Perfüzyonlu Mikroakışkan Platformda Hasta Kaynaklı Ksenogreftlerin Ex vivo 3D Hidrojel Kültürleri için Geliştirilmiş Canlılık

Özet

Bu protokol, hasta kaynaklı ksenogreftlerin (PDX) genişletilmiş in vitro kültürünü mümkün kılacak yöntemleri göstermektedir. Bir adım, 3D hidrojellerde çok hücreli küme kültürlerinin genel canlılığını, canlı olmayan tek hücrelerin doğrudan çıkarılması yoluyla artırır. İkincibir adım, pdx kültürü için en iyi uygulamaları perfüzyonlu mikroakışkan bir platformda gösterir.

Özet

Hasta kaynaklı ksenogreftler (PDX), rezeke edilen hasta tümör dokusu doğrudan immünazatlı farelere aşılandığında ortaya çıkan, biyolojik olarak stabil kalır, böylece moleküler, genetik ve histolojik özelliklerin yanı sıra orijinal tümörün heterojenliği de korur. Ancak, bu modellerin uyuşturucu taraması da dahil olmak üzere çok sayıda deney icra etmek için kullanılması hem maliyet hem de zaman açısından engelleyicidir. Üç boyutlu (3D) kültür sistemleri yaygın olarak kanser hücrelerinin biyokimyasal etkileşimler, morfoloji ve mimari yoluyla biyolojik bütünlüklerini korudukları platformlar olarak görülür. Ekibimiz hyaluronik asit (HA) oluşan 3D matrisler kullanarak in vitro PDX hücreleri kültürleme geniş bir deneyime sahiptir. PDX'lerle ilişkili fare fibroblaststromal hücrelerini ayırmak için, stromal hücrelerin doku kültürü yle tedavi edilmiş plakaların yüzeyine yapıştığı, ayrıştırık PDX tümör hücrelerinin yüzdüğü ve çok hücreli kümelere kendi kendini bağdaştırdığı rotasyon kültürünü kullanıyoruz. Ayrıca supernatant yüzen tek, genellikle ölü hücreler, hangi 3D hücre kültürü için hidrojeller içine aşağı kapsülleme için canlı PDX kümeleri toplama bir sorun mevcut. Bu tek hücreleri canlı hücre kümelerinden ayırmak için yoğunluk adım gradyan santrifüj uyguladığız. Burada açıklanan protokol, daha fazla in vitro deney için kullanılacak hücre kümelerinin sağlıklı popülasyonundan canlı olmayan tek hücrelerin tükenmesine olanak sağlar. Çalışmalarımızda, kültür sırasında medya perfüzyonuna olanak sağlayan mikroakışkan plakalara 3Boyutlu kültürleri dahil ediyoruz. Arınmış ve saflaştırılmayan hücrelerin floresan görüntü tabanlı canlılık tahsini kullanılarak ortaya çıkan kültürleri değerlendirdikten sonra, elde edilen sonuçlar, bu ek ayırma adımının kültürlerimizden canlı olmayan hücrelerin sayısını önemli ölçüde azalttığını göstermektedir.

Giriş

Son on yılda, kanser araştırma alanı hasta kaynaklı ksenogreftler için yenilenen coşku göstermiştir (PDXs) kanser hücre yolu güven ve ilaç duyarlılık değerlendirmek için bir araç olarak¹. En sık görülen PDX modelleri insan tümör hücrelerinin deri altı veya ortotopik implantasyonu ile kurulur-bir tümör parçası, ayrışmış tümör türevi hücrelerin bir küme, ya da izole dolaşan tümör hücrelerinin bir örnek (CtCs)—bir kemirgen konak içine. Tümör "almak" başarılı olursa, ksenogreft hücreleri çoğalır, vaskülarite, ve aksi takdirde bir tümör oluşturmak için konak doku ile etkileşim, hangi optimal boyutta hasat edilebilir, bölünmüş, ve diğer konakiçine yeniden implante. Bir model sistemi olarak birçok avantajları arasında, PDXs genellikle yerli tümör hücre nüfusunun heterojenlik önemli bir kısmını korumak ve insana özgü yollar ve hücre yanıtları değerlendirilmesi sağlamak^2,3. In vivo bağlam vaskülatür ve diğer komşu stroma ile tümör etkileşimi sağlar ve ilaç difüzyon dinamikleri gibi doku özellikleri recapitulates, oksijen gerginliği, ve ekstrasellüler matriks etkisi biyolojik ve mekanik tümör ilerlemesini etkiler. PDXs olumsuz bir yönü bir kemirgen konak onların güven, tümör genişlemesi için hem de sonuçta hipotez testi için. Birçok PDX'ler, arzu edilen özelliklerinin çoğunu kaybetmeden doku kültürü polistiren geleneksel iki boyutlu (2D) kültüre adapte olamayacağından, bu nispeten kontrollü in vitro yöntemi ile in vivo PDX kullanımı için gider, tesis ve zaman gereksinimlerindeki önemli artış arasında araştırmacılar için en az orta zemin olmuştur.

Biz destekleyici bir matris içinde 3D hücre kültürü uygulamak birden fazla in vitro modelleri tarif ettik, ve son zamanlarda birden fazla prostat kanseri ex vivo kültürünü göstermek için bu işi genişletti (PCa) türetilmiş PDXs, hem tek başına ve kemik iliği kaynaklı fibroblastlar ile co-kültür^4,5. Hyaluronik asit (HA) bazlı hidrojel matrisler, hidrojel^derinliği6 ile görüntüleme için hidrojel özellikleri ve optik netlik üzerinde kolay kontrol ile, her iki hücre tipleri için özelleştirilebilir ve biyolojik olarak ilgili destek sağlar.

Olgun PDX tümör dokuları heterojen insan kanser hücreleri ve fare stroma (fibroblastlar, endotel hücreleri, vb) değişken bir karışımını oluşturmaktadır. İn vitro tümör ilerlemesiiçin hücre tipi spesifik katkıları incelemek için, tümörleri ayırmak, hücre popülasyonlarını ayırmak ve deneysel olarak hücreler arası iletişim yollarını ayırmak için düzenli bir şekilde birleştirmek avantajlı olabilir. Doku digestates içinde karışık hücre popülasyonları belirli kültür koşulları ile diferansiyel uyumluluk var. Örneğin, tümörle ilişkili fibroblast canlılığı ya yüzey ekibe veya integrin ligandlarla işlevsel 3D matrisler gerektirirken, epitel kaynaklı PDX hücreleri genellikle bu gereksinimlere sahip değildir, bunun yerine hücre-hücre etkileşimlerini tercih eder. Bu farklılıklar, PDX hücrelerinin fare stromal hücrelerini kontamine olmaktan etkin bir şekilde ayrılmasını sağlamak için kullanılabilir. Doku digestates rotasyon kültürü doku-hücre yapışıklıkları 24−48 h supernatant çok hücreli kümeler oluşturmak için dönen kültür yüzeyinin üzerinde yüzen PDX hücreleri sürücü ise doku kültür yüzeyine stromal hücre yapışmasını sağlar. Bu kümelerin özel özellikleri PDX'e (örn. büyük, sıkı, yüksek küresel kümeler veya üzüm demetlerini andıran daha küçük, daha gevşek agregalar) göre değişir, ancak genellikle biyolojik olarak ilgili boyutlardadır (50−250 μm çapında), hücreler arası temaslara dayanan hücresel etkileşimleri değerlendirmek için yeterlidir.

Tümör alımı ve işlenmesi kaçınılmaz olarak, mekanik/enzimatik bozulmadan kaynaklanan kısa süreli hasar veya alt popülasyonların seçilen kültür koşullarıyla uzun süreli uyumsuzluğu nedeniyle kaçınılmaz olarak bir miktar teminat hücre ölümüyle sonuçlanır. İlk toplu ayırma olarak rotasyon kültürünün yararına rağmen, ölü veya ölmekte olan hücreler kaçınılmaz olarak PDX kümeleri ile aktarılır ve ortaya çıkan kültürü etkileyebilir. Bu ölü hücreler genellikle bir kümeye entegre olmayan tek tek PDX hücreleri, seçili kültür koşullarında yaşayamayan fare stromal fibroblastları veya özellikle kırılgan endotel hücreleridir. Bu tür ölmekte olan hücreler "hayatta kalanların" deneysel sonuçlarını etkileyebilir ve floresan görüntü tabanlı canlılık tarama testlerinden sayısallaştırmayı önemli ölçüde etkileyebilir. Bu yöntemden canlı PDX hücrelerinin seçimini iyileştirmek için, PDX karışımlarından tek tek ölü/ölmekte olan hücreleri kolayca çıkarmak ve ağırlıklı olarak canlı çok hücreli kümeleri korumak için yoğunluk adımlarıyla santrifüj yöntemlerini uyarladık.

3D kültürde ortaya çıkan PDX kaynaklı kümelerin çalışmasını geliştirmek için, mikroakışkan tabanlı perfüzyon kültür platformu organoPlate(Şekil 1),96 kişiye kadar özel perfüzyon, 3D kültürlerin 384 kuyudaki mikrotiter plaka tabanı(Şekil 1A) 7^7,8' e kadar eşzamanlı kültüre olanak tanıyan yüksek işletilmiş bir organ-on-a-chip platformundan yararlandık. 2 şeritli mikroakışkan plakada, tek bir doku çipi iki mikroakışkan kanalla bağlanır(Şekil 1B, jel kanal: kırmızı, perfüzyon kanalı: mavi) üst üste dört kuyuya yayılan. İki mikroakışkan kanal, komşu komşu kanaliçine bir kanal taşmasını önler phaseguide denilen kısa bir plastik sırt ile ayrılır, ve aynı anda jel ve perfüzyon kanal⁹içeriği arasında bir membran-free arayüzü sağlar . Mikroakışkan plakanın alt kısmı mikroskop sınıfı camdan oluştuğu için, kültürler standart veya otomatik mikroskopla plakanın alt kısmından gözlem penceresinden görülebilir. Perfüzyon, mikroakışkan plaka içinde programlanabilir bir rocker ile kurulur, mikroakışkan kanallar aracılığıyla medya sürücü yerçekimi kullanarak, rezervuar kuyuları arasında(Şekil 1C). Perfüzyon akışı-mimik daha yakından statik kültüre göre tümör mikroortamı özetler, kesme stresi ve gazve besin lerin gelişmiş dağılımı dahil edilmesine olanak sağlar. Mikroakışkan plaka bir perfüzyon kanser hücresi kültürünün korunmasının yararları daha önce aynı hücrelerin statik 3D kültür ile karşılaştırıldığında optimum canlılık sergilenen perfüzyon meme kanseri kültürleri olarak tarif edilmiştir⁷.

Bu rapor, canlı çok hücreli PDX kümelerini yalıtmak için uyarlanmış bir yoğunluk gradyan santrifüj yöntemini açıklar ve perfusable mikroakışkan plakalar içinde 3D PDX kültürleri oluşturmada yarar göstermektedir. Giderek artan sayıda araştırma laboratuvarı PDX kullanımını kolaylaştırmak için yöntemler aradığından, burada sunulan protokollerin hemen faydalı olacağını öngörüyoruz.

Protokol

Tümör dokusu hasta onayı ile ve onaylı Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) protokolüne göre elde edildi. Ksenogreftler kabul edilen Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) protokolüne göre implante edildi, büyüdü ve hasat edildi.

NOT: Tüm çalışmalar steriliteyi korumak için steril bir biyolojik güvenlik kabininde yapılmalıdır. Aksi belirtilmedikçe tüm adımlar oda sıcaklığında yapılmalıdır.

1. PDX işleme için malzemelerin hazırlanması

1. Otoklav forceps ve neşter sapı veya jilet.
2. Doku dissosiyasyonu ile aynı gün 4 °C'de veya oda sıcaklığında çözülme enzim çözeltisi.
   NOT: 37 °C'de erime tavsiye edilmez, çünkü bu bazı dissosiasyon enzimlerini inaktive edebilir.
3. En az 100 mL PDX kültür ortamı (Dulbecco'nun modifiye Kartal orta besin karışımı F-12 [DMEM-F12] ile 100 U/mL penisilin ve streptomisin hazırlayın ve % 30 fetal sığır serumu [FBS]) ve en az 25 mL PDX işleme ortamı (DMEM-F12 ile 100 U/mL penisilin ve streptomisin ve FBS yok). Kullanıma hazır olana kadar 4 °C'de saklayın.

2. STROMAL KOMPONENTIN PDX ayrışması ve ilk saflaştırılması

1. Otoklavlı gereçler, 70 μm hücreli süzgeçler (2−3), 60 mm yuvarlak doku kültürü tabakları (2), 6 kuyulu doku kültür tabakları, steril 50 mL konik santrifüj tüpler ve steril 1x fosfat tamponlu salin (PBS) toplayın. 37 °C'ye kadar sıcak kültür orta ve dissosilasyon enzim çözeltisi oda sıcaklığına gelmesine izin verir.
2. PDX dokusu bir fare konakçısında 1,0−1,5 cm çapa ulaştığında, tümörü standart yollarla (örn. kabul edilmiş anestezi altında) cerrahi olarak fareden çıkarın ve PDX kültür ortamına sahip 50 mL'lik bir tüpte buz üzerinde saklayın(Şekil 2A). Dokuhemen, aşağıdaki adımlar aracılığıyla, hücre canlılığını maksimize etmek için, tercihen içinde 1−2 saat hasat tan sonra.
3. Tümör dokusunu önceden tartılmış steril 50 mL konik tüpe aktarın. Kan ve kirleticimaddeleri çıkarmak için 30 mL steril PBS ile 6x durula. Mümkün olduğunca çok sıvı çıkarın ve tümör dokusu tartmak.
4. Tümör dokusunu 60 mm'lik yuvarlak doku kültür yemeğine aktarın ve steril bir jilet veya neşter kullanarak ~1 mm³ adet ekibe bölün.
5. Tümör bulamacı toplamak ve yeni bir steril 50 mL tüp transfer etmek için PDX işleme ortamı 5 mL ekleyin. Kültür çanamasını 5 mL daha PDX işleme ortamıile durulayın, ardından dissosiyasasyon enzim solüsyonu (10 mL/g tümör, en az 5 mL) ile tüm durulamaları 50 mL tüpe ekleyin.
6. 37 °C'de 20 dk inkübün. Tüpü kuluçka süresinin yarısına kadar yavaşça döndürün.
7. Pipet yukarı ve aşağı yavaşça bir serolojik pipet ile kümeleri kırmak için. Yeni bir steril 50 mL tüp üzerine yerleştirilen 70 μm hücreli süzgeçli filtre hücreleri.
   NOT: Birden fazla süzgeç gerekebilir.
8. Pelet hücrelerine 5 dk için 200 x g santrifüj. PDX kültür ortamının 2−3 mL'inde süpernatant'ı çıkarın ve yeniden askıya alın. Hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın.
9. Yonga başına istenilen hücre yoğunluğunu elde etmek için gerekli ayrıştırılmış PDX türevi hücrelerin sayısını tahmin etmek için Tablo 1'i kullanın.
   NOT: Tablo 1'deki değerler bir başlangıç noktası olarak tasarlanmıştır. Gerçek değerler doku canlılığına/hücreselliğine ve donma/iyileşmeden kaynaklanan hücre kaybına bağlı olarak değişir. PDX tümörleri belirli bir kanser tipi içinde bile bireylerdir, bu nedenle bu değerler ampirik olarak ayarlanmalıdır.
10. Adım 2.9'da hesaplanan sayının 1−2 x 10⁶ hücresi, PDX kültür ortamının 5 mL'lik 6 kuyulu doku kültür plakası başına. Küme oluşumunu teşvik etmek için 48 saat boyunca (50−55 rpm) inkübat (37 °C, %5 CO_2,%95 nem)(Şekil 2B). Küme oluştuktan sonra, santrifüj için bölüm 3'e devam edin.
11. Cryopreserve kullanılmayan PDX hücreleri ilk ayrışmadan %50 FBS + %40 DMEM-F12 + %10 dimetil sülfoksit (DMSO) veya ticari olarak mevcut bir birincil hücre dondurma ortamı.
    NOT: Yapışık fare stromal hücreleri de doku plakası yüzeyinden, istenirse, kültür ortamı ile kısa bir süre durulanarak ve standart yollarla genişletilerek geri kazanılabilir.
12. Daha sonra kriyoslü PDX tümör hücrelerinin/fare stromasının kullanımı için, 37 °C'lik su banyosundaki hücreleri 2 dk eritin. Bölüm 3'e geçmeden önce adım 2.10'da açıklandığı gibi 6 kuyulu doku kültürü plakasında kont ve plaka. Kriyopreservation canlılık kayıpları karşılamak için ~% 20 oranında PDX hücrelerinin sayısını artırın.

3. PDX'ten türetilmiş kümelerin tek hücrelerden yoğunluk gradyan santrifüj esaslı ayrılması

1. Steril 50 mL konik tüpte 18 mL yoğunluk gradyan santrifüj çözeltisi ile 2 mL steril 10x Hanks'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ile iyice karıştırarak 20 mL %100 yoğunluk gradyan çözeltisini hazırlayın. Bu %100 çözeltiyi steril 1x HBSS ile seyrelterek ve iyice karıştırarak %20, %30, %40 ve %55 yoğunluk gradyan çözeltilerinin her biri 10 mL yapın.
   NOT: Bu hacimler, her biri ~15 x 10⁶ hücreyi ayırmak için kullanılabilecek iki adet 15 mL degrade için yeterlidir. ~15 x 10⁶ hücreden daha az ayırıyorsa, ikinci degrade santrifüj için bir denge olarak kullanılmalıdır.
2. 15 mL konik tüpün altına 3 mL %55 yoğunluk gradyan çözeltisi ekleyin. Tüpü bir açıda tutarak, %55'lik katmanın üzerine %40 yoğunluk gradyan çözeltisinin 3 mL'sini çok hafifçe katlayarak, katmanların karışmasını önlemek için sıvıyı tüpün açılı tarafına yavaşça dağıtın. %30 yoğunluk gradyan çözeltisi ile tekrarlayın.
3. 5 mL serolojik pipet ile PDX rotasyon kültürlerinin süpernatantını toplayın, plaka yüzeyini hafifçe durulayın. Pelet hücrelerine 2 dk için 200 x g santrifüj.
4. Supernatant çıkarın ve hücreleri ayırmak için gerekli degrade sayısına göre% 20 yoğunluk gradyan çözeltisi 3 mL hücre pelet resuspend. %20 yoğunluk gradyan çözeltisini hücrelerle birlikte degrade(ler) üstüne dikkatlice katlayın. Hücreler için sadece bir degrade tüp kullanıyorsanız, denge gradyan tüp hücre içermeyen 20% yoğunluk gradyan çözeltisi ile üst.
5. 4 °C, 2.000 x gve 0 fren 30 dakika için bir salıncak kova rotor santrifüj tüpler ve santrifüj kapağı.
6. Santrifüjden sonra kesirler görünür olacaktır (Şekil 2C). 2−3 mL kesirleri taze 15 mL tüpler halinde toplayın. Her fraksiyona 3−4 hacim steril 1x HBSS ekleyin ve iyice karıştırmak için ters çevirin.
7. Pelet hücrelerine 3 dk için 1.000 x g santrifüj. Supernatant'ı çıkarın ve pdx işleme ortamının 1−2 mL'inde hücre peletini yeniden askıya alın.
   NOT: Uygulanabilir PDX hücre kümeleri genellikle test edilen çoğu PDX için %20−40 yoğunluk gradyan çözüm arabiriminde biriken tek ölü/ölmekte olan hücrelerle %40−55 yoğunluk gradyan çözüm arabiriminde(Şekil 2D)bulunur.
8. Kümelenmiş hücre süspansiyonundaki hücre sayısını değerlendirmek için eşit hacimli dissosiasyon enzim çözeltisi ile yeniden dissosilasyon için küçük, temsili bir aliquot (50−100 μL) çıkarın. Hemositometre veya otomatik hücre sayacı olan hücreleri sayın.

4. Hidrojel hazırlama ve mikroakışkan plaka tohumu

1. HA hidrojel çözeltilerini (tiyol-modifiye HA, HA-SH; tiol-reaktif polietilen glikol diakrülat, PEGDA) üreticinin talimatlarına göre yeniden oluştur.
2. Çok kanallı bir pipet kullanarak, kültür nemini ve optimum görüntüleme koşullarını korumak için 2 şeritli mikroakışkan plakanın gözlem penceresi sütunlarında (sütun 3, 7, 11, 15, 19, 23) tüm kuyulara 50°L HBSS ekleyin.
3. 50 μL hidrojel için gerekli olan bölüm 3'teki hücre süspansiyonunun hacmini istenilen hücre yoğunluğunda (yani 5.000 hücre/μL) hesaplayın. Bir mikroakışkan plaka tohumlama için, hesaplanan hacmi 4 steril 1,5 mL santrifüj tüpün her birine yerleştirin.
   NOT: HA hidrojellerin jelleşme için sabit bir zamanı vardır. Erken jelleşme oluşursa dağıtımda kullanıcı verimliliği için jel çözeltisi aliquots hacmini ayarlayın.
4. KULLANMADAN hemen önce 1 N NaOH ile HA-SH çözeltisinin pH'ını 8.0'a ayarlayın. 40 μL'lik HA-SH'yi 10 μL PEGDA ile karıştırarak ve zaman içinde jelasyonu izleyerek bir test jelasyonu gerçekleştirin. Jelasyon genellikle PEGDA crosslinker ile HA-SH karıştırıldıktan sonra 5−8 dakika başlar.
5. Pelet hücrelerine 2 dk (200 x g, oda sıcaklığı) için santrifüj hücre süspansiyon aliquots. Ha-SH'nin uygun hacmindeki süpernatant ve resuspend hücreleri dikkatlice çıkarın.
   NOT: Son hidrojel 4:1 HA-SH:PEGDA çözeltisi (hacim olarak) olduğundan, hücreler 40 μL HA-SH'de 50 μL son hacim için yeniden askıya alınmalıdır.
6. HA'daki bir hücreye 10 μL PEGDA ekleyin. İyice karıştırın ve mikroakışkan plaka tohumlama dan önce 1−3 dakika bekleyin (adım 4.4 jelleşme süresine bağlı olarak).
   NOT: Tohumlamadan önce başlamanın jelleşme reaksiyonuna izin vermek hücre yerleşmesini en aza indirmeye yardımcı olur.
7. HA hidrojel çözeltisindeki hücrelerle tek bir kanal tekrarlayan pipet ve yük için 1,5 μL hacimdağıtmak için bir ipucu yapıştırın. Hatta hücre dağılımı sağlamak için iyi karışık hydrogel aliquot tutmayı unutmayın.
8. Mikroakışkan plakayı tohumlamak için pipet ucunu plakaya dik olarak hizalarken ucu jel girişinin ortasına (sütun 1, 5, 9, 13, 17, 21) yerleştirerek hidrojel çözeltisini dağıtırken temas ancak basınç yok. Erken hidrojel katılaşmasını önlemek için hızlı bir şekilde çalışarak, her jel girişine 1,5 μL jel çözeltisi dağıtın.
9. Plakanın üst kısmından, plakanın alt kısmından veya mikroskopla görüntülenerek mikroakışkan kanalların dolgu durumunu gözlemleyin ve yüklemeyi bir kılavuz olarak Kullanarak Yüklemeyi değerlendirin (Şekil 3B'debaşarılı yükleme , Şekil 3B'depipet konumlandırma kılavuzu , Şekil 3C'decevapsız yükleme , Şekil 3B'desona erecek şekilde doldurulmamış , Şekil 3E'detaşma). Bir sonraki fiş turu için doldurma başarısını artırabilecek teknikte gerekli ayarlamaları belirleyin (sorun giderme ipuçları için tartışmaya bakın).
10. 4.6−4.9 adımlarını HA çözeltisindeki kalan 3 hücre ile tekrarlayın. Bir sonraki aliquot (~ 1 dk) hazırlarken plaka ters çevirin.
    NOT: 1 dk bekleme süresi ve plaka ters jelasyon oluşur gibi hücre yerleşme azaltarak hücrelerin 3D dağılımını artırmak.
11. Tüm talaşlar doldurulduktan sonra, jelasyon tamamlanana kadar (~45 dk) 37 °C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde plakayı kuluçkaya yatırın.
12. Verilen kılavuzu kullanarak, perfüzyon rocker doğru perfüzyon ayarları (14 ° açı, 4 dakika aralıkları) ile hücre kültürü kuluçka yüklü olduğundan emin olun.
13. Tüm orta girişlere (sütun 2, 6, 10, 14, 18, 22) 50 μL PDX kültür ortamı ekleyin ve kanalların plakayı çevirerek düzgün doldurulup dolmadığını kontrol edin. Sıvıyı mikroakışkan kanalları doldurmaya teşvik etmek için plakayı bir yüzeye hafifçe dokunun.
14. Tüm orta çıkışlar için 50 μL DMEM-F12 (%10 FBS) ekleyin (sütun 4, 8, 12, 16, 20, 24). Perfüzyon kanalında herhangi bir hava kabarcığı sıkışıp kalırsa, plakayı bir yüzeye hafifçe vurarak çıkarın.
15. Bir mikroskop ve plaka düzeni formu(Ek Şekil 1),kayıt çip dolum başarı kullanarak. Yanlış doldurulmuş yongaları daha fazla deneysel kullanımdan hariç tinler.
16. Plakayı 14° eğime ve perfüzyona başlamak için 4 dk'lık bir döngüye ayarlı eğimli bir kayaç üzerine yerleştirin. PDX kültür ortamını her 2 günde bir değiştirin (önce girişte 50 μL, sonra çıkışta 50 l).

5. Hücre boyama, görüntüleme ve görüntü niceliği

1. Üç floresan boya (Hoechst 33342, ethidium homodimer-1, calcein acetoxymethyl [AM]) içeren bir hücre canlılık titreşme çözeltisi hazırlayın.
   1. Her boyanın stok çözeltilerini aşağıdaki gibi hazırlayın: Deiyonize suda 1,6 mM (1 mg/mL) deechst 33342; susuz DMSO'da 4 mM'de kalcein AM; ethidyum homodimer-1 2 mM DMSO/H₂O (1:4, v/v).
      NOT: Malzeme Tablosu'ndabelirtilen kitte calcein ve ethidium homodimer-1 çözeltileri bulunmaktadır.
   2. HBSS veya fenol kırmızıiçermeyen ortamda, üç boyaiçeren tek bir çalışma çözümü hazırlayın. Her hücre tipi ve matris için, Hoechst 33342 için 1,6−8,0 μM, calcein için 0,1−10 μM ve ethidyum homodimer-1 için 0,1−10 μM aralıkları içinde son çalışma konsantrasyonu optimize edin.
2. Kültür ortamını çıkarın ve istenilen mikroakışkan yongalara (75°L giriş, çıkışta 25 l) çalışma canlılık boya çözeltisi uygulayın ve hücre kültürü kuluçka makinesindeki perfüzyon rocker'ın üzerine 1 saat süreyle geri yerleştirin.
3. Floresan filtreler (uyarma/emisyon dalga boyları olarak listelenen) ile manuel veya otomatik konfokal mikroskop(Malzeme Tablosu)kullanarak lekeli kültürlerin gözlem pencerelerini görüntüle, nm) tüm çekirdekleri (Hoechst 33342, 350/461), ölü hücre çekirdeklerini (ethidium homodimer-1, 528/617) ve canlı hücre sitoplazmasını (calcein, 494/517) gözlemlemek için.
4. 20x hava hedefi kullanarak 140 μm Z-desteyi ≤1 μm adım boyutuna sahip yakalayın. Tüm mikro kanalı az miktarda çakışma ile görüntülemek için üç görüş alanı gereklidir. Çift örneklemeyi önlemek için, çip başına yalnızca iki görüş alanı görüntüleyin.
   NOT: Görüntüleme koşulları uygun NyQuist örnekleme sağlamak için optimize edilmelidir. Yazarların deneyimlerinde, konvansiyonel epi-floresan kaynağının dekonvolution veya bir konfokal üzerinde rezonans tarama modu dayalı hızlı bir görüntüleme sistemi, tam bir Z-yığın, üç lazer renkleri ile, makul bir süre içinde bir plaka üzerinde 96 yongaları arasında tam bir z-yığın (kurulum dahil olmak üzere otomatik görüntüleme ile yaklaşık 3,5 saat) tam olarak titretetmek için gereklidir.
5. Görüntü çözümleme yazılımını kullanarak, morfoloji, toplama durumu veya diğer özellikler gibi istenen niceliksel veriler için Z yığını görüntülerini tarar. Hücre canlılığını ölçmek için ölü hücre (kırmızı) ve toplam hücre çekirdeği (mavi) sayısını sayın.

Sonuçlar

Programlanabilir bir perfüzyon rocker standart bir su jacked hücre kültürü kuluçka hazırlandı ve iki şeritli mikroakışkan plakalar yükleme için standart bir biyogüvenlik kabini(Şekil 1)hazırlanmıştır. Bir MDA-PCA-118b PDX tümörü in vivo olarak genişletildi, maksimum boyuta ulaştığında hasat edildi ve protokol bölüm 2'de açıklandığı gibi hücrelerin bulamaç süspansiyonu oluşturmak için ayrıştırıldı, yaklaşık olarak tek hücreli bir durumda

Tartışmalar

Burada, yüksek iş yapımı, perfüzyonlu 3D kültür sisteminde uygulanabilir PDX kaynaklı tümör hücrelerinin işlenmesi ve kültürlenmesi için bir yöntem açıklıyoruz. Bu protokolpca PDX dokusu nu kullanırken, diğer epitel kaynaklı tümörler için de aynı derecede etkilidir. Tümör özellikleri, menşe dokuda (prostat, meme, vb.) bile bireysel PDX çizgileri arasında farklılık gösterir. Bazı PCa PDX hatları daha fibrotik ve diğerleri daha hücresel iken canlı hücreleri izole etmek zordur. Burad...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1N NaOH			any suitable tissue culture grade
60 mm round tissue culture dishes			any suitable
6-well tissue culture plates			any suitable
70 µm cell strainers	Corning	431751	or equivalent
Centrifuge	Eppendorf	5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes	or equivalent
Density gradient centrifugation solution	Millipore Sigma	P1644	Percoll
Dimethylsulfoxide			any suitable tissue culture grade
Dissociation enzyme solution	StemCell Technologies	07921	ACCUMAX
DMEM-F12	ThermoFisher Scientific	11039021	or equivalent
Forceps			any suitable
HA hydrogel kit	ESI BIO	GS311	HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA)
Hanks Balanced Salt Solution	Lonza	10-527F	or equivalent
Heat-inactivated fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S11150
Hemocytometer	Fisher Scientific	02-671-51B Hausser BrightLine	or equivalent
Hoechst 33342	ThermoFisher Scientific	H1398	or equivalent
Image processing software	Oxford Instruments	Imaris 9.3	or equivalent
LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1)	ThermoFisher Scientific	L3224	or equivalent
Microfluidic culture plate	Mimetas	9603-400-B	2-lane OrganoPlate
Microscope	Nikon	A1R	or equivalent
Multichannel pipette	Eppendorf	3125000036	or equivalent
PDX-derived tumor tissue			obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host
Penicillin-streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140-122	or equivalent
Perfusion rocker	Mimetas	OrganoPlate Perfusion Rocker Mini
pH strips (pH 5-9)			any suitable
Phosphate-buffered saline solution	Lonza	17-516F	or equivalent
Razor blades			any suitable
Rotating xy-shaker	VWR	Advanced 3500 Orbital Shaker	or equivalent
Scalpel handle			any suitable
Single channel repeating pipette	Eppendorf	22260201
Sterile, 15mL conical centrifuge tubes			any suitable
Sterile, 50mL conical centrifuge tubes			any suitable