Fizyolojik Koşullar altında Domuz Kalpleri Dilimleme ve Culturing

Summary

Bu protokol, 6 gün boyunca fizyolojik koşullar altında kalp dokusunun nasıl dilimlenir ve kültürlenir. Bu kültür sistemi yeni kalp yetmezliği terapötik etkinliğini test etmek için bir platform olarak yanı sıra bir 3D kalp modelinde akut kardiyotoksisite güvenilir test olarak kullanılabilir.

Abstract

Birçok yeni ilaçlar şu anda mevcut in vitro tahliller ve in vivo hayvan modelleri kötü insan kardiyak yükümlülüklerini tahmin olarak kardiyotoksik yan etkileri nedeniyle klinik çalışmalarda başarısız, ilaç endüstrisi üzerinde multi-milyar dolarlık bir yük poz. Bu nedenle, pahalı ve zaman alıcı 'insan ilk' denemeler üstlenmeden önce ilaç kardiyotoksisite belirlemek için daha iyi yaklaşımlar için dünya çapında karşılanmamış tıbbi ihtiyaç vardır. Şu anda, sadece olgunlaşmamış kalp hücreleri (insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler [hiPSC-CMs]) onlar uzun süre kültürlenebilir tek insan kalp hücreleri olarak terapötik verimlilik ve ilaç toksisitesi test etmek için kullanılır uyuşturucu etkinliğini ve toksisitesini test etmek için gereklidir. Ancak, tek bir hücre tipi birden fazla hücre tipi oluşan karmaşık 3D kalp dokusunun fenotip kopyalayamaz. Daha da önemlisi, ilaçların etkisi yetişkin kardiyomiyositler üzerinde test edilmesi gerekir, hangi farklı özellikleri ve toksisite yanıtları olgunlaşmamış hiPSC-CMs ile karşılaştırıldığında. Bu teknoloji, insan kalp dokusunu taklit eden ve insan miyokardinin fizyolojik veya patolojik koşullarını yansıtan tam bir çok hücreli sisteme erişim sağlar. Son zamanlarda, kültür medya bileşenlerinin optimizasyonu ve kültür koşulları nın 1.2 Hz'de sürekli elektriksel uyarımı ve kültür ortamının aralıklı oksijenletılmasını içermesi ile, yaşanabilirliği koruyan yeni bir kültür sistemi kurulumu geliştirdik. ve kültürde 6 gün boyunca insan ve domuz kalp dilimleri işlevselliği. Mevcut protokolde, domuz kalbini dilimleme ve dilimleme yöntemini örnek olarak ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Aynı protokol insan, köpek, koyun veya kedi kalplerinden gelen kültür dilimleri için kullanılır. Bu kültür sistemi preklinik ve klinik test sonuçları arasındaki boşluğu kapatır akut kardiyotoksisite testi için yerinde güçlü bir tahmine sahip insan olma potansiyeline sahiptir.

Introduction

İlaca bağlı kardiyotoksisite piyasa çekilmesi önemli bir nedenidir^{1. 20.} yüzyılın son on yılında, sekiz non-kardiyovasküler ilaçlar piyasadan çekildi onlar ventriküler aritmiler nedeniyle ani ölümle sonuçlandı². Buna ek olarak, çeşitli anti-kanser tedavileri (birçok durumda etkili iken) kardiyomiyopati ve aritmiler de dahil olmak üzere çeşitli kardiyotoksik etkilere yol açabilir. Örneğin, hem geleneksel (örneğin, antrasiklinler ve radyasyon) ve hedeflenen (örneğin, trastuzumab) meme kanseri tedavileri hastaların bir alt kümesinde kardiyovasküler komplikasyonlara neden olabilir³. Kardiyologlar ve onkologlar arasında yakın bir işbirliği ("kardiyo-onkoloji" gelişmekte olan alan üzerinden) hastaların etkili bir şekilde tedavi edilebilir sağlanması bu komplikasyonları yönetilebilir hale yardımcı oldu². Her2 ve PI3K inhibitörleri de dahil olmak üzere yeni ajanların kardiyovasküler etkileri daha az belirgindir, özellikle tedaviler birlikte kullanıldığında. Bu nedenle, insan klinik çalışmalar öncesinde ortaya çıkan anti-kanser tedavileri ile ilişkili kardiyovasküler toksisite için güvenilir preklinik tarama stratejileri için artan bir ihtiyaç vardır. 24 saatten fazla işlevsel ve yapısal olarak uygulanabilir olan insan kalp dokusu için kültür sistemlerinin bulunmaması güvenilir kardiyotoksisite testi için sınırlayıcı bir faktördür. Bu nedenle, ilaç toksisitesi test etmek için fizyolojik koşullar altında insan kalp dokusu kültüriçin güvenilir bir sistem geliştirmek için acil bir ihtiyaç vardır.

Kardiyotoksisite testlerinde insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerin (hiPSC-CMs) kullanımına yönelik son hamle, bu sorunu çözmek için kısmi bir çözüm sağlamıştır; ancak, hiPSC-CMs olgunlaşmamış doğası ve kalp dokusunun çok hücreli doğası ile karşılaştırıldığında doku bütünlüğünün kaybı bu teknolojinin önemli sınırlamalar vardır⁴. Yakın tarihli bir çalışma kısmen hidrojeller üzerinde hiPSC-CMs kardiyak dokuların imalatı ve zaman içinde elektriksel stimülasyon kademeli artışa tabi ile bu sınırlama üstesinden gelmiştir⁵. Ancak, elektromekanik özellikleri yetişkin insan miyokardinde görülen olgunluğa ulaşamadı. Ayrıca, kalp dokusu yapısal olarak daha karmaşıktır, endotel hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli hücre tipleri oluşan, nöronlar ve stromal fibroblastlar çeşitli türleri ile birlikte hücre dışı matriks proteinlerinin çok özel bir karışımı ile bağlantılı⁶. Erişkin memeli kalpte kardiyomiyosit hücre popülasyonu^7,8,9 bu heterojenlik tek tek hücre tipleri kullanılarak kalp dokusumodellemesinde önemli bir engeldir. Bu önemli sınırlamalar kalbin fizyolojik ve patolojik koşullarını içeren optimal çalışmalar için bozulmamış kardiyak doku kültürünü sağlamak için yöntemler geliştirmenin önemini vurgulamak^5.

Culturing insan kalp dilimleri bozulmamış insan miyokardiyum umut verici bir modeldir. Bu teknoloji, insan miyokardinin fizyolojik veya patolojik koşullarını güvenilir bir şekilde yansıtabilecek insan kalp dokusuna benzeyen tam bir 3Boyutlu çok hücreli sisteme erişim sağlar. Ancak, kullanımı ciddi 2018 10^,11,,¹²kadar bildirilen en sağlam protokolleri kullanarak 24 saat ötesine geçmez kültür, canlılık kısa süre ile sınırlı olmuştur.¹² Bu sınırlama, dilimleri kültüre getirmek için hava-sıvı arabiriminin kullanımı ve kardiyak dokunun yüksek enerjik taleplerini desteklemeyen basit bir kültür ortamının kullanımı da dahil olmak üzere birden fazla faktörden kaynaklandı. Biz son zamanlarda sürekli elektrik stimülasyon sağlamak mümkün ve kadar 6 gün¹³için kardiyak doku dilimleri canlı tutmak için kültür medya bileşenleri optimize bir batık kültür sistemi geliştirdik. Bu kültür sistemi preklinik ve klinik test sonuçları arasındaki boşluğu kapatmak için akut kardiyotoksisite testi için yerinde güçlü bir tahmine sahip insan olma potansiyeline sahiptir. Mevcut makalede, bir örnek olarak bir domuz kalbi kullanarak kalp dilimleri dilimleme ve kültüriçin protokol ayrıntılı vardır. Aynı işlem insan, köpek, koyun veya kedi kalpleri için de uygulanır. Bu protokolle, teknolojiyi bilim camiasındaki diğer laboratuvarlara yaymayı umuyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

Tüm hayvan prosedürleri Louisville Üniversitesi'nin kurumsal yönergelerine uygun olarak ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Dilimleme için hazırlık (Dilimlemeden Bir Gün Önce)

1. Titreşimli mikrotomun hazırlanması
   1. Seramik bıçağı şu adımları izleyerek tutucuya yerleştirin: bıçağı dikkatlice açtıktan sonra keskin kenarı önce bıçak aletinin yuvasına yerleştirin. Daha sonra, tutucunun kollarındaki iki vidayı gevşeterek bıçağı tutucuya takın ve bıçağı her yıkayıcının altına kaydırın ve arka stoplara sıkıca geri itin. Bıçağı sabitlemek için vidaları sıkın.
      NOT: Vidalar aşırı sıkılaştırılmamalıdır.
   2. Kalibrasyon protokolünü ve araçlarını kullanarak bıçağı üreticinin protokolüne göre kalibre edin.
      NOT: Kısaca, bıçağın seyahat ekseni ile hizalanmasını kolaylaştırmak ve Z eksenindeki sapmaları en aza indirmek için titreşimli mikrotom sökülebilir bir kalibrasyon cihazı kullanır. Kalibrasyon cihazı cihaza takıldığında varlığı otomatik olarak algılanır ve titreşen mikrotom bıçağın genlik ve frekans ayarlarını en iyi şekilde bıçak hizalama hatasının ayarlanmasına olanak sağlayacak bir büyüklüğe ayarlamayı kontrol altına alır.
      1. En iyi hizalama değerlendirmesi için kesme kenarının kalibrasyon cihazına göre en uygun konumda olması için bıçağı otomatik olarak hareket ettirecek hizalama işlemini başlatmak için Dilim düğmesine basın. Z hizasının 1 μm'lik bir mesafede olduğundan emin olmak için sağlanan tornavidayı kullanarak bıçakta ayarlamalar yapmak için ekrandaki yönergeleri izleyin.
   3. Otoklav iç banyo ve titreşen mikrotom tüm metal parçaları.
2. Büyük metal tepsileri (dilimleri toplamak ve elektrikstimülasyon plakası kapakları ıslatmak için), herhangi bir cam kap, düzenli dikdörtgen bıçaklar, forsepsler, makas, yazıcı zamanlama kayışı (6 mm genişliğinde parçalar halinde kesilmiş), metal yıkağılar ve 5 L çift distile su (ddH₂O).
3. Kardiyoplegic solüsyon ile kalp için bir adet 1 L kavanoz, bir adet 500 mL kavanoz ve bir plastik tepsi yi sterilize edin.
4. Dilimleme Tyrode çözeltisinin 2 L'sini 2 L kabında hazırlayın.
   1. Dilimleme Tyrode çözeltisinin 1 L'si için 3 g/L 2,3-butanedione monoxime (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glukoz (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl₂ (1 mL 1 M çözelti), 1,8 mM CaCl₂ (1 MM çözelti1,8 mL), 1 L ddH₂O. NaOH kullanarak pH'ı 7.40'a ayarlayın. Daha sonra çözeltiyi 1.000 mL, 0,22 m m, vakum filtresi/depolama sistemi kullanarak filtreleyin ve bir gecede 4 °C'de saklayın.
5. Kardiyoplejik çözeltinin 4 L'sini hazırlayın.
   1. Kardiyoplegic çözeltinin 1 L'si için 110 mM NaCl (6,43 g), 1,2 mM CaCl₂ (1 M Çözelti1,2 mL), 16 mM KCl (1,19 g), 16 mM MgCl₂ (3,25 g), 10 mM NaHCO₃ (0,84 g), 1 U/mL heparin, 1 L ddH₂O.NaOH kullanarak pH'ı 7.40'a ayarlayın. Daha sonra çözeltiyi 1.000 mL, 0,22 m m, vakum filtresi/depolama sistemi kullanarak filtreleyin ve bir gecede 4 °C'de saklayın.
      NOT: Kardiyopleji çözeltisinde dilimleme gününe 1.000 U/L heparin ekleyin (bkz. adım 2.1).
6. Yeni bir biyogüvenlik kabine orijinal şişe kültür orta 500 mL hazırlamak: mix orta 199, 1x insülin-transferrin-selenyum (ITS) takviyesi, 10% fetal sığır serum (FBS), 5 ng / mL vasküler endotelal büyüme faktörü (VEGF), 10 ng / mL FGF-temel, ve 2x antibiyotik-antimikotik. Filtre 0,22 μm, vakum filtre / depolama sistemi ile sterilize ve 4 ° C gecede saklayın.
   NOT: PH'ı ayarlamayın, kullanmadan önce VEGF ve FGF'yi taze olarak ekleyin.
7. % 4 agar jel plakaları hazırlayın.
   1. 500 mL sterilize edilmiş bir şişeye 200 mL steril ddH₂O ekleyin. Tartmak 8 g agarose, ve yavaşça şişe içine dökün. Bir mikrodalga 2 dakika kaynatın, sonra oda sıcaklığında 5 dakika soğutun.
   2. Her 100 mm Petri kabına 25 mL'lik bir biyogüvenlik kabinine dökün (6 tabak hazırlayın) ve katılaşmak için 1 saat bekleyin. Daha sonra tabakları parafin filmle kapatın, temiz sargı ile sarın ve 4 °C'de saklayın.
8. Otoklavd ddH₂O 200-proof mutlak etanol seyrelterek% 70 etanol 4 L hazırlayın.
9. Steril_ddH2 O 2x antibiyotik-antimikotik hazırlayın: biyogüvenlik kabinesi altında 20 mL antibiyotik-antimikotik ile steril ddH₂O 980 mL karıştırın.

2. Domuz Kalp Perfüzyon

1. Kardiyoplegic çözeltinin her 1 L'sine 1 000 U/mL heparin 1 mL ekleyin. Çözeltiyi buzda tut.
   NOT: Doku kültür odasına transfer sırasında kalbin perfüzyonu ve korunması için en az 3 L gereklidir.
2. Domuz ameliyathanesine aşağıdaki öğeleri alın: buz dolu büyük bir buz kovası, bir steril metal tepsi (kalp perfüzyonu için buz kovası üzerinde tutmak), bir sterilize 500 mL kavanoz, bir 1 L kavanoz (kardiyopleji çözeltisi geri doku kültür odasına kalp aktarmak için , buz üzerinde), ve bir sterilize plastik tepsi buz dolu (buz üzerinde kardiyoplejik çözüm tutmak için).
3. 3 yönlü stopcock, 60 mL şırınga, 18 G kelebek iğne kateter ve kardiyoplegic solüsyon rezervuarına uzatma tüpü içeren yerinde kalp perfüzyon sistemi hazırlayın.
4. Yorkshire erkek domuz (2−3 aylık, 20−25 kg) ilk ketamin (20 mg/kg)/xylazine (2 mg/kg) kokteyl intibak ile anestezi. Çene gerginliği kaybı ile uygun anestezi onaylayın. Daha sonra, ameliyathaneye domuz transfer, entübatve mekanik olarak daha önce açıklandığı gibi akciğerleri^{havalandırmak 14}.
5. Anesteziyi %1,5−2 ile koruyun isoflurane.
6. Sağ yan pozisyonda hayvan yerleştirin ve göğüs bölgesinden kürk tıraş. Alkol scrub ile cildi temizleyin, sonra% 10 (w / v) povison-iyot çözeltisi ile cerrahi site sterilize.
7. 4^interkostal alanda bir neşter kullanarak sol torakotomi kesi tarafından göğüs açın, ve göğüs açık tutmak ve kalp maruz kaburga arasında bir göğüs retraktör kullanın.
   NOT: Bu işlem için tüm sterilize aletleri kullanın.
8. Kelebek iğne kateterini sol atriyuma yerleştirin ve iğneyi bir çanta ipi kapatmasıyla düzeltin. Bolus dozheparin (100 U/kg) intravenöz enjeksiyondan sonra, sol atriyal kateter ile 500 mL buz gibi kardiyoplegic solüsyon (kalp hızını yavaşlatmak için) ile kalbi yerinde perfüzyon başlar.
9. %5 isoflurane ile domuzu derinden anestezi yedirin. Hızlı bir şekilde cerrahi makas ile göğüs kalbini dışarı çıkarmak. Aort aort bir aort kanül ile kanül ve vaskülature kan dışarı floş için buz gibi soğuk kardiyoplejik çözelti (100 mL / dk) başka bir 1 L ile in vitro kalp perpin.
10. Kalp perfüzyonu sonrasında, kalbi buz gibi kardiyopleji solüsyonu ile dolu 1 L'lik bir kavanozda tutun ve doku kültür odasına transfer sırasında buzda tutun.

3. Domuz Kalp Dokusu Dilimleme

1. Vibratom üzerinde doku banyosu kurmak, doku banyosu soğutma ceket buz ekleyin, sonra doku banyosu içine Tyrode çözeltisi ekleyin. Doku banyosu soğutma ceket erimiş buz bertaraf toplamak için 1 L plastik kavanoz ayarlayın.
2. Biyogüvenlik dolabıaltında domuz kalbini 1 L taze soğuk kardiyoplejik solüsyon içeren bir tepsiye aktarın.
3. Geri çekilebilir steril neşterler kullanarak sol ventrikül izole etmek için kalp diseksiyon. Daha sonra, jilet dikdörtgen bıçaklar kullanarak 1−2 cm³ her bloklar halinde sol ventrikül kesin. Dilimleme için tek parça kullanın ve gerekirse daha sonra kesmek için buz üzerinde soğuk Tyrode çözeltisi 50 mL tüp içinde kalan parçaları tutun.
   NOT: Özellikle bu ikinci blok ise, elile dilimleme önce doku masaj. Masaj doğru kas lif yapılandırması geri yardımcı olur ve kalp bloğu içinde herhangi bir sertlik önler.
4. Metal numune tutucuya 1−2 damla doku tutkal(Malzeme Tablosu)ekleyin ve yaklaşık 1 cm²yüzey alanına sahip %4'lük agar bloğundan bir parça yapıştırın.
5. Agar üzerine 1−2 damla doku tutkal ekleyin.
6. Kalp bloğunu agar'a yapıştırın ve kardiyak epikardiyum tarafı doku tutkalına bakacak şekilde ve mümkün olduğunca düz olduğundan emin olun. Daha sonra, vibratom dilimleme banyosunda konumuna kalp bloğu ile doku tutucu aktarın.
7. Dilimleme banyosu ve metal tepsi dilimleme banyosu (oksijenli Tyrode banyosu) toplamak için Tyrode çözeltisi ile dolu oksijen tüpü takın. Daha sonra, kesme den sonra dilimleri toplamak için metal tepsiye 40 μm hücresüzler ekleyin.
8. Dilimleme konumunu ayarlama
   1. Vibratom işletim yazılımını ve gösterge panelini kullanarak bıçağın/numunenin yüksekliğini ayarlayın. Yükseklik düğmesini seçin ve yüksekliği ayarlamak için ekrandaki yönergeleri izleyin. İdeal olarak, bıçak doku üst yakın ama papiller kasların altında var ve dilimleme önce doku ve bıçak kapsayan sıvı olduğundan emin olun.
   2. İleri düğmesini seçerek dokuyu dilimlemeye başlayacağınız yeri ayarlayın. Dilim düğmesine basın ve bıçağı dokunun kenarına doğru hareket ettirmek için düğmeyi kullanarak hızı artırın. Ardından, durdurmak için tekrar dilime basın ve işlemi etkinleştirmek için önceden düğmesine basın.
   3. Kesme parametrelerini ayarlayın: ilerleme hızı = 0,03 mm/s, titreşim frekansı = 80 Hz ve yatay titreşim genliği = 2 mm. Ardından dilim düğmesini seçerek dilimlemeye başlayın.
   4. Vibratom un doku sonuna ulaşana kadar ancak numune tutucunun arka ucuna çarpmadan önce dilimlesin. Bu noktada, durdurmak için tekrar dilime basın. Başlangıç konumuna geri dönmek için İade düğmesine basın.
   5. Titreşen mikrotomun dilimleme işlemini 99 kez otomatik olarak tekrarlamasını sağlayacak otomatik yinelemeyi (iki kez tıklatarak) seçin.
9. Dilimleri toplama
   1. Dilimler tam uzunlukta ve iyi görünene kadar bekleyin (papiller kas katmanları geçtikten sonra), sonra dilimleri toplamaya başlayın.
   2. Yavaşça banyodan doku kapmak için soğuk Tyrode's çözeltisi ile dolu plastik bir Pasteur pipet kullanarak dilimleri toplamak. Gerekirse, doku hala bağlı ise kalp bloğundan dilim ayrıştırmak için forceps ve bahar makas kullanın.
   3. Oksijenli Tyrode banyosunda bir hücre süzgeci için dilim aktarın (adım 3.7 bakınız) ve hücre süzgeçleri üzerinde düz yalan doku almak için plastik Pasteur pipet sıvı kullanın, sonra aşağı doku tutmak için üst bir metal yıkayıcı ekleyin.
      NOT: Dilimler işleme önce Tyrode çözeltisi en az 1 saat için kuluçkaya yatmalıdır (Bu BDM için doku dinlenmek için).

4. Culturing Kalp Dilimleri

1. Dilimleri kültüre hazırlama
   1. Pürüzsüz kenarlardan kaçınmak için dilimi kenarlardan kırpın. Daha sonra, doku tutkal kullanılarak gömülü metal teller ile sterilize poliüretan 6 mm genişliğinde yazıcı zamanlama kemeri her iki ucundan tutkal.
   2. Desteklenen kalp dilimlerini her kuyuda 6 mL kültür ortamı içeren 6 kuyu plakasına aktarın.
   3. Stimülasyon plakası kapağını(Malzeme Tablosu)6 kuyu plakasının üstüne yerleştirin ve kapağı hücre kültürü elektrik stimülatörüne bağlayın (Malzeme Tablosu). Uyarıcıyı, kalp dilimlerini sürekli olarak 10 V, 1,2 Hz'de sürekli olarak uyarmak için ayarlayın.
      NOT: Uyarımı taktıktan sonra kalp dilimleri atmaya başlar ve bu hareket görsel olarak belirgin olacaktır.
   4. Plakaları bir kuvöze aktarın ve 37 °C'de nemli hava ve %5 CO₂ile koruyun.
2. Kültür ortamını günde 3 x değiştirin ve her ortam değişikliği sırasında her kuyu başına 6 mL kültür ortamı ekleyin.
   NOT: Kültür ortamı her ortam değişikliğinden önce 5 dakika oksijenlenir. Orta günde en az 1x değiştirilmelidir; gerekirse hafta sonları sorun yok. Günde sadece 1 ortam değişikliği iki gün test edilen maksimum.
3. Kültür ortamında (genellikle gün ortası ortam değişimi sırasında) toksik grafit parçacıklarının salınımını önlemek için stimülasyon plakası kapağını her gün değiştirin.
   1. Uyarım plakası kapağını kültür çanağından çıkarın ve elektrik devresinin su hasarını önlemek için kapağın hücre kültürü elektrik uyarıcısı için kabloya bağlandığı beyaz köpük fişini takın.
   2. 2x antibiyotik-antimikotik ile otoklavlı su banyosunda plaka kapağı yerleştirin. Bu banyoda saklayın (yani, durulama banyosu) bir gecede.
   3. Ertesi gün, dekontamine 5−15 dakika için% 70 etanol banyo içine plaka kapağı hareket ettirin. Banyoları değiştirmeden önce cihazdan çok fazla sıvı çalkalayın.
   4. Daha sonra, otoklavlı su ve 2x antibakteriyel-antimikotik oluşan üçüncü ve son banyo (yani, temiz banyo), herhangi bir kalan etanol izleri durulamak için plaka kapağı aktarın.
   5. Temiz banyoda plaka kapağını duruladıktan sonra, plastik parçalar daki artık suyu kurutmak için temiz bir tüy bırakmayan mendil (etanol ile püskürtülür) kullanın, ardından beyaz köpük parçasını çıkarın ve plaka kapağını kültür plakasına dikkatlice yerleştirin.
      NOT: Cihaz artık steril olmayacağından, kuyuya giren siyah grafit elektrotlara dokunmayın.
   6. Steril çalgılar kullanarak, plaka kapağı doku dokunmaz böylece doku kuyunun merkezinde olduğundan emin olun. Plaka örtüsünün kavisli tarafının plakanın açılı tarafıyla eşleştiğinden ve kare köşelerin hizaya olduğundan emin olun.
      NOT: Stimülasyon plakası kapaklarının kontaminasyonunu en aza indirmek için, deneyi tamamladıktan sonra temiz ve boş 6 kuyu plakasında saklayın.
4. Taze domuz kalp dilimleri (gün 0) üzerinde bir MTT tayini, kalsiyum ölçümleri ve kontraktil fonksiyon değerlendirmeleri gerçekleştirin ve Ou ve ark.¹³göre kültürde 6 gün sonra .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

Aynı anda sekiz 6 kuyu plakaları barındırabilir bir ticari hücre kültürü elektrik uyarıcı kullanarak, fizyolojik frekansta elektriksel stimülasyon indükleyerek yetişkin kardiyak ortam taklit (1.2 Hz), ve kültür fonksiyonel domuz kalp dilimleri süresini uzatmak için temel orta bileşenleri için taranmış¹³. Domuz ve insan kalpleri boyutu ve anatomi¹⁵benzer olduğundan, biz domuz kalpleri kullanarak bir biyomimetik kalp dili...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Burada basitleştirilmiş orta iş batışı (48 dilim/cihaza kadar süreçler) akut kardiyotoksisiteyi test etmek için yeterince uzun bir süre domuz kalp dilimleri kültürünü sağlayan yöntem için son zamanlarda yayınlanan yöntemimiz için ayrıntılı video protokolünü açıklıyoruz¹³. Önerilen koşullar, elektriksel stimülasyon sıklığı, besin kullanılabilirliği ve aralıklı oksijenasyon da dahil olmak üzere kalbin çevresini taklit eder. Biyomimetik uyarılmış kültürü...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,000 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage Systems	VWR	28199-812
2,3-Butanedione monoxime (BDM)	Fisher	AC150375000
500 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage Systems	VWR	28199-788
6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover)	Ion Optix	CLD6WFC
6-well plates	Fisher	08-772-1B
Agarose	Bioline USA	BIO-41025
Antibiotic-Antimycotic	Thermo	15-240-062
C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator)	Ion Optix	CEP100
Calcium Chloride (CaCl2)	Fisher	C79-500
Ceramic Blades for Vibrating Microtome	Campden Instruments	7550-1-C
Cooley Chest Retractor	Millennium Surgical	63-G5623
D-Glucose	Fisher	D16-1
Disposable Scalpel #20	Biologyproducts.com	DS20X
Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning	VWR	21008-952
Fetal Bovine Serum	Thermo	A3160502
Graefe Forceps	Fisher	NC9475675
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
HEPES	Fisher	BP310-1
Histoacryl BLUE Tissue glue	Amazon		https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/
Iris Spring scissors	Fisher	NC9019530
Iris Straight Scissors	Fisher	731210
Isoflurane, USP	Piramal	NDC 66794-017-25
ITS Liquid Media Supplement	Sigma-Aldrich	I3146-5ML
Ketamine HCl (500 mg/10 mL)	West-Ward	NDC 0143-9508
Magnesium Chloride (MgCl2)	Fisher	M33-500
Mayo SuperCut Surgical Scissors	AROSurgical Instruments Corporation	AROSuperCut™ 07.164.17
Medium 199, Earle's Salts	Thermo	11-150-059
Oxygen regulator	Praxair
Oxygen tanks -	Praxair
Plastic Pasteur pipettes	Fisher	13-711-48
Potassium Chloride (KCl)	Fisher	AC193780010
Printer Timing Belt	Amazon		https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/
Razor rectangle blades	Fisher	12-640
Recombinant Human FGF basic	R&D Systems	233-FB-025/CF
Recombinant Human VEGF	R&D Systems	293-VE-010/CF
Retractable scalpels	Fisher	22-079-716
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Fisher	AC217125000
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher	AC327300010
Vibrating Microtome	Campden Instruments	7000 SMZ-2
Xylazine HCl (100 mg/mL)	Heartland Veterinary Supply	NADA 139-236