozlama süresini değiştirin ve OK'yitıklatın.
      NOT: Otomatik pozlama sekmesindeki diğer parametreleri değiştirmeyin.
  2. Anestezi sistemini üreticinin yönergelerine göre kurup anestezi odasına ve görüntüleme odasına %1,5 ile %2 arasında isofluran e-posta ile tonu.
  3. Adım 6.4'e geçmeden önce kameranın uygun sıcaklığa ulaştığından emin olun.
  4. 4. basamaktan metastaz içeren fareleri anestezi odasına yerleştirerek ve %1.5-2.5 isofluran vererek anestezi edin.
  5. Aşağıdaki gibi biyolüminesans görüntüleme için fareler hazırlayın.
    1. D-luciferin (D-PBS 30 mg /mL) ile 1 mL şırınga yükleyin ve sonra şırınga için bir inç 30-gauge iğne ekleyin ve hava kabarcıkları dışarı.
    2. Anestezili farenin kütlesini ölçün ve kaydedin.
    3. Başparmak ve işaretçi parmaklarını kullanarak ve serçe parmağı ile elin tabanı arasındaki kuyruğu kavrayarak, boynunun ensesini çimdikleyerek fareyi dizginle. Fareyi 45 derecelik bir açıyla ters çevirin ve başı aşağı doğru işaret edin.
    4. İğneyi, eğimli tarafı yukarı, farenin sol tarafındaki intraperitoneal (IP) boşluğa yerleştirin. Küçük bir hacim çizerek IP alanına girişi onaylayın. IP alanında geri çekerken iğnenin tabanında renk olmamalıdır.
    5. 150 mg/kg doz için uygun d-luciferin hacmini enjekte edin.
    6. D-luciferin uygulamasından hemen sonra, bir zamanlayıcı başlatın ve burun koni burnu ile görüntüleme cihazı sırtına fare düz yerleştirin ve% 1.5-2.5 isoflurane uygulandığından emin olun. Birden çok fare yi görüntüleseniz, her fare arasına bölücüler yerleştirin. Farelerin mümkün olduğunca düz konumlandırıldığından emin olun (yani bir tarafa yaslanmamalı).
    7. Luminescent ve Fotoğraf kutularını tıklatın ve sonra Edinme Kontrol Paneli'nde Edinme'yi tıklatın.
  6. Pik sinyal elde edilene kadar sürekli olarak biyolüminesans görüntüler elde edin ve analiz için en yüksek biyolüminesans sinyali ile görüntüyü kullanın.
  7. Görüntülemeden sonra, tam iyileşmesağlamak için fareyi kafesine ve monitöre 15 dakika döndürün.
  8. Resim deneme süresi boyunca haftada 2-3 kez.

7. Metastaz sayısının ve büyüklüğünün ölçülmesi

NOT: Metastazların büyümesine izin verilen süre, her hücre çizgisi ve fare türü için belirlenmeli ve enjekte edilen hücre sayısından etkilenecektir.

  1. Fareleri standart kurumsal kurallara göre ötenazi.
  2. İzole ve her fare den akciğerleri çıkarın ve fazla kan kaldırmak için 1x PBS durular.
  3. Akciğerleri yavaşça loblara ayırın.
  4. GFP geniş bant filtresi (uyarma 470/40x) ile floresan stereoskop kullanarak parlak alanda ve floresan 10x de loblarda ZsGreen metastaz görüntüleri edinin.
    NOT: Tüm numuneler için aynı büyütme ve parlaklığı koruyun. Kullanılan büyütme, metastazların büyüklüğüne, sayısına ve parlaklığına ve kullanılan mikroskobun görüş alanına bağlı olarak değişebilir.
  5. Görüntülerdeki metastazların boyutunu ve sayısını ölçmek için görüntü analizi yazılımını kullanın.
    NOT: Görüntü analizi protokolü yazılıma bağlıdır ve step3'teki tümörlerle optimize edilebilir. Alternatif olarak, floresan stereoskop kullanarak el ile her akciğermetastaz sayısını saymak. Protokol burada duraklatılmış olabilir ve adım 8 tüm in vivo görüntüleri toplandıktan sonra herhangi bir noktada yapılabilir.

8. In vivo canlı hayvan görüntüleme cihazı ile elde edilen görüntülerden elde edilen verilerin işlenmesi ve analizi

  1. Görüntü yazılımındaki her fare için tüm görüntü dosyalarını açın.
    NOT: Analiz için en yüksek biyolüminesans sinyali ile görüntüyü kullanın
  2. Ünitelerin, görüntü penceresinin sol üst kısmındaki oku tıklatArak ve uygun birime değiştirerek, floresan veriler için biyolüminesans veriler ve verimlilik için Parlaklıkta olduğundan emin olun.
  3. Aşağıdaki gibi ilgi alanı (YG) oluşturmak için son zaman noktasından görüntüyü kullanın.
    1. Araç Paleti penceresinde YG Araçlarını tıklatın. Ok atıklayın ve 1seçerek bir YG ekleyin.
    2. YG'nin kenarlığı'nı tıklatın ve farenin göğsüne doğru hareket ettirin. Farenin göğsünü kaplayabilmesi ve sinyali dışlamaması için YG'nin boyutunu ayarlayın.
  4. ROI'ları ölçün ve ham sayıyı bir excel sayfasına kopyalayın veya yazın.
    NOT: Biyolüminesans veriler için toplam akı (fotonlar/ saniye), hangi Yatırım Getirisi tüm parlaklık toplamı seçin. Metastazlar mutlaka düzgün büyümek zorunda olmadığından, metastatik yükün toplamını ölçer çünkü toplam akı ortalama parlaklık üzerinde tercih edilir. Benzer şekilde, floresan veriler için ortalama verimlilik yerine toplam verimlilik % (emisyon ışığı (foton/saniye)/uyarma ışığı (foton/saniye)) kullanılmalıdır.
  5. Adım 8.3'te kullanılan YG'yi kopyalamak ve her resim dosyasına yapıştırmak için resim dosyasına sağ tıklayın.
    NOT: Floresan görüntüleri ölçerken, metastaz olmadan görüntülenmiş bir fareüzerinde aynı bölgeyi ölçün. Bu sinyali arka plan sinyali olarak kullanın ve elde edilen her floresan metastaz içeren fare görüntüsünden çıkarın.
  6. Yapıştırılan RO'ları her görüntü için adım 8.3.4'te seçilen aynı bölgeye taşıyın ve 8.4 adımını yineleyin.
  7. Ham verileri aşağıdaki gibi çizin ve analiz edin (bkz. Ek Tablo 2).
    1. Belirtilen formülü(Ek Tablo 2)kullanarak her fare için ham verilerin günlük10 dönüşümü yapın ve Şekil 2D ve Şekil 4F'dekigibi çizim yapın. Günlük10 dönüşümü, geometrik olma eğiliminde olan büyüme eğrisini doğrusallaştırır ve heteroscedastisiteyi en aza indirir.
    2. Doğrusal regresyon kullanarak, 8.7.1(Ek Tablo 2)olarak çizilen her fare için log10 dönüştürülmüş verilere monte edilen hattın eğimini hesaplayın. Satıra uymak ve eğimi tek adımda hesaplamak için Ek Tablo 2'deki formüle bakın.
    3. Şekil 2E ve Şekil 4G'dakigibi yamaçların sayısal değerlerini çizin. İstatistiksel anlamlılık belirlemek için yamaçlarda öğrencinin t-testini veya tek yönlü ANOVA'sını (2'den fazla grup için) kullanın.

Sonuçlar

Yukarıdaki yaklaşımı göstermek için, kritik bir çoğaltma faktörü olan RPA3'ün metastatik fare meme karsinomu hücre hattında (4T122)yıkıldığı bir kavram deneyinin kanıtını gerçekleştirdik. Protokol, hücrelerin genetik manipülasyondan önce hem luciferase hem de floresan proteinlerle etiketlendiğini açıklarken, rnai vektörleri de ZsGreen'i teslim ettiği için modifiye edilmiş bir yaklaşım kullandık (Şekil 2A). İlk ola...

Tartışmalar

Yöntemin kritik adımları
Belirli bir hücre hattı ve fare zorlanması için enjekte edilen hücre sayısını (adım 3) optimize etmek önemlidir, çünkü bu, oluşan metastaz sayısını ve deneyin uzunluğunu büyük ölçüde etkileyebilir. Çok fazla hücre enjekte edilirse veya metastazlar çok uzun süre büyürse, metastazların genetik manipülasyonun etkilerini değerlendirmek zorlaştıkça sayılması zor olabilir. Ancak, çok az hücre enjekte edilirse, az veya hiç metastaz oluşabil...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Emily Norton'a viral enfeksiyonlara ve el yazmasının eleştirel okumaya yardımcı olduğu için teşekkür ederiz. Biz de akciğerlerde yeşil metastaz görüntü analizi ile yardım için akciğer ve Kate E. Tubbesing görüntüleri elde yardımcı olmak için Ryan Kanai teşekkür ederiz. Biz destek ve bu video hazırlanmasında yardım için hayvan araştırma tesisi personeli teşekkür ederiz. Bu çalışma, J.M.L.'ye (#CCR17477184) verilen Susan G. Komen Career Catalyst Grant tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
10% SDS-PAGE GelFor western blot
2.5% TrypsinGibco15090-046Trypsin for tissue culture
96 well flat bottom white assay plateCorning3922For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Alcohol wipesFor sterolizing the injection site before tail vein injecitons
BALB/C mice (female, 6 weeks)TaconicBALB-FFor tail vein metastatic colonization and burden assays
BSA regularVWR Ameresco97061-416For western blot
Cell lysis bufferCell SignalingFor collecting protien samples
Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 μmCelltreat40-229749-CSFor filtering viral supernatant
CO2 and euthanasia chamberFor euthanasing the mice
Dual-luciferase reporter assay kitPromegaE1960For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Dulbecco&39;s phosphate buffered salineHimediaTS1006For PBS
EDTAVWR97061-406Used to dilute trypsin for tissue culture
FBS 100% US originVWR97068-085Component of complete growth media
Fujifilm LAS-3000 gel imagerFujifilmFor western blot
GAPDH(14C10) Rabibit mAbCell Signaling2118For western blot
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugateThermo Scientific31460For western blot
Human embryonic kidney cells, HEK-293FTInvitrogenR70007Cell line used for packging virus
HyClone DMEM/High clucoseGE Healthcare life sciencesSH30243.01Component of complete growth media
Hygromycin B, Ultra Pure GradeVWR Ameresco97064-810For antibiotic selection of infected cells
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EAMolecular devicesFor measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
ImagejUsed for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 & 100
Immuno-Blot PVDF MembraneBiorad1620177For western blot
IsofluraneFor mouse anesthesia
IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device)PerkinElmerCLS136340For in vivo imaging of metastatic burden
Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters)Leica MicrosystemsMicroscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain
L-GlutamineGibco25030-081Component of complete growth media
Lipofectamine 3000Life technologiesL3000008For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection
Living Image 3.2 (image software program)PerkinElmerSoftware for IVIS
Mouse breast cancer cells, 4T1Karmanos Cancer InstituteAslakson, CJ et al.,1992Mouse metastatic breast cance cell line
Multi-Gauge version 3.0FujifilmSoftware for quantifying western blot band intensity
Opti-MEM (transfection buffer)Gibco31985-062For packaging virus and transfection
Penicillin StreptomycinGibco15140-122Component of complete growth media
Pierce BCA protein assay kitThermo Scientific23225For quantifying protein concentration
Pierce Phosphatase Inhibitor Mini TabletsThermo ScientificA32957Added to cell lysis buffer
Pierce Protease Inhibitor Mini TabletsThermo ScientificA32953Added to cell lysis buffer
Polybrene (hexadimethrine bromide)Sigma-Aldrich45-H9268For infection
PuromycinSigma-Aldrich45-P7255For antibiotic selection of infected cells
Rodent restrainerFor restraining mice during tail vein injeciton
SDS-PAGE running bufferFor western blot
TAZ (V3886) AntibodyCell Signaling4883For western blot
TBST bufferFor western blot
TC20 automated cell counterBio-RadFor counting cells
VectorsSee Table 1 for complete list of vectors
VWR Inverted Fluorescence MicroscopeVWR89404-464For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells
Western transfer bufferFor western blot
XenoLight D-Luciferin K+ SaltPerkinElmer122799Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection)Roche6365787001For packaging virus
YAP (D8H1X) XP Rabbit mAbCell Signaling14074For western blot

Referanslar

  1. Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
  2. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
  3. Wendt, M. K., Molter, J., Flask, C. A., Schiemann, W. P. In vivo dual substrate bioluminescent imaging. Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).
  4. Moret, R., et al. Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (147), (2019).
  5. Lizardo, M. M., Sorensen, P. H. Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
  6. Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
  7. Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clinical and Experimental Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).
  8. Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
  9. Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
  10. Cordero, A. B., Kwon, Y., Hua, X., Godwin, A. K. In vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer. Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
  11. Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
  12. Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. Journal of Visualized Experiments. (26), (2009).
  13. Oshima, G., et al. Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
  14. Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
  15. Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (37), 2441-2450 (2012).
  16. Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers (Basel). 10 (4), (2018).
  17. Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cell Signal. 28 (11), 1761-1772 (2016).
  18. Harvey, K. F., Pfleger, C. M., Hariharan, I. K. The Drosophila Mst ortholog, hippo, restricts growth and cell proliferation and promotes apoptosis. Cell. 114 (4), 457-467 (2003).
  19. Journal of Visualized Experiments Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  20. Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
  21. Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Ressearch. 52 (6), 1399-1405 (1992).
  22. Fellmann, C., et al. Functional identification of optimized RNAi triggers using a massively parallel sensor assay. Molecular Cell. 41 (6), 733-746 (2011).
  23. Reticker-Flynn, N. E., et al. A combinatorial extracellular matrix platform identifies cell-extracellular matrix interactions that correlate with metastasis. Nature Communications. 3, 1122 (2012).
  24. Sun, Z., et al. Prognostic Value of Yes-Associated Protein 1 (YAP1) in Various Cancers: A Meta-Analysis. Public Library of Science One. 10 (8), 0135119 (2015).
  25. Feng, J., Ren, P., Gou, J., Li, Z. Prognostic significance of TAZ expression in various cancers: a meta-analysis. Onco Targets and Therapy. 9, 5235-5244 (2016).
  26. Ge, L., et al. Yes-associated protein expression in head and neck squamous cell carcinoma nodal metastasis. Public Library of Science One. 6 (11), 27529 (2011).
  27. Zhang, X., et al. The Hippo pathway transcriptional co-activator, YAP, is an ovarian cancer oncogene. Oncogene. 30 (25), 2810-2822 (2011).
  28. Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
  29. Kim, T., et al. MRTF potentiates TEAD-YAP transcriptional activity causing metastasis. European Molecular Biology Organization Journal. 36 (4), 520-535 (2017).
  30. Nallet-Staub, F., et al. Pro-invasive activity of the Hippo pathway effectors YAP and TAZ in cutaneous melanoma. Journal of Investigative Dermatology. 134 (1), 123-132 (2014).
  31. Hsu, Y. L., et al. Angiomotin decreases lung cancer progression by sequestering oncogenic YAP/TAZ and decreasing Cyr61 expression. Oncogene. 34 (31), 4056-4068 (2015).
  32. Lau, A. N., et al. Tumor-propagating cells and Yap/Taz activity contribute to lung tumor progression and metastasis. European Molecular Biology Organization Journal. 33 (5), 468-481 (2014).
  33. Gu, J. J., et al. Inactivation of ABL kinases suppresses non-small cell lung cancer metastasis. Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (21), 89647 (2016).
  34. Diepenbruck, M., et al. Tead2 expression levels control the subcellular distribution of Yap and Taz, zyxin expression and epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cell Science. 127, 1523-1536 (2014).
  35. Han, S., et al. Suppression of miR-16 promotes tumor growth and metastasis through reversely regulating YAP1 in human cholangiocarcinoma. Oncotarget. 8 (34), 56635-56650 (2017).
  36. Yin, K., et al. Netrin-1 promotes metastasis of gastric cancer by regulating YAP activity. Biochemical Biophysical Research Communications. 496 (1), 76-82 (2018).
  37. Guo, L., et al. Knockdown of TAZ modifies triple-negative breast cancer cell sensitivity to EGFR inhibitors by regulating YAP expression. Oncology Reports. 36 (2), 729-736 (2016).
  38. Liu, Y. N., et al. Loss of Androgen-Regulated MicroRNA 1 Activates SRC and Promotes Prostate Cancer Bone Metastasis. Molecular and Cellular Biology. 35 (11), 1940-1951 (2015).
  39. Bartucci, M., et al. TAZ is required for metastatic activity and chemoresistance of breast cancer stem cells. Oncogene. 34 (6), 681-690 (2015).
  40. Wang, T., et al. YAP promotes breast cancer metastasis by repressing growth differentiation factor-15. Biochimica et Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1864, 1744-1753 (2018).
  41. Wang, J., Rouse, C., Jasper, J. S., Pendergast, A. M. ABL kinases promote breast cancer osteolytic metastasis by modulating tumor-bone interactions through TAZ and STAT5 signaling. Science Signaling. 9 (413), (2016).
  42. Sun, S., Irvine, K. D. Cellular Organization and Cytoskeletal Regulation of the Hippo Signaling Network. Trends in Cell Biology. 26 (9), 694-704 (2016).
  43. Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34 (48), 5879-5889 (2015).
  44. Li, C., et al. A ROR1-HER3-lncRNA signalling axis modulates the Hippo-YAP pathway to regulate bone metastasis. Nature Cell Biology. 19 (2), 106-119 (2017).
  45. Pei, T., et al. YAP is a critical oncogene in human cholangiocarcinoma. Oncotarget. 6 (19), 17206-17220 (2015).
  46. Qiao, Y., et al. YAP Regulates Actin Dynamics through ARHGAP29 and Promotes Metastasis. Cell Reports. 19 (8), 1495-1502 (2017).
  47. Zhou, W., Li, X., Premont, R. T. Expanding functions of GIT Arf GTPase-activating proteins, PIX Rho guanine nucleotide exchange factors and GIT-PIX complexes. Journal of Cell Science. 129 (10), 1963-1974 (2016).
  48. Haemmerle, M., et al. Platelets reduce anoikis and promote metastasis by activating YAP1 signaling. Nature Communcations. 8 (1), 310 (2017).
  49. Liu, Y., et al. Increased TEAD4 expression and nuclear localization in colorectal cancer promote epithelial-mesenchymal transition and metastasis in a YAP-independent manner. Oncogene. 35 (21), 2789-2800 (2016).
  50. Hiemer, S. E., et al. A YAP/TAZ-Regulated Molecular Signature Is Associated with Oral Squamous Cell Carcinoma. Molecular Cancer Research. 13 (6), 957-968 (2015).
  51. Lee, H. J., et al. Fluid shear stress activates YAP1 to promote cancer cell motility. Nature Communications. 8, 14122 (2017).
  52. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  53. Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388, 217-225 (2005).
  54. Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210 (2005).
  55. Chen, M. B., Lamar, J. M., Li, R., Hynes, R. O., Kamm, R. D. Elucidation of the Roles of Tumor Integrin beta1 in the Extravasation Stage of the Metastasis Cascade. Cancer Resesearch. 76 (9), 2513-2524 (2016).
  56. Labelle, M., Begum, S., Hynes, R. O. Direct signaling between platelets and cancer cells induces an epithelial-mesenchymal-like transition and promotes metastasis. Cancer Cell. 20 (5), 576-590 (2011).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser Ara t rmalarSay 1544T1 h crelerisyngenektik fare modelimetastazmetastatik kolonizasyonmeme kanserifarecanl hayvan g r nt lemekuyruk ven metastazYAPTAZ

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır