Trakeostomi Ile İntra-Arteriyel Kan Basıncı İzleme ve Ventilasyon Kullanan Farelerde Beyin Ölümü İndüksiyonu

Özet

Katı organ nakli bağlamında patofizyolojik etkilerinin organlar ve ardışık greftler üzerindeki etkisini değerlendirmek amacıyla beyin ölümü indüksiyonunun bir murine modelini satıyoruz.

Özet

Dolaşım dan sonra hem canlı bağış hem de bağış organ nakli için alternatif fırsatlar sağlarken, donör beyin ölümü (BD) sonrası bağış hala katı nakiliçin ana kaynağı temsil etmektedir. Ne yazık ki, beyin fonksiyonunun geri dönüşümsüz kaybı birden fazla patofizyolojik değişikliklere neden olduğu bilinmektedir, hemodinamik yanı sıra hormonal değişiklikler de dahil olmak üzere, nihayet sistemik inflamatuar yanıta yol açan. Bu etkilerin in vivo sistematik bir araştırma sağlayan modeller azdır. BD indüksiyonunun allograft kalitesi üzerindeki yıkıcı etkilerinin araştırılmasına yardımcı olabilecek bir murine modeli salıyoruz. Ortak karotis arter ve trakeostomi ile güvenilir ventilasyon yoluyla intra-arteriyel kan basıncı ölçümü uygulandıktan sonra, BD bir balon kateter kullanılarak sürekli artan intrakranial basınç tarafından indüklenir. BD indüksiyonundan dört saat sonra, organlar analiz veya daha ileri nakil işlemleri için hasat edilebilir. Stratejimiz, donör BD'nin bir murine modelinde kapsamlı analizini sağlar, bu nedenle katı organ naklinde BD ile ilgili etkilerin derinlemesine anlaşılmasını sağlar ve potansiyel olarak optimize edilmiş organ ön koşullandırmasının önünü açar.

Giriş

Transplantasyon şu anda son dönem organ yetmezliği için tek küratif tedavi yöntemidir. Şimdiye kadar, beyin ölümü (BD) hastalar organ bağışları için ana kaynak olmuştur, dolaşım ölüm sonrası yaşayan bağış ve bağış değerli alternatifler olmasına rağmen¹. BD geri dönüşümsüz koma ile tanımlanır (bilinen bir nedeni ile), beyin sapı refleksleri ve apne yokluğu². Ne yazık ki, BD organları insan lökosit antijenbağımsız uzun vadeli greft sağkalım inferior sonuçlar göstermek (HLA)-uyumsuzluk ve soğuk iskemik zaman³. Bu arada, bu antijen-bağımsız risk faktörü üzerinde yoğun araştırma bd bir sonucu olarak aracılık patofizyolojik değişikliklerin üç ana yönü ile sonuçlanan yapılmıştır: hemodinamik, hormonal, ve inflamatuar⁴.

Bugüne kadar, kemirgenlerde deneysel BD modelleri çoğunlukla sıçanlar kullanılarak yapılmıştır. BD'den sonra katı organlar üzerindeki immünolojik sonuçlar hakkında daha fazla bilgi edinmek için, şu anda sadece fare modelleri genetik veya immünolojik faktörler üzerinde kapsamlı araştırmalara olanak sağlarken, BD'nin bir murine modelini oluşturmayı amaçladık. Bu bağlamda, fare sistemi analitik araçlar daha geniş bir çeşitlilik sağlar.

Burada açıklandığı gibi BD indüksiyon prensibi kafatası altına yerleştirilen bir balon kateter enflasyon uğrama kaynaklanan intrakranial basınç artışı dayanmaktadır. Artmış intrakranial basınç beyin perfüzyonu engelleyerek BD fizyolojik mekanizması taklit, beyincik, ve beyin sapı^5,6. Periferik organların yeterli perfüzyonu garanti etmek için işlem sırasında kan basıncı ölçümü zorunludur. Bu amaçla aynı zamanda kullanılan kateter sıvı ikamesi ile kan basıncını stabilize etmek için tuzlu uygulama için hizmet vermektedir. BD'ye spontan solunumun kesilmesi eşlik ettiği için yeterli ventilasyon sağlanmalıdır. Elektrikli battaniye fizyolojik çekirdek vücut ısısını korur.

Özetle, Bu model BD kaynaklı yaralanma etkisi içine derinlemesine çalışmalar sağlayacak, lökosit göç⁷, iltifat aktivasyon⁸, iskemik reperfüzyon yaralanması⁹, ve diğer faktörler.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Hayvan deneyleri, Ulusal Tıbbi Araştırma Derneği tarafından formüle edilen Laboratuvar Hayvan Bakımı İlkeleri ve Ulusal Bilim Akademisi tarafından hazırlanan ve Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak yapılmıştır (NIH Yayın No. 86-23, revize 1985). Tüm deneyler Avusturya Eğitim, Bilim ve Kültür Bakanlığı tarafından onaylanmıştır (BMWF-66.011/0071-II/3b/2012).

1. Arteriyel kateterizasyon

1. Ketamin ve ksilazin¹⁰ intraperitoneal enjeksiyon ve yerel uygulamaya göre bir analjezik ile fare anestezi (örneğin buprenorfin).  Anestezinin doğru derinliğini doğrulamak için arka ekstremiteleri forceps ile sıkıştırın.
   NOT: Bu çalışmada 8−12 haftalık erkek C57BL/6N fareler kullanıldı (ağırlık 20−25 g). Yazarlar aynı yaştaki erkek BALB/c'yi başarısız bir şekilde test etmişler ancak diğer suşları denemediler (bkz.
2. Bir elektrikli jilet kullanarak ilgi bölgelerinde (baş, boyun) saç çıkarın. Yara kontaminasyonunu önlemek için gevşek saç kalıntıları olmadığından emin olun. Daha sonra cerrahi alanı %70 etanol/klorheksidin/ betadin ile dezenfekte edin ve fare omurgasını baş cerraha bakacak şekilde yerleştirin.
3. Diseksiyon makası ile servikal orta hat kesisi yapın.
4. Submandibular bezleri ve boyun kas dokusunu inceleyin ve ortak karotis arteri ortaya çıkarmak için ayırın. Çoğunlukla forceps ile künt diseksiyon kullanın.
5. Üç yer le 8-0 sağ ortak karotis arter altında ipek ligatürler.
6. Proksimal ligatür bir kıskaç yerleştirin ve akış askıya böylece arter gerginlik getirmek.
7. En distal ligatürü kapatın.
8. Arteriyel kateteri kesiğin kraniyal kısmında ki küçük, önceden biçimlendirilmiş bir deri deliğinden takın. Sıkın ve kan geri akışını azaltmak için çok büyük görünüyorsa kateter lümen deforme. Üç bağla da sabitle.
9. Çıkık önlemek için cilde kateter sabitle. Bunu, kateteri önceden biçimlendirilmiş cilt deliği alanında cilde bağlayan bir dikiş (örn. 5-0 monofilament, emilemez) kullanarak yapın.

2. Trakeostomi

1. Ön trakeal kasları nispler kullanarak açıkça inceleyin.
2. İki 8-0 yerleştirin trakeanın altındaki ipek bağlar.
3. Tek taraflı havalandırmayı önlemek için mikro makas kullanarak mümkün olduğunca yakın trakeotomize. İki trakeal kıkırdak arasında yatay bir kesme hattı kullanın.
4. Havalandırma tüpünü takın ve her iki hazırlanan ligatürler ile fiksat.
   NOT: Trakeanın proksimal ucunun ligated edilmesigerekmez.
5. Çalışan bir dikiş ile cildi kapatın (örneğin, 6-0 monofilament, emilemez).
6. Fareyi 150/dk frekansı ve 200 μL'lik gelgit hacmi ile havalandırın.

3. Beyin ölümü indüksiyonu

1. Fareyi eğilimli konuma getirin.
2. Cerrahi makas ve cilt tutmak için forceps kullanarak kafatası deri çıkarın.
3. Sol parietal korteksin üzerinde paramedial olarak 1 mm kalibrelik bir sondaj deliği delin. İç kompakt kemiği ve dura mater'i delmeden önce delmeyi durdurun.
4. Keskin kenarları kaldırarak, künt forceps kullanarak kafatasının son doku köprü nüfuz.
5. Balon kateteri takın, böylece tamamen kafatası boşluğu içinde olur. Balonun tuzlu suyla önceden doldurulduğundan ve tüm havanın boşaltılmış olduğundan emin olun.
6. 10−15 dk (toplam hacim 0,8−1,2 mL) bir şırınga pompası yardımıyla ~0,1 mL/dk'dan başlayan enflasyona başlayın.
   NOT: Farede miyoklonus, midriazis, daha fazla nöbet aktivitesi ve agonal gasp lar yer alacaktır.
7. Farenin kuyruğu sertleştikten ve dikildikten sonra farenin beyninin öldüğünü telaffuz edin.
   NOT: BD karakteristik bir ilk kan basıncı zirvesi ile doğrulanır (Cushing refleks), beyin sapı refleksleri ve spontan solunum yokluğu. Fareler oksijen eksikliği nedeniyle dolaşım dengesiz hale gelebilir gibi düzenli apne testi deneyler sırasında kaçınılmalıdır.
8. Balon kateterinin şişirmesini durdurun.
9. Hipotermi önlemek için fare üzerine bir ısıtma battaniye sokul.

4. BD döneminde

1. Kan basıncını düzenli olarak izleyin ve belgeleyebilirsiniz. Uzun süreli hipotansif faza sahip fareleri hariç trafbe edin (ortalama arterbasıncı [MAP] < 50 mmHg for >30 dk).
2. Farenin kan basıncını dengelemek için her 30 dakikada bir 0,1 mL tuzlu su aşındırın.
   NOT: Bu çalışmada her fareye toplam 0,8 mL tuzlu luk uygulandı.
3. BD süresinin 4 saat sonra fare organları/ dokuları hasat. Farenin kalbi denemenin sonunda atmıyorsa fareyi denemeden hariç tinler.

5. Sham prosedürü

1. 1.1−3.3 adımlarını gerçekleştirin.
   NOT: İç kompakt kemiği açmayın. Balon kateteri takmayın veya şişirmeyin.
2. Fareye yakın durun ve hayvanı sürekli gözlemleyin. Anestezinin doğru derinliğini doğrulamak için arka ekstremiteleri tekrar tekrar piştürür. Farede uyanış belirtileri gösteriyorsa (başlangıç dozunun yaklaşık 1/2'si) ek anestezi uygulayın, ki bu da deneyimlerimize göre anestezi sonrası 2−3 saat sonra yaklaşık olarak gerçekleşir.
3. BD farelerde olduğu gibi intravenöz salin aynı miktarda uygulayın.
   NOT: Sahte fare ventilasyon kesildikten sonra spontan solunumu yeniden kazanır. BD fare olmaz. Apne testi modeli oluştururken yapılmalıdır, ancak deneyler sırasında gereksiz fizyolojik stres nedeniyle kaçınılmalıdır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Murine BD modeli başarıyla% 90 üzerinde bir başarı oranı ile 100'den fazla kez yapıldı. Ayrıca, kalp ve böbrek girişimsel organ nakli sonrası güvenli bir şekilde⁷gerçekleştirilmiştir.

BD bu model kullanılarak daha fazla araştırılabilir patofizyolojik değişiklikler çeşitli neden olur. Şekil 1'degösterildiği gibi, kan basıncı ilk hipertansif zirvey...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Multi-organ donörlerinde allogreft kalitesi için bir risk faktörü olan BD, in vivo modelleri kullanılarak yeterince değerlendirilebilen patofizyolojik değişiklikler gerektirir. Hemodinamik değişiklikler, sitokin fırtınası, hormonal değişiklikler ve organ grefti kalitesi ve sağkalım üzerindeki nihai etkileri in vitro⁴analiz edilemez. Temel transplantasyonun ve immünolojik araştırmaların çoğu, sadece fare modellerinde yaygın olarak bulunan gelişmiş tanı araçlarına bağl...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arterial catheter (BD Neoflon 26G)	BD	391349
Blood Pressure Transducers (APT300)	Harvard Apparatus Inc.	73-3862
Fogarty Arterial Embolectomy Catheter N° 3	Edwards Lifesciences Corporation	120403F
Forceps	FST	11271-30
Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe	Harvard Apparatus Inc.	55-7020
Ketansol	Graeub	6680110
Micro scissor	FST	15018-10
Needle holder	FST	12060-02
Prolene 5-0	Ethicon	8698H
Pump 11 Elite Infusion Only Single	Harvard Apparatus Inc.	70-4500
Scissor	FST	14075-11
Stereotactic microscope	Olympus	SZX7
Transpore Tape	3M	1527-1
Underpads	Molinea.A	274301
Ventilator for mice (MiniVent Model 845)	Harvard Apparatus Inc.	73-0043
Xylasol	Graeub	7630109