JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Isıya bağlı antijen alma ve çift immün etiketleme protokolü kullanarak formaldehit sabit ve parafin gömülü kedi kardiyojenik arteriyel trombisinde nötrofil ekstrasellüler tuzaklarını (NET) tanımlamak için bir yöntem tanımladık.

Özet

Hücresiz DNA (cfDNA) ve histones ve nötrofil elastaz (NE) gibi proteinlerden oluşan nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NETs), sistemik inflamasyon veya patojenlere yanıt olarak nötrofiller tarafından salınır. Daha önce NET'lerin pıhtı oluşumunu artırıp insanlarda ve köpeklerde fibrinolizi inhibe kleri gösterilmiş olsa da, hipertrofik kardiyomiyopatiye sekonder yaşamı tehdit eden bir komplikasyon olan kardiyojenik arteriyel tromboemboli (CATE) olan kedilerde NET'lerin rolü , bilinmemektedir. Kedilerde kardiyojenik artertrombinde NET'leri tanımlamak ve ölçmek için standartlaştırılmış bir yöntem, CATE'deki patolojik rollerini anlamamızı sağlayacaktır. Burada, nekropsi sırasında çıkarılan aort bifurkasyonu içinde formaldehit-sabit ve parafin gömülü trombi de NETs tanımlamak için bir teknik açıklanmıştır. Ksilen ile deparafinizasyon dan sonra, aort bölümleri dolaylı ısı kaynaklı antijen alma yapıldı. Daha sonra kesitler bloke edildi, permeazize edildi ve ex vivo NET'ler hücresiz DNA (cfDNA), sitilinated histon H3 (citH3) ve nötrofil elastaz (NE) immünofloresan mikroskobu kullanılarak kolokalizasyonu ile tespit edildi. Trombide Nİt'lerin immünosaptasyonuna optimize etmek için doku elementlerinin otofloresansı mikroskopi den önce otofloresan söndürme işlemi ile sınırlandırıldı. Bu teknik, diğer türlerde NETs ve tromboz çalışma için yararlı bir araç olabilir ve bu karmaşık durumun patofizyolojisi içine yeni anlayışlar sunuyor.

Giriş

Hipertrofik kardiyomiyopatisi olan kediler hayatı tehdit eden tromboembolik komplikasyonlar riski altındadır1,2. Kedi kardiyojenik artertromboemboli (CATE) ile ilişkili yüksek morbidite ve mortaliteye rağmen, KEDILERDE CATE'in altta yatan patofizyolojisi tam olarak anlaşılamamıştır. Bu yıkıcı durum riski altında kedileri tedavi etmek ve tanımlamak için sınırlı tanı ve tedavi araçları da vardır3.

Nötrofillerin doğuştan gelen bağışıklıktaki rolüne ek olarak, nötrofillerin, nötrofil elastazı (NE) ve miyeloperoksidaz gibi histones ve granüler proteinler ile kaplanmış hücresiz DNA (cfDNA) ağları olan nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NETs) serbest bırakarak trombozda rol oynadığı gösterilmiştir. Nötrofiller sistemik inflamasyona yanıt olarak NETs oluşumu, patojenler ile doğrudan karşılaşma ve aktif trombositlerileetkileşim 4,5,6,7. Köpeklerde nötrofil kaynaklı DNA'nın pıhtı lyzisini inhibe ettiği, NET proteinlerin ise pıhtı oluşumunu hızlandırdığı gösterilmiştir. NETs yeteneği sirkülasyon hücreleri ve pıhtılaşma bileşenleri tuzak da onların trombojenik özellikleri8,9,,10,11,12anahtarıdır.

NET'ler ekstrasellüler nötrofil proteinlerin, histones ve cfDNA'nın kolokalizasyonu ile saptanır. Bu nedenle, deparafinize dokuların immünororesans ile sabit dokularda NETs belirlenmesi ve nicelleştirilmesi parlak alan mikroskopisi 4 kullanarak geleneksel hematoksilin4ve eozin (H & E) leke üstündür 4,5. Immünororesans mikroskopisi kullanarak yapılan çeşitli insan çalışmaları, KORONER arter trombüsü, serebral inme trombozu, aterothrombosis ve venöz trombosit13,14,,15,1616,17yapısal bileşenleri olarak NETs tespit . Bugüne kadar, kedi trombositindeki NET'leri tespit etmek ve ölçmek için standart laştırılmış bir yöntem tanımlanmamıştır. Kedi kardiyojenik artertrombisinde NET'lerin belirlenmesi, NET'lerde ve trombozlarda gelecekteki çeviri araştırmalarını kolaylaştırabileceğinden, kedilerde parafin gömülü arteriyel trombide NET tanımlama ve değerlendirme tekniklerini açıklıyoruz.

Protokol

Burada açıklanan tüm yöntemler, Davis California Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Dokuların nekropsi ve biyopsileri sahiplerinin rızası ile yapıldı.

1. Doku fiksasyonu, katıştırma ve kesit

  1. Aort bifurkasyon dışarı diseksiyon, inen aort dahil, femoral arter, ve ortak iliak arterler(Şekil 1A), kısa bir süre sonra insancıl ötenazi veya ölüm. Blunt fasya yıkıntın (Şekil 1B) tamamen daldırma önce 10% nötr tamponlu formalin en az 24 saat ve en fazla 48 saat.
  2. Numuneyi susuz hale getirmek için ilk olarak %10 nötr tamponlu formalin ile 37 °C'ye 1 saat boyunca ısıtılır. Daha sonra, 37 °C'ye ısıtılan etanol konsantrasyonlarını (%70, %95, %100) kadar sualtında Her biri 1 saat için 2x. Son olarak, durulama olmadan, 2x 100% toluen 37 °C için 1 saat her ısıtılan batırın.
  3. 62 °C'ye ısıtılmış parafin ekleyin ve parafinin bir gecede tamamen katılamasını bekleyin.
  4. Bölüm 2-3 μm parafin gömülü doku bir mikrotom kullanarak ve pozitif yüklü cam slaytlar üzerine yerleştirin. Kesitli dokuları bir sonraki analize kadar -80 °C'de saklayın.

2. Deparafinizasyon, rehidrasyon ve ısıya bağlı antijen alımı

  1. Cam kaydıraklarda kesitlerin deparafinizasyonunu ve rehidrasyonunu gerçekleştirmek için cam slaytları raflara yerleştirin ve aşağıdaki sırayla işleyerek işlem yapın:
    1. 3 dk. Bu adımı 2x tekrarlayın için % 100 ksilen tamamen batırın. Adımlar arasında durulama yapmayın.
    2. Etanol konsantrasyonları azalan tamamen batırın (%100, %95, %70) oda sıcaklığında (RT), 3 dk her biri için 3x. Adımlar arasında durulama yapmayın.
    3. 2 dk. Tekrarlayın, tamamen deiyonize suya batırın.
  2. Bölümleri 2-3 dakika boyunca % 0,1 Ara (TBST, pH = 7,6) ile Tris-tamponlu tuzlu içine yerleştirin.
  3. Rezervuarı 100 °C'ye ısıtılan deiyonize su ile doldurun. Vapur odasının 20 dk boyunca dengede olmasını bekleyin.
    NOT: Isıya bağlı antijen alımı en iyi, bir gıda buharı gibi önceden ayarlanmış sıcaklık ayarına sahip bir buharlı tarafından üretilen dolaylı ısıtma ile gerçekleştirilir.
  4. Tris ve EDTA (pH = 9) içeren ticari olarak kullanılabilen antijen alma çözeltisini sıcaklık kontrollü bir sıcak plaka üzerinde 95-97 °C'ye sürekli karıştırarak ısıtın. Kaynamadığından emin olun.
    NOT: Çözelti ısındıktan sonra bulutlu olmalıdır.
  5. Isıtılan antijen alma çözeltisini bir slayt kabına dökün ve kabı buhar odasına yerleştirin. Antijen alma çözeltisinin 3-4 dakika boyunca buharlının sıcaklığını dengelemesine izin verin.
  6. Isıtmalı antijen alma çözeltisi tamamen slaytlar batırın ve 20 dakika boyunca buharlı ile harici ısıtma uygulamasıdevam.
  7. Slayt kabını buharlı yerden çıkarın ve slaytların ve antijen alma solüsyonunun RT'ye soğumasını bekleyin. Seyreltilmiş antijen alma çözeltisini 4 °C'de saklayın ve gerekirse 2 kata kadar yeniden kullanın.
  8. 5 dakika tbst ile slaytlar 3x yıkayın.

3. İmmünetiketleme ve otofloresan söndürme

NOT: Tablo 1, aşağıdaki adımlarda kullanılan engelleme arabelleklerinin bileşimini ayrıntılarıyla anlatır.

  1. Nazik sallanan altında RT 2 saat için Tampon 1 Engelleme inkübat bölümleri (30-50 rpm). Kurumasını önlemek için parafin film ile mühür.
  2. Yıkamadan, hemen 100 μL seyreltilmiş tavşan poliklonal anti-insan sitülilinated histon H3 (citH3) antikor (0.03 mg/mL bloke tampon seyreltilmiş 1) doğrudan slayt üzerine uygulayın.
  3. Antikor karışımının eşit şekilde dağıtılmasını sağlamak için her bölüme bir kapak kayması (24 mm x 40 mm x 0,13-0,17 mm) yerleştirin.
  4. 4 °C'de 12-16 saat boyunca hafif sallanan (30-50 rpm) inkübat. Kurumasını önlemek için parafilm filmi ile mühürleyin.
  5. 5 dakika TBST ile 3x yıkayın.
  6. Adım 3.3'te açıklandığı gibi Alexa Fluor 488'e (0.04 mg/mL veya Bloklama Tampon1'de 1:50'lik son konsantrasyona seyreltilmiş) 100 μL keçi anti-tavşan antikor uygulayın. Nazik sallanan altında RT 1 saat için kuluçka (30-50 rpm). Slaytları ışıktan koruyun.
  7. 5 dakika TBST 3x ile yıkayın.
  8. Bloklama Tampon 2'deki inkübasyon bölümleri gece boyunca 4 °C'de hafif sallanan (30-50 rpm) altında. Işıktan koruyun.
  9. 5 dakika TBST 3x ile yıkayın.
  10. Blok Buffer 3 blok bölümleri olarak adım 3.3 rt 2 saat nazik sallanan altında (30-50 rpm) açıklanmıştır.
  11. Biyotinylated poliklonal tavşan anti-insan NE antikor (son konsantrasyon = 0.2 μg/mL Engelleme Tampon 3) ile inkübat bölümleri 4 ° C için 12-16 h adımlar 3.2-3.4 açıklandığı gibi.
  12. 5 dakika TBST 3x ile yıkayın.
  13. Alexa Fluor 594 streptavidin konjuge ile incubate (1:100 veya 0.02 mg/mL Blokaj Tampon 3) adımlarında açıklandığı gibi 3.2-3.3 için 1 saat RT. Kurumasını önlemek için ışık tan koruyun ve parafin ile mühür.
  14. 5 dakika TBST 1x ile yıkayın.
  15. 100 μL otofloresan söndürme çözeltisi karışımını üreticinin talimatıyla 1 dk boyunca doğrudan bölümlere uygulayın.
  16. Slaytları hemen TBST 6x ile 10 dk yıkayın.
  17. Her slaydı karanlıkta 5 dakika boyunca 100 μL 300 nM DAPI ile kapatın.
  18. 3 dk. TBST ile yıkayın 5x toplam bu tekrarlayın.
  19. Bir damla (~50 μL) antifade montaj ortamı, otomatik floresan söndürme kitinin bir parçası, doğrudan bölümü çevreleyen cam slayt üzerine uygulayın. Herhangi bir kabarcık oluşturmadan bir kapak kaymasını (24 mm x 40 mm x 0,13-0,17 mm) yavaşça bölümün üzerine yerleştirin.
  20. Montaj ortamı daldırma lensleri ile mikroskobik analiz için sertleşene kadar numunelerin karanlıkta bir gecede 4 °C'de tedavi edilmesine izin verin.

4. Nötrofil ekstrasellüler tuzak tanımlama

NOT: Aşağıdaki protokol, 1.280 x 960 dijital CCD fotoğraf makinesine sahip ters epifloresan mikroskobu kullanır (bkz.

  1. Trombüs bulmak için, aort uzunluğu boyunca caudally için cranially tetkik, aort bifurkasyon, ve her femoral arter 10x amacı ile faz kontrast mikroskopisi kullanarak. Trombüs, evre kontrastı ve parlak alan mikroskobunda endotel'e bitişik kırmızı kan hücreleri, beyaz kan hücreleri ve trombositiçeren dokuların bir araya edilmesidir(Şekil 2A, Şekil 2B).
  2. İlk olarak 10x ve 20x hedefleri(Şekil 2C)ile DAPI kanalını (uyarma = 357/44 nm) kullanan NET'ler için bölümleri inceleyin. Faz kontrastı veya parlak alan mikroskobunda görüldüğünde cfDNA'nın bir hücrenin sitoplazmasının sınırları içinde olmayan yoğuşmuş DNA olarak göründüğünü unutmayın.
  3. Texas Red kanallarında (uyarma = 585/29 nm, emisyon = 628/32 nm) ve yeşil floresan protein kanalı (uyarma = 470/22 nm, emisyon = 525/50 nm) sırasıyla 10, 20 ve 40x hedefleri ile ekstrasellüler NE ve citH3 tanımlayın.
  4. Image J (NIH) gibi kullanılabilir yazılımları kullanarak trombüs içindeki NET'leri değerlendirin ve analiz edin. NET oluşumu cfDNA, hücre dışı citH3 ve NE'nin daha önce açıklandığı gibi18'inkolokalizasyonuna göre tanımlanır. Piksel yoğunluğunda doygunluğu önlemek için görüntülerin edinimi boyunca her kanalın tutarlı pozlama süresini ve kazançlarını koruyun.
  5. Her trombüs, aorta en yakın Bölge 1, aorttan en uzak Bölge 3 ve Bölge 2'yi Bölgeler 1 ve 3'e kadar üç eşit bölgeye bölerek alçalan aorta olan yakınlığına göre haritala. Operatör her deneğin tıbbi durumuna kör ile, her bölgede en az on rasgele alanlar almak. Trombüsdeki NET'lerin dağılımını, her bölgede NET'li alanların ortalamasını alarak veya bölge başına ortalama NET işgal alanını hesaplayarak karakterize edin.

Sonuçlar

Bu protokolü deparafinizasyon, ısıya bağlı antijen alımı ve parafin gömülü trombinin çift immünetiketlemesi için kullanarak, kedi CATE'de ilk kez NET'leri tespit ettik. Aort bifurkasyonu içinde trombüs, standart H&E boyama ve faz kontrast lı mikroskopi kullanılarak floresan mikroskobu ve parlak alan mikroskobu ile saptandı. Parlak alan mikroskobunda kedi artertrombisi kırmızı kan hücreleri, lökositler, fibrin ve trombositlerden oluşuyordu(Şekil 3A). H&E belirli NET b...

Tartışmalar

Biz bir çift immünetiketleme protokolü ve immünororesans mikroskopisi kullanarak sabit kedi kardiyojenik arteriyel trombosit NETs tanımlamak için bir protokol açıklar. Sadece kardiyojenik arteriyel trombüs lekelenmiş olmasına rağmen, teoride bu protokol diğer trombüs türleri ve diğer veteriner türleri için kullanılabilir. Kedi artertrombinindeki NET'lerin belirlenmesi, kedilerde trombozda NET'lerin rol oynayabileceğini düşündürmektedir.

Sabit ve parafin gömülü dokuda...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Çalışma, Kaliforniya Üniversitesi, Davis, Companion Animal Health Merkezi 'nden (CCAH 2018-30-F) gelen fonlar tarafından desteklendi. Yazarlar floresan mikroskobun kullanımı için Dr Kevin Woolard kabul etmek istiyorum.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)Life Technologies CorporationD1306
Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugateThermoFisher ScientificCatalog # S11227
Anti-citrullinated histone H3 antibodyAbcamAb5103
EVOS FL Cell Imaging SystemThermoFisher ScientificAMEFC4300
EVOS Imaging System Objective 10xThermoFisher ScientificAMEP4681NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm
EVOS Imaging System Objective 20xThermoFisher ScientificAMEP4682NA 0.40, WD 6.8 mm
EVOS Imaging System Objective 40xThermoFisher ScientificAMEP4699NA 0.75, WD 0.72 mm
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibodyThermoFisher ScientificCatalog # A32723
Goat serumJackson Immuno Research LabsCatalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121
Neutrophil elastase antibodyBioss AntibodiesBs-6982R-BiotinRabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated
NP40PierceProduct # 28324. Lot # EJ64292
Positive charged microscope slidesThomas ScientificManufacturer No. 1354W-72
Rabbit serumLife TechnologyCatalog # 10510
Target Retrieval SolutionAgilent DakoS2367TRIS/EDTA, pH 9 (10x)
TrueVIEW Autofluorescence Quenching KitVector LaboratoriesSP-8400

Referanslar

  1. Maron, B. J., Fox, P. R. Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats. Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, 6-9 (2015).
  2. Payne, J. R., et al. Prognostic indicators in cats with hypertrophic cardiomyopathy. Journal of Veterinary Internal Medicine. 27 (6), 1427-1436 (2013).
  3. Borgeat, K., Wright, J., Garrod, O., Payne, J. R., Fuentes, V. L. Arterial Thromboembolism in 250 Cats in General Practice: 2004-2012. Journal of Veterinary Internal Medicine. 28 (1), 102-108 (2014).
  4. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews. Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
  5. Goggs, R., Jeffery, U., LeVine, D. N., Li, R. H. L. Neutrophil-extracellular traps, cell-free DNA and immunothrombosis in companion animals: A review. Veterinary Pathology. , 300985819861721 (2019).
  6. de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H & E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
  7. Li, R., Tablin, F. A Comparative Review of Neutrophil Extracellular Traps in Sepsis. Frontiers in Veterinary Sciences. 5 (291), (2018).
  8. Borissoff, J. I., et al. Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 2032-2040 (2013).
  9. Moschonas, I. C., Tselepis, A. D. The pathway of neutrophil extracellular traps towards atherosclerosis and thrombosis. Atherosclerosis. 288, 9-16 (2019).
  10. Perdomo, J., et al. Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia. Nature Communications. 10 (1), 1322 (2019).
  11. Li, B., et al. Neutrophil extracellular traps enhance procoagulant activity in patients with oral squamous cell carcinoma. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 145 (7), 1695-1707 (2019).
  12. Li, R. H. L., Tablin, F. In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58083 (2018).
  13. de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H&E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
  14. Farkas, &. #. 1. 9. 3. ;. Z., et al. Neutrophil extracellular traps in thrombi retrieved during interventional treatment of ischemic arterial diseases. Thrombosis Research. 175, 46-52 (2019).
  15. Qi, H., Yang, S., Zhang, L. Neutrophil Extracellular Traps and Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis and Thrombosis. Frontiers in Immunology. 8, 928 (2017).
  16. Laridan, E., et al. Neutrophil extracellular traps in ischemic stroke thrombi. Annals of Neurology. 82 (2), 223-232 (2017).
  17. Laridan, E., Martinod, K., Meyer, S. F. D. Neutrophil Extracellular Traps in Arterial and Venous Thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
  18. Li, R. H. L., Johnson, L. R., Kohen, C., Tablin, F. A novel approach to identifying and quantifying neutrophil extracellular trap formation in septic dogs using immunofluorescence microscopy. BMC Veterinary Research. 14 (1), 210 (2018).
  19. Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
  20. Moelans, C. B., Oostenrijk, D., Moons, M. J., van Diest, P. J. Formaldehyde substitute fixatives: effects on nucleic acid preservation. Journal of Clinical Pathology. 64 (11), 960-967 (2011).
  21. Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (3), 300-306 (2004).
  22. Willingham, M. C. An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 31 (6), 791-798 (1983).
  23. Davis, A. S., et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 62 (6), 405-423 (2014).
  24. Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. Journal of Investigative Medicine: The Official Publication of the American Federation for Clinical Research. 47 (6), 326-332 (1999).
  25. Hirsch, R. E., Zukin, R. S., Nagel, R. L. Intrinsic fluorescence emission of intact oxy hemoglobins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 93 (2), 432-439 (1980).
  26. Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
  27. Mosiman, V. L., Patterson, B. K., Canterero, L., Goolsby, C. L. Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in-situ method. Cytometry. 30 (3), 151-156 (1997).
  28. Ducroux, C., et al. Thrombus Neutrophil Extracellular Traps Content Impair tPA-Induced Thrombolysis in Acute Ischemic Stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve EnfeksiyonSay 157imm nororesans mikroskopisisitr llinated histon H3n trofil elastazarteriyel trombozkedi hipertrofik kardiyomiyopati

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır