İntravital Mikroskopi Tabanlı Bir Yaklaşım Bağırsak Geçirgenliği ve Epitel Hücre Dökülme Performansını Değerlendirmek için

Özet

İntravital mikroskopiden yararlanan burada sunulan yöntem, canlı hayvanlarda bağırsak epitel hücresi dökülmesinin gerçek zamanlı olarak görüntülenmesidir. Bu nedenle anestezili farelerin topikal lekeli bağırsak mukozası (acriflavine ve rhodamineB-dextran) konfokal mikroskopi kullanılarak tek hücreçözünürlüğe kadar görüntülenir.

Özet

Konfokal görüntüleme ile bağırsağın intravital mikroskobu, canlı hayvanlarda epitel hücre dökülmesi ve bariyer kaçağının gerçek zamanlı olarak gözlemlenmesine olanak sağlar. Bu nedenle, anestezik farelerin bağırsak mukozası topikal olarak spesifik olmayan boyama (acriflavine) ve floresan izleyici (rhodamine-B dextran), tuzlu çözelti-durulanmış plaka üzerine monte ve doğrudan bir konfokal mikroskop kullanılarak görüntülenmiştir. Bu teknik, ağızdan uygulanan izleyicilerin transmukozal geçişi gibi bağırsak geçirgenliğinin sızıntısını belirlemek için diğer non-invaziv teknikleri tamamlayabilir. Bunun yanı sıra, burada sunulan yaklaşım gerçek zamanlı olarak hücre dökülme olayları doğrudan gözlem sağlar. Uygun floresan muhabir fareler ile birlikte, bu yaklaşım hücresel ve moleküler mekanizmalar bağırsak epitel hücre ekstrüzyon kontrol içine ışık dökülmesi için uygundur, yanı sıra diğer biyolojik süreçler. Son yıllarda, intravital mikroskopi kullanarak ilginç çalışmalar endotel geçirgenliği hakkında bilgi katkıda bulunmuştur, bağışıklık hücresi bağırsak homing, bağışıklık-epitel iletişim ve luminal bileşenlerin invazyonu, diğerleri arasında. Burada sunulan protokol, sadece epitel hücre ekstrüzyonunu kontrol eden mekanizmaların anlaşılmasına yardımcı olmakla kalmıyor, aynı zamanda diğer dokularda bile diğer son derece dinamik hücresel süreci görselleştirmek için araç olarak kullanılacak diğer yaklaşımların gelişimsel temelini de oluşturacaktır. Teknik sınırlamalar arasında, belirli dokunun optik özelliklerinin yanı sıra seçilen görüntüleme teknolojisi ve mikroskop yapılandırması da görüntüleme çalışma mesafesini ve edinilmiş görüntülerin çözünürlüğünü belirleyecektir.

Giriş

Bağırsak, çatışan süreçleri sağlayan sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir işlevi olan son derece uzmanlaşmış bir organdır, yani beslenme ve zararlı luminal maddelere karşı koruma. Insan vücudu ve çevre arasında astar, bağırsak epitel fiziksel ve immünolojik bariyer olarak davranır ve bağırsakta mukozal homeostaz bakımına katkıda bulunur^1,2. Epitel bütünlüğü kaybı ve artan sıkı kavşak geçirgenliği iyi Inflamatuar Barsak Hastalığı ile ilişkili olduğu bilinmektedir (IBD)^3,4,5,6. Epitel değişiklikler daha sonra NEDEN ve İBH kronik bağırsak iltihabı için ikincil amplifikatör olarak kabul edilir. Böylece, IBD hastalarının bağırsaklarında erken epitel değişikliklerin geliştirilmiş bir anlayış güvenilir tahmin ve IBD relaps sonraki önlenmesi için epitel bütünlüğünü geri yüklemek için yeni stratejiler geliştirilmesi için büyük bir değer olacaktır.

Bağırsak epitelkarmaşık ve sıkı düzenlenmiş ciro süreci izler. Crypt alttan, ölümcül farklılaşmış bağırsak epitel hücreleri (IECs) pluripotent kök hücrelerden elde edilen villus ucu, yaşlı / hasarlı hücreler lümen içine dökülür yukarı doğru göç⁷. Bölünme ve hücre ekstrüzyonu arasındaki denge bağırsak epitel hücre sayılarının sürdürülmesini sağlar, boşluk ve sızıntı oluşumunu kaçınarak, yanı sıra potansiyel hücre kitleleri ve tümörigenez 8 yol açan epitel hücrelerinin birikimi^8,9,10. Bağırsak epitelinin fizyolojik yenilenmesinde epitel hücrelerinin dökülmesinin kilit rolüne rağmen, villus ucundaki hücrelerin ekstrüzyonunu yönlendiren moleküler mekanizmalar hakkındaki bilgi sınırlıdır. Bu nedenle, epitel hücre dökülme dahil moleküler olayların dizisinin kesin bir açıklamasını sağlayan temel araştırma için bir ihtiyaç vardır.

Bağırsak mukozası içinde farklı hücre tipleri arasındaki karmaşık etkileşimler epitel ciro ve intestinal homeostaz düzenleyen moleküler mekanizmaları anlamak için anahtardır. Bu bağlamda in vivo çalışmaları in vitro ve ex vivo yaklaşımlara göre yüksek avantajlar sunmaktadır. Ayrıca, gerçek zamanlı görüntüleme teknikleri belirli olayları kontrol olayların dizisinin açıklamasını sağlar. Bu bağlamda, son derece dinamik süreçlerin incelenmesi, dokunun doğrudan gözlemlenmesi için optimize edilmiş yüksek çözünürlüklü tekniklerin kullanılmasını gerektirir. İntravital görüntüleme teknikleri bağırsakta epitel hücre dökülmesi çalışma için benzersiz uygun araçlar olarak görünür.

"İntravital mikroskopi" terimi, canlı bir hayvan ın içindeki hücre ve dokuları doğrudan görselleştirmek için yüksek çözünürlüklü görüntüleme tekniklerinden (multifoton veya konfokal mikroskopi) yararlanan deneysel yaklaşımları ifade eder^11. In vivo bilgilerin in vivo çözünürlüğe kadar gerçek zamanlı olarak elde edilmesini sağlar ve statik veya düşük çözünürlüklü yöntemlere göre net avantajlar sağlar. İntravital mikroskopi tamamlayıcı bilgi sağlar ve klasik ve / veya high-end teknikleri bazı sınırlamalar aşmak, doku işleme nedeniyle eserler gibi. Buna karşılık, intravital mikroskopi nin ana sınırlama doku doğrudan mikroskopa maruz olması gerektiğini, hangi çoğu durumda cerrahi gerektirir. Sofistike yaklaşımlar canlılığı korumak ve görüntülenmiş doku etkisini en aza indirmek rağmen (skinfold odaları ve görüntüleme pencereleri)^12,13, çoğu durumda basit bir deri kesi doku (deri flepleri) dışsallaştırma için yapılır¹⁴. Son on yılda, bu yaklaşımlar daha önce anlaşılmaz olan son derece dinamik süreçler hakkında önemli kanıtlar alabildi. Çeviri, gerçek zamanlı görüntüleme kök hücre ve lökositler homing yeni biyolojik anlayışlar sağlanan¹⁵, yanı sıra kanser yayma ve metastaz oluşumu^13,16. Klinik bağlamda, endomikroskopi şu anda kanser tanı aracı olarak istismar¹⁷ ve gastrointestinal hastalıklar, IBD gibi^18,19; konfokal mozaik mikroskopi cerrahi sırasında hızlı bir patoloji aracı haline geldi^{iken 20}. Birlikte, intravital mikroskopi son zamanlarda klinikte biyomedikal araştırma ve gelecekteki uygulama için değerli ve çok yönlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır.

İntravital mikroskopi burada intestinal epitel kaçağının gerçek zamanlı görüntülenmesi ve epitel hücre dökülme olaylarının gözlemlenmesi için uygulanmaktadır. Bağırsak geçirgenliğinin kaçağı, serum^21'dekifloresan izleyicilerin sözlü olarak uygulanması gibi diğer in vivo noninvaziv teknikler ile tespit edilebilir. Ancak, bu teknik dökülme performansı nın doğrudan gözlemine veya para-ve hücre içi geçirgenlik arasındaki ayrımına izin vermez. Standart izleyici deneyleri ve intravital mikroskopi kombinasyonu uygun bir yaklaşımı temsil eder: i) bağırsak geçirgenliği bozuklukları tanımlamak, ve ii) para arasında ayırmak- ve trans-hücre içi geçirgenlik. Hücre dökülmesinin yanı sıra, in vivo floresan etiketleme ile birlikte intravital mikroskopi diğer hücresel ve moleküler mekanizmaların çalışmasını sağlar (örneğin, floresan muhabir fareler kullanarak hücre dökülmesi sırasında sıkı kavşak yeniden dağılımı²² veya bağırsak mukozası içindeki IEC'ler ve diğer hücreler arasındaki etkileşimler^23).

Burada sunulan yöntem, konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kullanılarak bağırsak mukozasının gerçek zamanlı gözlemini sağlamak için intravital mikroskopinin bir adaptasyonunu temsil etmektedir. Bu nedenle, ggtase koşullu knock-out fareler kullanın (Geranylgeranyltransferaze) bağırsak epitel hücrelerinde(IECs)^iΔIEC içinde, onlar ciddi bir bağırsak hastalığı muzdarip ve artmış epitel geçirgenliği muzdarip beri²⁴. Farenin cerrahi olarak hazırlanması ve bağırsak mukozasının boyanışı, görüntüleme kazanımı ve kazanım sonrası analiziçin kullanılan uygun ayarlar anlatılmaktadır. Bu protokol, bağırsak epitel hücresi dökülmesinin dinamiği ve kinetikleri hakkında güncel bilgilere katkıda bulunan gelecekteki çalışmalara olanak sağlayabilir. Ayrıca, protokol bağırsak mukozası yüzeyinde meydana gelen diğer olayları incelemek için çeşitli adaptasyonlar için bir temel olarak hizmet verebilir, ve hatta diğer dokularda.

Protokol

Aşağıdaki protokol Erlangen'deki ilgili yerel makamlar tarafından onaylanmıştır (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Almanya). Fareler belirli patojeniçermeyen koşullar altında barındırıldı.

NOT: IEC'lerde GGTase aracılı prenilasyonin inhibisyonu Pggt1b^iΔIEC farelerde bağırsak geçirgenliğinin ciddi bir değişimine neden olur²⁴. Bu nedenle, bu fare modeli protokolün bağırsak bariyeri defektlerini incelemek için nasıl yararlı olabileceğini göstermek için kullanılmıştır. Ancak, bu protokol başka bir fare satırının çalışması için kullanılabilir.

1. Cerrahi hazırlık ve fare bağırsak mukozası boyama

NOT: Cerrahi hazırlık daha önce açıklanan protokollere dayanmaktadır²⁵. Vücut ısısında bir düşüş önlemek için, cerrahi hazırlık sırasında kırmızı bir lamba altında anestezili fare tutun.

1. Ketamin/ksilazin intraperitoneal enjeksiyon (96 mg/kg ketamin; ve 12.8 mg/kg xylazin) ile fareyi anesteize edin. Göz kapağı refleksi eksikliğini kontrol ederek anesteziyi doğrulayın.
2. Bir pamuk tomurcuk kullanarak göz koruma kremi uygulayın.
3. Standart forceps ve düz ince makas kullanarak sol ventral alanda bir kesi (1 cm) olun.
4. Bağırsağın bir bölümünü dışa doğru (yaklaşık 5-7 cm).
5. Antimesenteric tarafında elektrokoterizasyon ile dışlanmış bağırsak segmentini uzunlamasına açın.
6. Dışkı içeriğini kaldırmak için mukozayı ve durulayın kısa bir süre tuzlu çözelti ile durulayın.
   NOT: İsteğe bağlı olarak, peristalsis nedeniyle hareket eserler önlemek için doğrudan bağırsak üzerine xylazin uygulayın.
7. Akrülvine ve rhodamine-B dekstran (10 kDa) ile bağırsak mukozayüzeyini leke.
   1. 1 mg/mL acriflavine çözeltisini (100 μL) mukozaya damla damla damla damla tutarak ve 3 dk kuluçkaya yatırın. Kalan çözeltiyi PBS ile yıkayın.
   2. 2 mg/mL rhodamine-dextran çözeltisini (100 μL) mukozaya damla damla damla damla ve 3 dakika kuluçkaya yatırArak uygulayın. Kalan çözeltiyi PBS ile yıkayın.
      NOT: İsteğe bağlı olarak, aseptik pamuk kullanarak hazırlık kan çıkarın.
8. Anestezili fare omurgasını önceden ısıtılmış tuzlu çözelti (37 °C) ile durulanmış bir hazneye monte edilmiş bir kapak kaydırakına yerleştirin.
   NOT: Açılan bağırsak segmenti daha sonra kapak slayt üzerine, aşağı luminal yüzey yerleştirilir.
9. Ters mikroskop aşamasına preparatı (anestezili fare) yerleştirin.
10. Hayvanı bir isothermal ped (yaklaşık 37 °C) ile kapatın.
11. Hemen intravital mikroskopiye geçin.
    NOT: Doku ve hücre ölümünün susuz kalmasını önlemek için cerrahi preparatı önceden ısıtılmış tuzlu solüsyonla durulayın.

2. İntravital mikroskopi

NOT: Anestezi, cerrahi ve görüntü edinimi arasında uzun bekleme sürelerinden kaçınmak için cerrahi hazırlıklara başlamadan önce 2.1. Gerekirse, anestezi ek dozlarda görüntüleme deneyleri için anestezi altında tutmak için cerrahi olarak hazırlanmış hayvanlara verilebilir.

1. CLSM mikroskobunu ayarlayın.
   1. Mikroskop tabanını ve tarayıcı kutusunu açarak CLSM mikroskobu başlatın. Başlat düğmesine basarak bilgisayarı açın.
   2. Simgeye çift tıklayarak görüntü edinme yazılımını (örneğin, LAS X) başlatın. Uygun yapılandırmayı seçin (Yapılandırma: makine; Mikroskop: DMI6000) ve Tamam'ıtıklatın.
      1. Uygun Çözünürlüğü tanımlayın. Yapılandırmaya Git | Donanım | Çözünürlük | Bit derinliği. 12'yi seçin.
   3. Edinme menüsüne gidin. Açılan menüden görüntü edinme modu için xyzt'yi seçin. Açılan menüden (20x veya 40x) hedefi seçin.
   4. Sıralı edinme ayarını tasarla. Seqtıklayın . Ekle düğmesine (+) tıklayarak ikinci bir sıra ekleyin. Kareler arasındaseçin.
      1. Sıra 1'i yapılandırın (acriflavine tespiti; 416 nm uyarma; 514 nm emisyon). Görünür lazer kutusunu açın. PMT1'i (A)'yı etkinleştirin. Emisyon dalga boyu penceresini (490-550 nm) tanımlayın.
      2. Yapılandırılan Sequence 2 (rhodamineB-dextran tespiti; 570 nm uyarma; 590 nm, emisyon). Görünür lazer kutusunu açın. PMT2'yi (A)'yı etkinleştirin. Emisyon dalga boyu penceresini (550-760) tanımlayın.
   5. Karşılık gelen lazerleri etkinleştirin (488 ve 552). Yapılandırmaya Git | Lazerler. 488 ve 552 nm lazerleri etkinleştirin (AÇIN).
2. Ayarı geçerli denemenin belirli özelliklerine ayarlayın.
   1. Işık kaynağını açın (güç tuşuna basın). Preparatı (anestezili fare) mikroskop aşamasına yerleştirin ve aydınlatma ekseni doku hazırlığına odaklanana kadar xy pozisyonunu değiştirin.
   2. Standart ışık kaynağını ve parçaları kullanarak ilgi alanını seçin.
      1. Filtre küpünü (I3) seçin. Deklanşörü aç. Makro ve mikro tekerleği kullanarak bağırsak mukozasının yüzeyine odaklanın. XY konumunu değiştirerek görüş alanı içinde birkaç villinin görüntülenebildiği bir alan arayın.
   3. Rhodamine-dextran boyama da bu alanda görülebilir olduğunu doğrulayın. Filtre küpünü değiştirin (N2.1). Görüntüyü gözlerinden kontrol edin.
   4. ClSM görüntü edinimi yazılımdan başlatın. İki dizi için ayarları optimize edin.
      1. Sıra 1'i seçin. Sıra 1 için lazer gücünü, kazancı ve mahsupı ayarlayın.
      2. Sıra 2'yi seçin. Sıra 2 için lazer gücünü, kazancı ve mahsupı ayarlayın.
   5. Z yığını aralığını tanımlayın.
      1. Z-stack bırakma menüsünü açın. Z ekseni kontrolünü kullanarak mukozanın yüzeyine odaklanın. Başlat'abasın.
      2. Sinyalin hala tespit edilebildiği alt sınıra odaklanın. Bitiş tuşunabasın.
      3. z yığınlarının sayılarını tanımlayın (10). Art arda iki zaman puanı için 2 dakikadan uzun zaman atlamalarından kaçının.
   6. Saat ayarlarını tanımlayın. Zaman menüsüne git. Simge durumuna küçült'etıklayın. Durdurulana kadar Kazan'ıseçin.
   7. Satır ortalamasını tanımlayın. Seq 1'i seçin. Satır Ortalaması 2'yi seçin. Seq 2'yi seçin. Satır Ortalaması 2'yi seçin.
3. Karşılık gelen görüntüleri edinin.
   1. Biçim (1024 x 1024) ve Hız (400)'yi seçin. Başlat'abasın.
   2. İstenilen görüntü edinme süresinden sonra Durdur'a basın.
4. Dosyayı kaydedin. Project'egit. İlgili dosyaya sağ tıklayın. Olarak Kaydettuşuna basın.
   1. Dosyayı uygun şekilde adlandırın. Yeterli klasörü seçin. Kaydettuşuna basın.
5. Hayvan (servikal çıkış) ötenazi ve gerekirse art niyet analizi için dokuları toplamak.

3. Görüntü analizi: Hücre dökülme hızını ve bağırsak epitelini belirleme

1. Hücre dökülme oranı
   1. Görüntü edinme yazılımını başlatın.
   2. Open projelerine gidin. Uygun dosyayı seçin.
   3. Görüntü edinmenin toplam süresini tanımlayın.
      1. Son tam z yığınını seçin. Daha önce seçili zaman noktasından son Z konumunu seçin. Ekranın sağ alt köşesindeki saati (toplam görüntü edinme süresi) okuyun.
   4. Bir villus seçin.
      1. Uygun Z yığını konumunu seçin (villus yüzeyi, ancak lümen mevcut zaten döken hücreleri ve diğer bileşenler ile girişim önlemek için yeterince derin).
      2. Bazal membranuzunu ölçün. Cetvel aracını seçin. Tüm villus çevresini kapsayacak veya çizmek için villus'u birkaç satıra bölün. Farklı değerleri (bazal membran Toplam uzunluğu) ekleyin. Cetvel aracının kesimlerini silin.
   5. Görüntü edinme nin tüm süresi boyunca meydana gelen olayların sayısını sayın.
      1. Yeterli boyutta segmentlere villus bölün. Çubuğu farklı zaman noktalarına kaydırarak olayların/segmentin dizisini analiz edin. Tanımlanan hücre dökülme olayları açıklama.
   6. Bazal membranın dökülme olaylarının/zamanının/uzunluğunu hesaplayın, bu da hücre dökülme oranını gösterir. En fazla 5 villi/video ve en az iki video/fare sayın. Bu 10 ölçümün ortalamasını hesaplayın.
2. Sızıntı
   1. Bir villus seçin.
   2. Uygun Z yığını konumunu seçin (villus yüzeyi, ancak lümen mevcut zaten döken hücreleri ve diğer bileşenler ile girişim önlemek için yeterince derin). Epitel hücrelerinin/villusların toplam sayısını sayın.
   3. Sızıntı noktalarının sayısını sayın (Rhodamine dextran para-hücresel varlığı. Bu olay, önceki ve art niyetli kazanılmış resimleri kontrol ederek teyit edilebilir geçicidir).
   4. Epitel hücrelerinin sızıntı sayısını/toplam sayısını hesaplayın. 10 farklı villus/örnek/video analiz edin ve ortalama sızıntı ve geçirilebilir hücre/villus sayısını hesaplayın.

Sonuçlar

Burada sunulan protokol, bağırsak epitel kaçağı görselleştirmek ve gerçek zamanlı olarak bağırsakta hücre dökülme performansını gözlemlemek için intravital mikroskopi tabanlı bir yaklaşım açıklar. Kısaca, fareler anestezi ve ince bağırsak mukoza yüzeyini ortaya çıkarmak için cerrahi hazırlık teslim edilir. IEC'ler daha sonra acriflavine topikal uygulama ile boyanır; luminal rhodamine B-dextran lümenden alt epitel uzaya transmukozal geçişi tespit etmek i...

Tartışmalar

Teknik olarak zorlu olsa da, intravital mikroskopi tabanlı metodoloji, hücre dökülme performansı gibi son derece dinamik hücresel süreci gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için benzersiz bir deneysel yaklaşımı temsil eder. Şimdiye kadar hücre ekstrüzyonunu in vivo görselleştirmek için alternatif bir deneysel yaklaşım yoktur. Bu protokolün bağırsak homeostazının korunmasında rol oynayan çeşitli hücresel süreçlerin tanımlanmasına katkıda bulunabileceğine inanıyoruz.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acriflavine hydrochloride	Sigma Aldrich	A8251	1 mg/mL solution in PBS
Deltaphase isothermal pad	BrainTree	B-DP-PAD	-
Gemini Cautery System	BrainTree	B-GEM-5917	-
Ketamin	WDT	9089.01.00
LAS X	Leica	-	-
LSM microscope SP8	Leica	-	-
PBS	Biochrom	L182
Rhodamine B dextran	Invitrogen	D1824	10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution
Standard forceps (Dumont SS)	Fine Science Tools	11203-23	-
Straight fine scissors	Fine Science Tools	14060-10	-
Tamoxifen	Sigma Aldrich	T5648	50 mg/mL in ethanol
Xylazin	Bayer	1320422