Homojen Hücre Dağılımı için Üç Boyutlu Biyobaskıda Çok Katmanlı Hidrojel Bioink'in Kullanılması

Özet

Burada, kapsüllü hücrelerin sedimantasyonunu önlemek için sıvı benzeri biyoinkler (düşük viskoziteli jelatin metakrilopil) için çok katmanlı modifiye edilmiş yeni bir strateji geliştirdik.

Özet

Ekstrüzyon tabanlı üç boyutlu biyobaskı işlemi sırasında, düşük viskoziteli sıvı benzeri biyoinks, kesme stresinin neden olduğu membran hasarından hücreleri koruyabilir ve kapsüllenmiş hücrelerin hayatta kalmasını artırabilir. Ancak, rezervuarhızlı yerçekimi güdümlü hücre sedimantasyonu biyoprinted yapılarda homojen bir hücre dağılımına yol açabilir ve bu nedenle sıvı benzeri bioinks uygulanmasını engelleyebilir. Burada, kapsüllü hücrelerin sedimantasyonunu önlemek için sıvı benzeri biyoinkler (örn. düşük viskoziteli jelatin metakriloyl) için çok katmanlı yeni bir modifiye strateji geliştirdik. Çok katmanlı bioink'te birden fazla sıvı arabirimi, yüzler arası tutma sağlamak için manipüle edildi. Sonuç olarak, çok katmanlı sistemde bitişik tabakalar arasında giden hücre sedimantasyon eylem bioink rezervuar oldu. İnterasiyal retansiyonun hücrelerin tortul çekiminden çok daha yüksek olduğu, hücre sedimantasyonunu önlemede ve çok katmanlı biyoinkteki hücrelerin daha homojen bir şekilde dağılımını teşvik etmede interfacial tutmanın kritik bir rolünü gösterdiği saptandı.

Giriş

Üç boyutlu (3D) biyobaskı biyofabrikasyon ve rejeneratif tıp^1,2,,3yerli dokuların karmaşık mimari ve fonksiyonel kopyaları üretmek için umut verici bir yöntem olmuştur. Mürekkep püskürtmeli, ekstrüzyon ve stereolitografi baskı dahil olmak üzere biyobaskı ortak stratejileri, farklı bakış açılarından artıları ve eksileri var⁴. Bu teknikler arasında, ekstrüzyon prosedürü en yaygın maliyet etkinliği nedeniyle kullanılır. Bioink ekstrüzyon biyobaskı süreci istikrar önemli bir rol oynar. İdeal hücre yüklü bioink sadece biyouyumlu değil, aynı zamanda mekanik^özellikleri5 için uygun olmalıdır. Düşük viskoziteli bioinks genellikle sıvı benzeri bir durum olarak sunulmaktadır. Bu bioinks kolayca ve hızlı bir şekilde birikmiş ve ekstrüzyon sırasında yüksek kesme stresi tarafından indüklenen hücre zarı hasarı önlemek. Ancak, uzun süreli baskı süreleri gerektiren karmaşık durumlarda, düşük viskozite genellikle genellikle yerçekimi tarafından tahrik edilir ve bioink bir homojen hücre dağılımı yol açan bioink rezervuar kapsüllenmiş hücrelerin kaçınılmaz sedimantasyon yol açar^6,7. Sonuç olarak, homojen hücre dağılımı ile bir biyoink fonksiyonel doku yapısı in vitro biyobaskı engeller.

Bioinks odaklanan birkaç yeni çalışmalar kapsüllenmiş hücrelerin homojen dağılım teşvik bildirdin. Modifiye aljinit biyoink çift kademeli crosslinking dayalı ekstrüzyon biyobaskı için kullanılmıştır⁸. Bu çalışmada bir aljinat polimeri peptidler ve proteinler ile modifiye edilmiştir. Hücreler bu modifiye aljinatta, peptidler ve proteinler tarafından sağlanan ek bölgeler eki nedeniyle yaygın olarak kullanılan aljinattan daha homojen bir dağılım sundular. Alternatif olarak, harmanlanmış bioinks bioink hücrelerin sedimantasyon çözmek için kullanılmıştır. Polietilen glikol (PEG) ve jelatin veya jelatin metakroril (GelMA) içeren bir karışım lı biyoink geliştirilmiş mekanik sağlamlık ile başka bir çalışmada kullanılmıştır⁹. Kapsüllü hücreler homojen bir dağılım sunduçünkü harmanlanmış biyoink'in viskozitesi daha iyi gelişti. Genel olarak, biyoink viskozitesi, hücrelerin yerçekimi, hücrelerin yoğunluğu ve çalışma süresi gibi biyoink kapsüllenmiş hücrelerin dağılımını etkileyen çeşitli faktörler vardır. Bu faktörler arasında, hücrelerin yerçekimi sedimantasyon teşvik kritik bir rol oynar. Viskoz bioink tarafından sağlanan yüzdürme ve sürtünme bugüne kadar yerçekimine karşı ana kuvvetler olarak araştırılmıştır¹⁰.

Burada, bioink rezervuarındaki birden fazla sıvı arabirimini manipüle ederek kapsüllenmiş hücrelerin biyoinkteki homojen dağılımını teşvik etmek için yeni bir strateji geliştirdik. Bioink'in çok katmanlı modifikasyonu ile oluşturulan bu sıvı arayüzler sadece hücrelerin sedimantasyonunu geciktiren interfacial retansiyonu sağlamakla kalmıyor, aynı zamanda biyoink'in uygun biyouyumluluğunu ve reolojik davranışını da sürdürebilir. Uygulamada, sulu GelMA çözeltisini (%5, w/v) ipek fibroin (SF) ile çok katmanlı bir şekilde uzunlamasına dört arayüz üreterek harmanlanmış bioinkte yüzler arası gerilimler sağladık. Sonuç olarak, hücrelere yüklenen yerçekimi insan yapımı interfacial tension ile dengelendi ve biyoink içinde kapsüllenmiş hücrelerin neredeyse homojen dağılım hücrelerin komşu katmanları arasında daha az sedimantasyon nedeniyle elde edildi. Bugüne kadar sıvı biyoinklerde interfacial retansiyonu manipüle ederek kapsüllenmiş hücrelerin sedimantasyonunu yavaşlatacak benzer bir protokol bildirilmemiştir. Biyobaskıda hücre sedimantasyonunu çözmenin yeni bir yolunu göstermek için protokolümüzü burada sıyoruz.

Protokol

1. Hücre yüklü SF-GelMA hazırlanması

1. 0,22 μm şırınga filtre üniteleri kullanarak tüm malzemeleri sterilize edin. Biyolojik güvenlik kabinindeki tüm adımları atın.
2. 1x PBS'den 50 °C'ye kadar ısıtın ve ısıtılmış 1x PBS'de jelatini karıştırarak çözün. PBS'de jelatinin son konsantrasyonu %10 (w/v) olmalıdır.
3. Jelatin çözeltisine metakrilik anhidrit ekleyin (metakrilik anhidritin 0,6-1 jelatine ağırlık oranı) yavaşça karıştırarak ve kompleksi en az 1 saat (50 °C) karıştırın. Tipik olarak, metakrilik anhidrit 12 g ile% 10 jelatin çözeltisi 200 mL hazırlamak; hacmi çalışmanın ihtiyaçlarına bağlıdır.
4. Jelatin ve metakrilik anhidrit içeren karışık çözeltiyi 50 mL steril tüpe aktarın.
5. 3.500 x gkarışık çözeltisantrifüj . Genellikle iki tabaka elde etmek için 3-5 dakika sürer. Üst tabaka (GelMA) toplamak ve alt tabaka (reaksiyona girilmemiş metakrilik anhidrit) atın.
6. Adım 1.5'te elde edilen üst tabaka çözeltisini iki hacim deiyonize su (40−50 °C) ile seyreltin.
7. 1.6'da elde edilen çözeltiyi 12-14 kDa moleküler ağırlık kesme diyaliz membranı ile deiyonize suya karşı 5−7 gün (40−50 °C) diyaliz emülsiyonu. Suyu her gün iki kez değiştirin.
8. GelMA çözeltisini bir gecede −80 °C'de toplayın ve dondurun.
9. GelMA çözeltisini -45 °C'ye, basınç 0,2 mbar'a ayarlanmış bir dondurma kurutucuda 3−5 gün boyunca lyophilize edin.
10. Liyofilize GelMA'yı eritin (yaklaşık %75'lik ikame derecesi) 1x PBS içeren 1x PBS% 10 FBS (fetal sığır serum, v / v), 25 mM HEPES (N-2-hidroksitilpiperazin-N-etan-sülfonik asit) ve fotoinitiator (0.5%, w / v) GelMA bioink preparatını elde etmek için.
    NOT: GelMA'nın ikame derecesi ninhidrin titreşme³ile hesaplanabilir.
11. Farklı SF konsantrasyonlarında SF-GelMA biyoinks elde etmek için GelMA çözeltisini (%10, w/v) farklı hacimlerde ilk SF çözeltisi (%5, w/v) ve 1x PBS'nin farklı hacimleriyle karıştırın. Farklı biyoinklerde GelMA ve SF çözeltisinin 1 mL başına oranı Tablo 1'desunulmuştur.
    NOT: Tüm bioinks% 5 (w / v) GelMA nihai konsantrasyonu içermelidir, ancak SF konsantrasyonu değişir: 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, ve 1.5% (w / v) farklı SF-GelMA bioinks. SF-M-Katmanlı-GelMA'yı kullanarak SF ile birlikte modifiye edilen GelMA bioink'i katman katman olarak adlandırın. SF-X-GelMA'yı homojen bir şekilde SF ile modifiye edilen GelMA'yı (örneğin, %1'lik SF modifikasyonu ile GelMA SF-1-GelMA olarak adlandırılır) olarak adlandırmak için kullanın.
12. Sonicate 10-20 dakika için tüm bioinks.
13. Bir kuvözde %10 FBS ve %1 penisilin-streptomisin içeren DMEM (Dulbecco'nun modifiye Kartal ortamı) kullanarak NIH3T3 hücreleri yetiştirin (37 °C ila %5 CO_2). Yoğunluk %80'e ulaştığında hücreleri 1:3 oranında iletin.
14. 5 dk. 1500 rpm'de NIH3T3 hücrelerinin süspansiyonuna santrifüj edin.
    NOT: Biyoink'teki kapsüllenmiş hücrelerin konsantrasyonu 1 x 10⁶ hücre/mL olmalı ve konsantrasyon bir sitometre ile hesaplanmalıdır.
15. Çeşitli hücre yüklü bioinks elde etmek için hücre pelet askıya almak için farklı SF-GelMA bioinks 2 mL kullanın.

2. SF-M-Katmanlı-GelMA'nın yüklenmesi, yeniden ısıtılması ve biyobaskısı

1. Şırınganın alt katmanına 0,4 mL hücre yüklü SF-0.5-GelMA yükleyin.
   NOT: Bu çalışmada bioink rezervuar ı olarak 2 mL şırınga kullanın. Farklı SF-GelMA bioink'leri şırıngaya katman katman şeklinde yükleyin.
2. 5 dakika boyunca şırıngayı buz su banyosuna (0 °C) yerleştirin ve alt tabakadaki bioink'in jel durumuna dönüşmesine neden olun.
3. Alt tabaka üzerinde hücre yüklü SF-0.75-GelMA bioink 0.4 mL yükleyin.
4. 5 dakika boyunca bir buz suyu banyosu (0 °C) bioinks iki tabaka ile şırınga yerleştirin biyoinks iki tabaka bir jel durumuna dönüşmesine neden.
5. Farklı katmanlarda Farklı SF konsantrasyonlarında çok katmanlı bir biyoink sistemi elde etmek için kalan 3 çeşit bioink (SF-1-GelMA, SF-1.25-GelMA, SF-1.5-GelMA) ile yükleme ve soğutma adımlarını 3 kez daha dönüştürün. Tüm bioinklerin yüklenmesinde kullanılan hacim 0.4 mL olmalıdır.
6. Çok katmanlı bioink'i, biyobaskıdan önce 30 dakika boyunca bir kuvöze (37 °C) yerleştirerek yeniden ısıtın.
7. 27 G baskı nozullu bioink rezervuarı olarak 2 mL şırınga kullanın. Akış hızını 50 μL/dk, nozulun hareketli hızını 2 mm/s olarak ve nozulun yüksekliğini 1 mm olarak ayarlayın. Biyobaskı işlemini oda sıcaklığında (yaklaşık 20 °C) gerçekleştirin.
   1. Önceki çalışmalardan uyarlanan parametreler^11,12altında özel yapım biyoyazıcı kullanarak doku yapısı bir ekstrüzyon şekilde yazdırın.
8. Biyobaskılı doku yapısını çapraz bağlamak için 40 s için ultraviyole ışık (365 nm, 800 mW) kullanın.
9. Kültür DMEM çapraz bağlı doku yapısı (Dulbecco modifiye Kartal orta) içeren 10% FBS ve bir kuvözde% 1 penisilin-streptomisin içeren (37 ° C ile 5% CO_2). Ortam ilk 2 gün ve sonrasında 2-3 günde bir 8 saatte bir değiştirildi.

Sonuçlar

Hücre yüklü biyoinklerin hazırlanması şeması Şekil 1'degösterilmiştir. Farklı bioinklerin hazırlanmasından sonra yükleme, yeniden ısıtma ve biyobaskı yapılmıştır (Şekil 2). Biyoink rezervuarındaki kapsüllü hücrelerin dağılımını değerlendirmek için, üç 96 kuyulu tabakada üç farklı hücre yüklü biyoink kullanılarak biyobaskı işlemi gerçekleştirilmiştir(Şekil 3A). Kapsüllü hücrelerin da...

Tartışmalar

Çok katmanlı sistemin kararlılığı, bu protokolü başarıyla gerçekleştirmek için önemli bir noktadır. Teorik olarak GelMA çözeltisindeki SF moleküllerinin difüzyonunu Nauman'ın¹³çalışmasına dayanarak hesapladık. Çözeltideki proteinlerin difüzyonunun molekül ağırlıklarıyla ilişkili olduğu bulunmuştur. Büyükbaş hayvan serum albumininin (MW) ortalama molekül ağırlığı (MW) 66.5 kDa olup difüzyon²katsayısı 64-72 m 2/s'dir. Fibrinojenin ortalama MW...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959)	TCI	M64BK-QD
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Gibco	15630080
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Gibco	10569044
fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10091
Gelatin	Sigma-Aldrich	V900863MSDS
Methacrylic anhydride (MA)	Sigma-Aldrich	276685MSDS
Penicillin–streptomycin antibiotics	Gibco	15140163
Phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	10010049
Silk fibroin	Advanced BioMatrix	5154