JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Organik ve sulu çözücülerin arayüzünde, özel ampifilik elastin benzeri proteinler veziküller, lifler ve çevresel parametrelertarafından tetiklenen koaksivatlar gibi karmaşık supramoleküler yapılarda bir araya getirilir. Açıklanan montaj protokolleri, çeşitli kargoların kapsüllemesini sağlayan, tunable özelliklere sahip Protein Membran Tabanlı Bölmeler (PMBCs) verir.

Özet

Özel proteinaceous yapı taşları minimal hücreler, ilaç dağıtım araçları ve enzim iskeleleri gibi supramoleküler yapıların montajı için çok yönlü adaylardır. Genetik düzeyde ki biyouyumluluk ve ayarı nedeniyle, Elastin benzeri proteinler (ELP) biyoteknolojik ve biyomedikal uygulamalar için ideal yapı taşlarıdır. Bununla birlikte, farklı fizyokimyasal özellikleri ve iyi kapsülleme potansiyeli ile protein bazlı supramoleküler yapıların montajı zor olmaya devam etmektedir.

Burada küresel koaservatlar, lifler ve kararlı veziküller gibi supramoleküler protein mimarileri içine ampifilik ELP'lerin güdümlü kendi kendine montajı için iki etkili protokol salıyoruz. Sunulan montaj protokolleri, uyarlanabilir fizyokimyasal özelliklere sahip ELP'lere dayalı Protein Membran Tabanlı Bölmeler (PMBCs) oluşturur. PMBC'ler faz ayırma davranışını gösterir ler ve yönteme bağımlı membran füzyonlarını ortaya çıkarırlar ve kimyasal olarak çeşitli floresan kargo moleküllerini kapsülleyebilmektedirler. Ortaya çıkan PMBCs bir ilaç formülasyonu ve dağıtım platformu, yapay hücre ve bölümlü reaksiyon alanı olarak yüksek bir uygulama potansiyeline sahip.

Giriş

Biyoteknolojik uygulamalar için supramoleküler yapıların montajı giderek daha önemli hale geliyor1,2,3,4,5. Koaservates, veziküller ve lifler gibi fonksiyonel mimarilerin istenilen fizikokimyasal özelliklere sahip bir araya toplanması için bileşenlerin fizikokimyasal ve konformasyonel özelliklerini anlamak ve kontrol etmek önemlidir. Doğada bulunan moleküllerin moleküler hassasiyeti nedeniyle, supramoleküler yapıların yapı taşları giderek lipidlere, nükleik asitlere veya proteinlere dayanmaktadır. Sentetik polimerlerle karşılaştırıldığında, proteinaceous yapı taşları genetik düzeyde acil supramoleküler yapılar6 üzerinde hassas kontrol sağlar. Bireysel protein yapı taşlarının birincil amino asit (aa) dizisi, molekülerden makroskopik düzeye kadar olan montaj potansiyeline yönelik bilgileri ve son supramoleküler yapının üç boyutlu şekli ve fiziksel özelliklerini özünde kodlar7.

Farklı supramoleküler yapıların biraraya toplanması için bildirilen yöntemler genellikle ısıya duyarlı elastin benzeri proteinler (ELP) gibi amfilik proteinleri içerir.5,8,9, rekombinant oleosin10ve yapay protein amphiphiles11. Sıcaklık tetiklenen yöntemler misellerin montajına yol açmıştır4,10,12Lif13Yaprak14ve veziküller9,15,16. Dinamik protein bazlı veziküllerin oluşumu için organik çözücüler içeren yöntemler uygulanmıştır.8,11,14. Şimdiye kadar, vezikül oluşumu için uygulanan protokoller genellikle mikrometre büyüklüğündeki montajlar üzerinde montaj kontrolü eksikliği16,17veya sınırlı montaj verime sahip5. Buna ek olarak, rapor edilen bazı ELP bazlı veziküller kapsülleme potansiyelini bozmuş12veya zaman içinde sınırlı stabilite9. Sunulan protokoller, bu sakıncaları ele alarak, farklı fizyokimyasal özelliklere, iyi kapsülleme potansiyeline ve uzun süreli stabiliteye sahip mikrometre ve alt mikrometre boyutunda supramoleküler yapıların kendi kendine biraraya getirilmesini sağlar. Özel ampifilik ELP'ler, uygulanan protokol ve ilgili çevre koşullarına bağlı olarak küresel koaservatlar ve yüksek derecede sıralanmış bükümlü lif demetlerinden unilamellar veziküllere kadar geniş bir yelpazeyi kapsayan supramoleküler yapılarda bir araya getirilir. Büyük vesiküler Protein Membran Esaslı Bölmeler (PMBC) membran füzyonu ve faz ayırma davranışı gibi tüm ana fenotipleri lipozomlara benzer olarak ortaya koymaktadır. PMBC'ler, basit epifloresan mikroskobu kullanılarak izlenebilen kimyasal olarak çeşitli floresan kargo moleküllerini etkin bir şekilde kapsüllerler. Bu çalışmada kullanılan tekrarlayan ELP alanları protein bazlı supramoleküler mimariler için çekici yapı taşlarıdır.18. ELP pentapeptid tekrar ünitesi (VPGVG) yapısal ve fonksiyonel özelliklerini korurken, dördüncü pozisyonda proline (valine, V) dışında farklı aa tolere bilinmektedir19. Farklı hidrofilik ve hidrofobik etki alanları içeren amfilik ELP'lerin tasarımı, VPGXG'ye farklı hidrofobiklik, polarite ve şarj ile aa konuk kalıntıları (X) yerleştirilerek gerçekleştirildi.20. Hidrofilik etki alanı misafir kalıntısı olarak yüklü glutamik asit (E) veya arginin (R) içererken, hidrofobik fenilalanin (F) veya izolösin (I) ile donatılmış amfilik ELP etki alanları. Uygun amfilik ELP yapıları ve ilgili aa dizileri listesi ek bilgi ve referanslar bulunabilir8,21. Floresan mikroskopisi ile görselleştirme için küçük floresan boyalar veya floresan proteinler ile donatılmış tüm yapı taşları. mEGFP ve diğer floresan proteinler N-terminalel ELP amphiphiles hidrofilik etki alanlarında erimiş edildi. Organik boyalar bakıriçermeyen suşu ile alkine-azid sikloaddition (SPAAC) ile eş-çeviriile doğal olmayan amino asit (UAA) ile konjuge edildi. UAA'nın ortak çevirisipara-azidophenylalanine (pAzF)22hidrofilik ELP etki alanının N-terminal modifikasyonuna izin verir. Bu şekilde yeşil floresan boya BDP-FL-PEG4-DBCO (BDP) veya süzme siklotine sahip herhangi bir küçük floresan molekül floresan prob olarak kullanılabilir. UAA pAzF'in başarılı bir şekilde eklenmesi ve boyanın SPAAC ile sikloeklenmesi, ilgili triptik peptidlerin verimli iyonizasyonu nedeniyle LC-MS/MS ile kolayca doğrulanabilir.8. Floresan proteinler çoğu organik çözücüile uyumsuz olduğundan, bu küçük organik boya montaj protokolleri için çözücü seçimini genişletmek için uygulanmıştır. Laboratuarımızda geliştirilen supramoleküler yapılar için en verimli iki montaj protokolü aşağıda açıklanmıştır. THF şişme yöntemi sadece organik boya modifiye amfilik ELP ile uyumludur. Buna karşılık, 1-butanol (BuOH) ekstrüzyon yöntemi floresan prob gibi birçok protein ile uyumludur, örneğin mEGFP, açıklanan yöntem bu füzyon proteinlerinin floresansını tamamen koruduğundan. Buna ek olarak, küçük moleküllerin kapsülleme ve vesiküler füzyon davranışı En iyi BuOH ekstrüzyon yöntemi istihdam çalışır.

Protokol

1. Amfilik elastin benzeri proteinlerin (ELP) tasarımı ve klonlanması

  1. Klon ve başka bir yerdeaçıklandığıgibi yapıları tasarım 8,20. Plazmidler istek üzerine mevcuttur.

2. Protein ekspresyonu, arınma ve hazırlama

  1. F20E20-mEGFP ve F20E20-mCherry ekspresyonu
    1. Ana ifade kültürünü bir gecede ön kültürden 0,3'ün OD600'üne bağla. 37 °C'de kuluçka, steril 400 mL LB ortamda 2 L'lik bir şişede uygun antibiyotiklerle desteklenerek 200 rpm.
    2. IpTG stok çözeltisini (1 M) ultra saf suda ifade kültürünün indüksiyonu için hazırlayın.
    3. OD600 0.5-0.8'e ulaşıldığında, ifade kültürüne IPTG'yi 1 mM'lik son konsantrasyona ekleyin ve kuluçka sıcaklığını 20 °C'ye düşürün. 200 rpm'de yaklaşık 20 saat boyunca 20 °C'de ifadeye izin verin.
  2. UAA pAzF içeren amfilik ELP ekspresyonu
    1. İki plazmid pEVOL pAzF ve örneğin pET28-NMBL-(TAG)R40F20-onun 0.3'ün OD600'ünü içeren gecee ait E. coli ön kültürden ana ifade kültürünü aşılamak (amino asit dizileri için ek bilgilere bakın). 37 °C'de kuluçka, steril 400 mL LB orta kanamisin ve kloramfenikol ile desteklenen 2 L şişede 200 rpm.
    2. Ultra saf suda 100 mM pAzF stok çözeltisi hazırlayın. 10 mL pAzF stok çözeltisi için 206,2 mg pAzF ağırlığında ve 8 mL ultra saf suda yeniden askıya alın. pAzF'ı eritmek için çözeltinin pH'ını 3 M NaOH ile yükseltin ve şiddetle karıştırın. pAzF çözündüğünde, pH'ı dikkatlice 10,5'e düşürün ve 10 mL'lik son hacmine ultra saf su ekleyin. Steril filtre (0,22 μm) kullanın ve çözeltiyi 2 mL reaksiyon tüpünde aliquot kullanın.
    3. Ultra saf suda 1 M IPTG stok çözeltisi ve ultra saf suda %20 arabinose stok çözeltisi hazırlayın.
    4. OD600 0.5-0.8'e ulaşıldığında, ifade kültürüne 2 mM'lik son konsantrasyona pAzF ekleyin. PAzF alımı için izin vermek için 10 dakika, 37 °C, 200 rpm için kuluçka kültürü.
    5. IpTG (1 mM) ve arabinose 'un eşzamanlı ilavesi ile hedef proteinin ekspresyonu ve gerekli tRNA/t-RNA sentezinin ekspresyonu (%2) kuluçka sıcaklığını 20 °C'ye düşürün.
    6. 200 rpm'de yaklaşık 20 saat boyunca 20 °C'de ifadeye izin verin. 4 °C, 4000 x g,40 dk.
  3. Hücre lisisi ve protein arınması
    1. Lysis tamponundaki E. coli peletini (kültür litresi 10 mL; 50 mM Tris-HCl pH 8, 500 mM NaCl, 4 M üre, %0,25 Triton X-100) lizozym (0.1 mg/mL) ve PMSF (0.1 mM) içeren yeniden askıya alın. Buz üzerinde 30 dakika kuluçka ve dondurma ve iki kez daha sonra sıvı azot içinde örnek batırarak çözülme.
    2. Süspansiyonu sonicate (30%, 15 kez, 30 s: 10 s) ve santrifüj (4 °C, 40.000 x g için 40 dk) ile lysate temizleyin.
    3. Afinite kromatografisi kullanarak proteini arındırın (örn. bir kesir kolektöre bağlı bir FPLC sistemi kullanarak 1 mL nikel kolonda; bkz. Elüsyon tamponu (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 4 M üre, 250-500 mM imidazol) ile proteini yakınlaştırın ve 4 °C'de ilave edilene kadar saklayın.
    4. Arınma verimliliğini SDS-PAGE üzerinden analiz edin.

3. SPAAC ile ELP'lerin boya-modifikasyonu

  1. Kabaca ELP çözeltisinin konsantrasyonu tahmin.  PAzF-R40F20 dizisi UV aralığında emici amino asitler eksik olduğundan konsantrasyon değerlendirmesi için280 emilimi değerli değildir. Bu nedenle, daha önce lyophilized ve ağırlıklı ELP amphipileS PAGE bant karşılaştırma için bir referans olarak kullanılabilir. ElP çözeltilerinden sds page bantlarının toplam gri değer intesitesinin bilinen konsantrasyonlarla karşılaştırılması ve numunenizin kaba konsantrasyonu tahmin edilebilir.
  2. 500 μL ELP çözeltisine (~20 μM) 1 000 adet floresan boya BDP-FL-PEG4-DBCO (10 mM stok çözeltisi; 20 μM son konsantrasyon) ekleyin. 15 °C'de yaklaşık 10 saat boyunca reaksiyon uyguluyor, titreyerek ve ışıktan korunarak.
  3. Daha fazla kullanım için aşırı BDP'yi kaldırmak için reaksiyonu diyalize sin.
    1. Diyaliz membranını (örn. 12 kDa kesme) ultra saf suda 10 dakika boyunca dengeleyin. Açılışta diyaliz membranı düzeltmek için, böylece tüp kapatarak, açılış üzerine delikli çekirdek ile bir reaksiyon tüpü kapağı yerleştirin.
    2. Reaksiyon tüpünü seçilen arabelleğe ters yerleştirin. Her seferinde en az 3 saat diyalizden sonra tamponu (2-5 L) iki kez değiştirin. Başarılı diyaliz sağlamak için diyaliz membran ve tampon arasında sıkışmış herhangi bir hava kabarcıkları çıkarın.

4. THF şişme protokolü

  1. Fosfat veya tris tampon (10 mM) kararlı pH 7.5 tuzları ve onun etiketi saflaştırma kalan bileşikleri kaldırmak için karşı homojen ELP çözeltisi diyaliz.
  2. Lyophilizer hazırlayın ve dondurularak kurutma için başlangıç sıcaklığına kadar soğutun.
  3. Aliquot diyaliz protein çözeltisi 1.5 mL reaksiyon tüpleri (tüp başına 50-500 μL) ve şok dondurma sıvı nitrojen. Donma-kurutma sırasında farklı protein çözeltilerinin istenmeyen şekilde karıştırılmasını önlemek için, reaksiyon tüpünün üzerine küçük bir delik olan kapaklar konulabilir ve kısmen kapatılabilir.
  4. Dondurulmuş protein örneklerini sıvı nitrojenden alın ve dondurularak kurumaya başlamak için hemen lyophilizer'a yerleştirin. Numune tamamen kuruduğunda (yaklaşık 24-48 saat) dondurularak kurutulma işlemi tamamlanır. Daha sonra, kuru N2ile liyofilize amfilik ELP'leri havalandırın, ardından hava nemi ile temas tan kaçınmak için reaksiyon tüpkapaklarını hemen kapatın.
  5. Lyophilized örnekleri (ELP, 5-10 μM) saf THF ekleyin ve THF ELP şişmesine izin vermek için 15 dakika boyunca buzlu su içeren bir su banyosu sonicator çözüm yerleştirin.
  6. Vezikül oluşumu için 30-60 °C'ye kadar veya lif oluşumu için 90 °C'ye kadar bir termocycler önceden ısıtın ve ultra saf su veya tampon içeren yeni reaksiyon tüpleri hazırlayın (50 mM NaH2PO4/Na2HPO4, 50 mM NaCl, pH 5–13). Küresel koacervatlar pH 9-13 içinde ağırlıklı olarak 20 °C'de toplanır. Vezikül oluşumu pH 7 ve 9 arasında 50-60 °C'de tercih edilir. Lif oluşumu pH 5 ve 12 arasında 60 °C'nin üzerinde ön kaynaklıdır.
  7. Sonication adım sonra, termocycler hazırlanan ultrasaf su veya tampon çözeltisi yanı sıra ELP / THF çözeltisi yerleştirin ve 5 dakika boyunca istenilen sıcaklığa kadar ısıtın. Sıcaklık elde edildiğinde önceden ısıtılmış ELP/THF çözeltisi önceden ısıtılmış ultra saf su veya tampon çözeltisinin üzerine dikkatlice tabakalaştırılmalıdır. İki aşamanın ayrı bir arabirimi ile net bir ayrımı görünür olmalıdır.
  8. Karışımı tekrar termocycler'a yerleştirin ve arayüze vezikül veya lif oluşumuna izin vermek için 20 dk kuluçkaya yatırın. Daha sonra, floresan mikroskopi veya diyaliz yoluyla analiz önce 10 dakika oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin.
  9. Ultra saf su veya tampona karşı supramoleküler yapıları içeren diyaliz çözeltisi (50 mM NaH2PO4/Na2HPO4,50 mM NaCl, pH 7-10).

5. BuOH ekstrüzyon protokolü

  1. Ultra saf su veya tamponda 1-50 μM ELP çözeltisi hazırlayın (50 mM PB pH 7.5, 100 mM NaCl, 4 M üre içerebilir). Amfilik ELP F20R20-mEGFP ve F20R20-mCherry çözeltisinin konsantrasyonu molar yok olma katsayıları (F20R20-mEGFP A280 = 22015 M-1 cm-1 ve F20R20-mCherry A280 = 34380 M-1 cm-1) (ek bir dizi için bkz.
  2. %10-20 (v/v) 1-butanol ekleyin ve hemen yukarı ve aşağı boru lama veya bir şırınga ile birden fazla kez çizerek çözeltikarıştırın. 0,25 x 25 mm iğne ile donatılmış ortak bir 100 μL pipet veya Hamilton şırınga uygulanabilir. Karıştırma sırasında çözeltinin bulanıklığı artmalıdır, vezikül oluşumunu gösteren. 1-oktanol %5-15% (v/v) 1-butanol yerine vezikül ekstrüzyonu için de kullanılabilir.
  3. Dar bir boyut dağılımı elde etmek için, oda sıcaklığında 1 μm gözenek boyutuna sahip bir membran aracılığıyla mini ekstrüzyon kullanarak vezikülleri ekstrüzyon. Ekstrüzyon için kullanılan membran boyutu veziküllerin üst boy kesme belirler.
  4. Diyaliz veziküller yukarıda açıklandığı gibi (adım 3.3) kalıntı 1-butanol kaldırmak için.

6. BuOH ekstrüzyon protokolü ile boyama kapsülleme

  1. 10 mM Tris-HCl'de yaklaşık 40 μL ELP çözeltisi, 1 μL Dextran Texas Red (0.0025 mg/mL son konsantrasyon) ile pH 8'i karıştırın.
  2. Çözeltiye 10 μL BuOH ekleyin ve 0,25 x 25 mm iğne ile donatılmış bir şırınga ile 5-10 kez dışarı çıkar.

7. Floresan mikroskopi ile supramoleküler yapıların analizi

  1. Bir cam slayt üzerine bir takviye halkası yerleştirin ve sıkıca cam yapışkan tarafı basın.
  2. Takviye halkasının içine numunenin 5 μL'sini ekleyin ve üzerine bir kapak fişi yerleştirin.
  3. Analiz sırasında numunenin buharlaşmasını önlemek için numuneyi kapak kapağındaki kenarlara oje ile kapatın.
  4. Daha önce açıklandığı gibi floresan mikroskobu yürütmek8.

Sonuçlar

Vezikül üretimi için protokol geliştirme
Şekil 1 iki farklı vezikül hazırlama yöntemleri özetliyor. Sol taraftaki THF şişme yöntemi art arda üç adımdan oluşur ve sıcaklığa bağlı olarak ELP'nin farklı supramoleküler montajları ile sonuçlanır. Şekil 1A epifloresan mikroskopi görüntülerinde BDP-R20F20'den birleştirilmiş veziküller ve BDP-R40F20'den monte edilen fibrillary yapılar g?...

Tartışmalar

Tanımlanan supramoleküler yapıların montajı için açıklanan protokolleri takip eden bir hata, esas olarak spesifik olmayan agregaların(Şekil 2, IV) oluşumuna ya da homojen olarak dağıtılan ELP-amphipilelerin oluşumuna yol açar. Protokolün kritik adımları aşağıda ele alınmıştır:

Amfilik ELP'nin yüksek ekspresyon verimi için 20°C'lik nispeten düşük bir sıcaklık en uygun uyruktur. Amfilik ELP'nin başarılı afinite dayalı saflaşmas...

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları beyan.

Teşekkürler

Yazarlar mali destek için BMBF ve Biyolojik Sistemler Analizi Merkezi (ZBSA) araştırma tesisi sağlamak için teşekkür ederiz. Biz Plazmid pEVOL-pAzF sağlamak için P. G. Schultz, TSRI, La Jolla, California, ABD müteşekkiriz. Albert-Ludwigs-University Freiburg Biyolojik Sistem Analizi Merkezi'ndeki (ZBSA) Yaşam Görüntüleme Merkezi (LIC) personeline konfokal mikroskopi kaynakları ve görüntü kaydındaki mükemmel destek için teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1 µm and 0.2 µm Steril FilterVWR
1,4-DithiothreitolMerck
1-butanol. >99.5% p.a.Roth
2log DNA ladderNEB
2-MercaptoethanolRoth
50 mL Falcon tubesVWR
79249 Alkyne Mega Stokes dyeSigma Aldrich
Acetic acid glacialVWR
Acetonitrile, anhydrous, 99.8%Sigma-Aldrich
Ampicillin sodium-salt, 99%Roth
BDP-FL-PEG4-DBCOJena Bioscience
BiofugeHeraeus
Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm)Thermo Scientific
Brillant Blue G250 (Coomassie)Roth
BspQINEB
Camera DS Qi1Nikon
Centrifuge 5417rEppendorf
Centrifuge 5810rEppendorf
CF-400-Cu square mesh copper gridEMS
ChloramphenicolRoth
CompactStar CS 4VWR
Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutralLife Technologies
Digital sonifierBranson
Dimethylsulfoxide (DMSO)Applichem
Dnase IApplichem
EarINEB
EcoRI-HFNEB
Environmental shaker incubator ES-20Biosan
Ethanol absoluteRoth
Ethidium bromide solutionRoth
Filter supportsAvanti
Glass platesBio-Rad
Glycerol Proteomics GradeAmresco
GlycinApplichem
H4-Azido-Phe-OHBachhem
Heat plate MR HeiTecHeidolph
HindIIINEB
HisTrap FF crude columnGE Life SciencesNickel column
Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a.Merck
Illuminator ix 20INTAS
Illuminator LAS-4000Fujifilm
ImidazoleMerck
Immersions oil for microscopyMerck
Incubators shakers Unimax 1010Heidolph
Inkubator 1000Heidolph
IPTG, >99%Roth
KanamycinsulfateRoth
L(+)-ArabinoseRoth
Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCESartorius
LB-MediumRoth
Lyophilizer Alpha 2-4 LSCChrist
Lysozyme, 20000 U/mgRoth
Microscope CM 100Philips
Microscope Eclipse TS 100Nikon
Microscopy cover glasses (15 x 15 mm)VWR
Microscopy slidesVWR
MicrowaveStudio
Mini-Extruder SetAvanti Polar Lipids
NaCl, >99.5%, p.a.Roth
Natriumhydroxid pelletsRoth
Ni-NTA Agarose, PerfectPro5 Prime
Nucleopore Track-Etch MembraneAvanti
PH meter 766 calimaticKnick
Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF)Roth
Polypropylene Columns (1 mL)Qiagen
PowerPac basicBioRad
Propanol-2-olEmplura
Protein ladder 10-250 kDaNEB
Recirculating cooler F12Julabo
Reinforcement ringsHerma
SacI HFNEB
SDS PelletsRoth
Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4VWR
Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose AcetateVWR
T4 DNA LigaseNEB
TEMEDRoth
TexasRed Dextran-ConjugateMolecularProbes
Thermomix comfortEppendorf
THF, >99.5% p.a.Acros
Triton X 100Roth
Trypton/Pepton from CaseinRoth
Ultrasonic cleanerVWR
Urea p.a.Roth
Vacuum pump 2.5Vacuubrand
XbaINEB
XhoINEB
ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V)Roth

Referanslar

  1. Elzoghby, A. O., Samy, W. M., Elgindy, N. A. Protein-based nanocarriers as promising drug and gene delivery systems. Journal of Controlled Release. 161 (1), 38-49 (2012).
  2. Jang, Y., Champion, J. A. Self-Assembled Materials Made from Functional Recombinant Proteins. Accounts of Chemical Research. 49 (10), 2188-2198 (2016).
  3. Timmermans, S. B. P. E., van Hest, J. C. M. Self-assembled nanoreactors based on peptides and proteins. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 35, 26-35 (2018).
  4. Dreher, M. R., et al. Temperature Triggered Self-Assembly of Polypeptides into Multivalent Spherical Micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (2), 687-694 (2008).
  5. Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).
  6. Matsuurua, K. Rational design of self-assembled proteins and peptides for nano- and micro-sized architectures. RSC Advances. 4 (6), 2942-2953 (2013).
  7. Rocklin, G. J., et al. Global analysis of protein folding using massively parallel design, synthesis, and testing. Science. 357 (6347), 168-175 (2017).
  8. Schreiber, A., Stühn, L. G., Huber, M. C., Geissinger, S. E., Rao, A., Schiller, S. M. Self-Assembly Toolbox of Tailored Supramolecular Architectures Based on an Amphiphilic Protein Library. Small. 15 (30), 1900163 (2019).
  9. Jang, Y., Hsieh, M. -. C., Dautel, D., Guo, S., Grover, M. A., Champion, J. A. Understanding the Coacervate-to-Vesicle Transition of Globular Fusion Proteins to Engineer Protein Vesicle Size and Membrane Heterogeneity. Biomacromolecules. 20 (9), 3494-3503 (2019).
  10. Vargo, K. B., Sood, N., Moeller, T. D., Heiney, P. A., Hammer, D. A. Spherical micelles assembled from variants of recombinant oleosin. Langmuir: the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (38), 11292-11300 (2014).
  11. Bellomo, E. G., Wyrsta, M. D., Pakstis, L., Pochan, D. J., Deming, T. J. Stimuli-responsive polypeptide vesicles by conformation-specific assembly. Nature Materials. 3 (4), 244-248 (2004).
  12. Martín, L., Castro, E., Ribeiro, A., Alonso, M., Rodríguez-Cabello, J. C. Temperature-Triggered Self-Assembly of Elastin-Like Block Co-Recombinamers:The Controlled Formation of Micelles and Vesicles in an Aqueous Medium. Biomacromolecules. 13 (2), 293-298 (2012).
  13. Li, Y., Rodriguez-Cabello, J. C., Aparicio, C. Intrafibrillar Mineralization of Self-Assembled Elastin-Like Recombinamer Fibrils. ACS Applied Materials & Interfaces. , (2017).
  14. Vargo, K. B., Parthasarathy, R., Hammer, D. A. Self-assembly of tunable protein suprastructures from recombinant oleosin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (29), 11657-11662 (2012).
  15. Park, W. M., Champion, J. A. Thermally Triggered Self-Assembly of Folded Proteins into Vesicles. Journal of the American Chemical Society. 136 (52), 17906-17909 (2014).
  16. Vogele, K., et al. Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments. Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).
  17. Vogele, K., et al. In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth. Journal of Visualized Experiments. (148), e59831 (2019).
  18. Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2015).
  19. Urry, D. W., et al. Elastin: a representative ideal protein elastomer. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).
  20. Huber, M. C., Schreiber, A., Wild, W., Benz, K., Schiller, S. M. Introducing a combinatorial DNA-toolbox platform constituting defined protein-based biohybrid-materials. Biomaterials. 35 (31), 8767-8779 (2014).
  21. Schreiber, A., Huber, M. C., Schiller, S. M. Prebiotic Protocell Model Based on Dynamic Protein Membranes Accommodating Anabolic Reactions. Langmuir. 35 (29), 9593-9610 (2019).
  22. Chin, J. W., Santoro, S. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of p-Azido-l-phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  23. Sonnino, S., Prinetti, A. Membrane domains and the "lipid raft" concept. Current Medicinal Chemistry. 20 (1), 4-21 (2013).
  24. Bräse, S., Gil, C., Knepper, K., Zimmermann, V. Organische Azide - explodierende Vielfalt bei einer einzigartigen Substanzklasse. Angewandte Chemie. 117 (33), 5320-5374 (2005).
  25. Li, Z., et al. Large-Scale Structures in Tetrahydrofuran–Water Mixture with a Trace Amount of Antioxidant Butylhydroxytoluene (BHT). The Journal of Physical Chemistry B. 115 (24), 7887-7895 (2011).
  26. Huber, M. C., Schreiber, A., Schiller, S. M. Minimalist Protocell Design: A Molecular System Based Solely on Proteins that Form Dynamic Vesicular Membranes Embedding Enzymatic Functions. ChemBioChem. 20 (20), 2618-2632 (2019).
  27. Raghunathan, G., et al. A comparative study on the stability and structure of two different green fluorescent proteins in organic co-solvent systems. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 18 (2), 342-349 (2013).
  28. Sallach, R. E., et al. Long-term biostability of self-assembling protein polymers in the absence of covalent crosslinking. Biomaterials. 31 (4), 779-791 (2010).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

KimyaSay 158elastin benzeri proteinlerprotein bazl vezik llerprotein lifleriila da t m sistemlerikendi kendine montajprotein membran

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır