Bozulmuş FFPE-RNA Örneklerinin Dizileştirilmesi ve Analizi için Optimizasyon

Özet

Bu yöntem, formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) RNA örneklerinden elde edilebilen sıra verilerinin kalitesini ve miktarını artırmaya yönelik adımları açıklar. FFPE-RNA örneklerinin kalitesini daha doğru değerlendirmek, sıralama kitaplıkları hazırlamak ve FFPE-RNA örneklerinden elde edilen verileri analiz etmek için metodolojiyi tanımlıyoruz.

Özet

RNA dizilimi (RNA-seq) ile gen ekspresyonu analizi, çeşitli hastalıkların temelinin mekanistik olarak anlaşılmasına ve direnç ve/veya duyarlılık mekanizmalarına yol açabilecek klinik örneklere benzersiz içgörüler sağlar. Ancak klinik örneklerde doku morfolojisini korumak için en yaygın yöntemi temsil eden FFPE dokuları gen ekspresyonu profilanalizi için en iyi kaynaklar değildir. Bu tür örneklerden elde edilen RNA genellikle bozulmuş, parçalanmış ve kimyasal olarak değiştirilmiştir, bu da alt optimal sıralama kitaplıklarına yol açar. Buna karşılık, bu gen ekspresyon analizi ve mutasyon keşfi için güvenilir olmayabilir düşük kaliteli dizi verileri üretir. FFPE örneklerinden en iyi şekilde yararlanabilmek ve düşük kaliteli numunelerden mümkün olan en iyi verileri elde etmek için, deneysel tasarım planlarken, sıralama kitaplıklarını hazırlarken ve veri analizi sırasında bazı önlemler almak önemlidir. Bu, kesin örnek kalite denetimi (QC) için uygun ölçümlerin kullanımını, sıralama kitaplığı oluşturma sırasında çeşitli adımlar için en iyi yöntemleri tanımlamayı ve dikkatli kitaplık QC'sini içerir. Buna ek olarak, rna-seq verilerindeki yapıları belirlemek, kontaminasyonve düşük kaliteli okumaları filtrelemek, gen kapsamının tekdüzeliğini değerlendirmek ve biyolojik çoğaltmalar arasında gen ekspresyonu profillerinin tekrarlanabilirliğini ölçmek için doğru yazılım araçları ve parametrelerinin uygulanması çok önemlidir. Bu adımlar, çok heterojen RNA örneklerinin profillemesi için yüksek doğruluk ve tekrarlanabilirlik sağlayabilir. Burada örnek QC, kütüphane hazırlama ve QC, sıralama ve ffpe-RNA dokularından elde edilen düşük kaliteli RNA elde edilen yararlı veri miktarını artırmak için yardımcı olabilir veri analizi için çeşitli adımları açıklar.

Giriş

Yeni nesil sıralama yaklaşımlarının kullanımı, çeşitli örnek türlerinden bilgi hazinesi elde etmemizi sağlamıştır. Ancak, eski ve kötü korunmuş örnekler, dizi verileri oluşturmanın yaygın olarak kullanılan yöntemleri için kullanılamaz durumda kalır ve genellikle iyi kurulmuş protokollerde değişiklik yapılmasını gerektirir. FFPE dokuları klinik örnekler^1,2,3için yaygın olarak kullanılan böyle bir örnek tipi temsil eder. FFPE koruma doku morfolojisi korurken, FFPE dokularda nükleik asitler genellikle hasar ve bozulma geniş bir yelpazede sergileyen, zor çeşitli bozuklukların altında yatan moleküler mekanizmalar hakkında önemli anlayışlara yol açabilir genomik bilgi almak için yapım.

RNA dizilimi ile oluşturulan gen ekspresyonu verileri genellikle hastalık ve direnç mekanizmalarının incelenmesinde etkilidir ve DNA mutasyon analizini tamamlar. Ancak, RNA bozulmaya daha duyarlıdır, ffpe dokulardan doğru gen ekspresyonu verileri oluşturmak için daha zor hale. Ayrıca, sıralamanın geniş kullanılabilirliği ve karşılanabilirliği nispeten yeni olduğundan, eski numuneler genellikle RNA bütünlüğünü korumak için gerekli koşullarda depolanmadı. FFPE örnekleri için bazı sorunlar parafin gömme nedeniyle RNA bozulması, parçalanma veya sıralama için gerekli enzimatik süreçlere kırılmaya yol açan RNA kimyasal modifikasyon, ve poli-A kuyrukları kaybı, ters transkript için bir astar olarak oligo-dT uygulanabilirliğini sınırlayan⁴. Bir diğer zorluk da FFPE numunelerinin optimal olmayan koşullarda işlenmesi/depolanmasıdır, bu da dokularda RNA gibi labile moleküllerinin daha da bozulmasına yol açabilir^5. Bu, özellikle rna dizilimi ile gen ekspresyonu analizinin numuneler için beklenmediğinin bir zamanda toplanmış olabilecek eski numuneler için geçerlidir. Tüm bunlar, yararlı dizi verileri oluşturmak için kullanılabilir çıkarılan RNA'nın kalitesinin ve miktarının düşmesine yol açar. Başarının düşük olasılığı, sıralamanın yüksek maliyetiyle birleştiğinde, birçok araştırmacıyı potansiyel olarak yararlı FFPE örneklerinden gen ekspresyonu verilerini oluşturmaya ve analiz etmeye çalışmaktan caydırmıştır. Son yıllarda yapılan bazı çalışmalar ffpe dokularının gen ekspresyonu analizi^2,6,^7,,8,9için kullanılabilirliğini göstermiştir, daha az ve/veya daha yeni örnekler için de olsa.

Bir fizibilite çalışması olarak, Gözetim, Epidemiyoloji ve Son Sonuçlar (SEER) rna sekanslama ve gen ekspresyonu analizi için kanser kayıt larından üç Artık Doku Depolarından FFPE tümör doku örneklerinden elde edilen RNA'yı^{kullandık 10}. Klinik patoloji laboratuvarlarından temin edilen yüksek dereceli yumurtalık seröz adenosinomlarından FFPE dokuları RNA ekstraksiyonundan önce değişen koşullarda 7-32 yaş ları arasında saklandı. Çünkü çoğu durumda bu bloklar gelecekte herhangi bir hassas genetik analiz beklentisi olmadan yıllardır farklı sitelerde saklanmış, nükleik asitleri korumak için çok fazla özen alınmamıştı. Böylece, örneklerin çoğu düşük kaliteli RNA sergiledi, örneklerin büyük bir kısmı bakteri ile kontamine. Bununla birlikte, gen ölçümü yapabildik, gen kapsamının tekdüzeliğini ve sürekliliğini ölçebildik ve tekrarlanabilirliği ölçmek için biyolojik kopyalar arasında Pearson korelasyon analizini yaptık. Anahtar imza gen paneli bir dizi dayanarak, biz Kanser Genom Atlası (TCGA) verileri ile çalışmamızda örnekleri karşılaştırıldığında ve örneklerin yaklaşık% 60 karşılaştırılabilir gen ekspresyonu profilleri¹¹olduğunu doğruladı. Çeşitli QC sonuçları ve örnek meta veriler arasındaki korelasyona dayanarak, kullanılabilir dizi verileri¹¹oluşturma olasılığı daha yüksek olan örnekleri tanımlamak için iyi tahmin değerine sahip anahtar QC ölçümleri belirledik.

Burada FFPE-RNA kalite değerlendirmesi için kullanılan metodolojiyi, çıkarılan RNA örneklerinden başlayarak sıralama kitaplıklarının oluşumunu ve sıralama verilerinin biyoinformatik analizini açıklıyoruz.

Protokol

1. RNA miktar ve kalite değerlendirmesi

1. FFPE örneklerini önceden tanımlanmış kriterlere göre seçin ve uygun bir yöntemle RNA ayıklayın (örneğin, FFPE-çekirdekli asit ekstraksiyon kiti, Malzeme Tablosu).
   NOT: FFPE-RNA ekstraksiyonu için çok az doku ile çalışabilen ve kaliteli RNA^12,13,,14çıkarabilen yeni mikrodiseksiyon yöntemleri de dahil olmak üzere birçok farklı yöntem mevcuttur.
2. RNA'nın bütünlüğünü her aşamada korumak için azami özen verilmelidir. Buna RNase içermeyen deiyoniste suile çalışmak, RNase içermeyen plastik eşyalar kullanmak ve RNase dekontaminasyon reaktifleriyle FFPE bloklarıyla temas eden tüm cihazların temizlenmesi dahildir.
3. RNA her zaman dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır ve işleme sırasında bozulmayı en aza indirmek için aksi belirtilmedikçe buzda tutulmalıdır.
4. Yeterli malzeme varsa, FFPE bloğundaki birden fazla bölgeden RNA ayıklayın ve mümkün olduğunca çok örnekten biyolojik kopyalar oluşturun. Yeterli RNA verime sahip örneklerin bazıları için, çıkarılan RNA'yı teknik çoğaltma olarak işlemek üzere ikiye bölün.
5. Mümkünse, büyük olasılıkla RNA bozulmasına yol açacaktır tekrarlanan işleme ve donma-çözülme döngüleri önlemek için QC (yani, bir QC aliquot) için ekstraksiyon sonra ayrı ayrı örnek küçük bir miktar toplamak.
6. Üreticinin talimatlarına göre RNA'nın (tercihen QC aliquot'dan) kalitesini bir RNA QC sistemi (örneğin, RNA Nano çip, Malzeme Tablosu)kullanarak Çalıştırarak kontrol edin.
7. 200 nt (DV₂₀₀₎veya 100 nt (DV₁₀₀₎boyutundan büyük parçaların yüzdesi olarak DV₂₀₀ ve DV₁₀₀ değerlerini hesaplayarak örneklerdeki RNA parçalarının dağılımını (örneğin, Bioanalyzer 2100 Expert yazılımını kullanarak) analiz edin.
8. DV₂₀₀ ve DV₁₀₀arasında, verilen örnek kümesi için daha büyük bir değer dağılımına sahip olan ölçütü tanımlayın ve numunelerin bozulma derecesine göre gruplandırmak için bunu seçin.
   NOT: Daha sağlam RNA moleküllerine (yani yüksek DV₂₀₀ değerlerine, tümü veya çoğu DV₂₀₀ > %40) olan numune kümeleri için DV_200'ün yararlı bir QC ölçümü olması olasıdır. Ancak, daha bozulmuş transkriptlere (yani düşük DV₂₀₀ değerlerine, tümü veya çoğu DV₂₀₀ < %40) olan örnek kümeler için DV_100'ün yararlı olma olasılığı daha yüksektir.
9. QC ölçümlerine göre, DV₁₀₀ < %40'ı olan örnekleri tanımlayın. Bu derece bozulma yararlı sıralama veri¹¹oluşturmak için büyük olasılıkla olduğundan, bu tür örneklerin işlenmesini önlemek için tavsiye edilir. Bu tür numuneler için yedek ler varsa, kaliteleri ideal olarak yalnızca DV₁₀₀ > %50 olan numuneleri içerecek şekilde kontrol edilmelidir.

2. Kütüphane hazırlama sıralaması

1. Bölüm 1'de değerlendirilen örneklerin kalitesine bağlı olarak, sıralama kitaplıklarını oluşturmak için uygun bir yöntem tanımlayın.
   1. Çok düşük bozulma ve yüksek DV₂₀₀ değerlerine sahip numune kümeleri için mRNA sıralama (örn. poliadenlated transkriptlerin yakalanması), hedeflenen RNA dizilemesi (yani, belirli ilgi genleri için yakalama problarının kullanımı), RNA ekzom sıralama (yani, kodlama transkripsiyonu için zenginleştirmek için yakalama problarının kullanımı) veya toplam RNA sıralaması (örneğin, riboso RMALNA'dan risorpopülasyonunun tümrna örneklerini çıkardıktan sonra transkripsiyon için rasgele astarların kullanılması). Ancak, sabitleme işleminin çıkarılan RNA'da önyargıya yol açabilir. Böylece, yakalama yaklaşımları yüksek DV₂₀₀ değerleri ile bile, her durumda iyi çalışmayabilir.
   2. Örnek set, yüksek bozulmaya sahip numuneler içeriyorsa (DV₂₀₀ < %30), transkriptlerin belirli bölgelerinin yakalanmasına bağlı olmayan toplam Bir RNA kitaplık hazırlama yöntemini kullanın, çünkü bu belirli bölgeler bozulmuş örneklerde eksik olabilir. CDNA üretimi için rasgele astarkullanımı, kullanılabilir RNA'nın son kitaplıkta daha yüksek temsiledilmesine yol açar ve bu nedenle FFPE-RNA örnekleri için daha uygundur.
   3. Yüksek bozulmaya sahip numune kümeleri için ribozomal RNA tükenmesi için RNaseH tabanlı yöntemler kullanın. Bunlar rRNA'ya özgü DNA problarının rRNA'ya bağlandığı, çift iplikli moleküllerin RNaseH tarafından sindirildiği ve kalan probların DNase tarafından temizlendiği yöntemlerdir (örn. NEBNext rRNA tükenme kiti, Malzeme Tablosu). Bu yöntemler, diğer bazı^yöntemler8daha bozulmuş örnekler için daha iyi çalışır.
2. Sıralama kitaplıkları oluşturmak için, daha bozulmuş RNA 'ya (DV₁₀₀ < %60) sahip örnekler için daha yüksek giriş miktarları (mümkünse) kullanın. Oldukça kaliteli RNA örnekleri ise (DV₁₀₀ > %60) daha düşük giriş miktarlarında bile iyi dizi verileri verebilir (FFPE-RNA ile bu protokol için en düşük test ~20 ng idi), daha bozulmuş RNA için (DV₁₀₀ < %60), daha yüksek giriş miktarlarıyla başlamak daha iyidir (örn. >100 ng).
   NOT: Yeterli sayıda (örn. >500 ng) örnek varsa, gerekirse kitaplık hazırlamasını tekrarlamak için numunenin en az yarısını kaydetmenız tavsiye edilir. Düşük giriş örnekleri (örneğin, <100 ng) için, genellikle tüm miktarı kullanmak ve yeterli çeşitlilikbir kütüphane oluşturmak daha iyidir.
3. Yüksek bozulmaya sahip örneklerden toplam RNA seq kitaplıkları oluşturmak için uygun bir kütüphane hazırlama kiti seçtikten sonra (örneğin, Illumina için NEBNext Ultra II RNA Kütüphane Hazırlık Kiti, Bkz. Malzeme Tablosu),kütüphaneleri oluşturmak için üreticinin yönergelerini izleyin.
   NOT: Kitaplık hazırlama sırasında, bozulmuş numuneler için RNA parçalanma adımını atlamak ve ilk iplikçik cDNA sentezi için rasgele astarların kullanılmasını sağlamak önemlidir.
4. Verimliliği ve hızı artırmak için, özellikle düşük girişli numuneler için, boncuk bazlı arınma ve boyut seçimi adımları için güçlü sabit mıknatıslara sahip uygun manyetik raflar kullanın (bkz. Malzeme Tablosu).
5. Adaptör ligatlı DNA PCR zenginleştirme için, kütüphane moleküllerinin gereksiz çoğaltılması kaçınarak maksimum temsil sağlamak için giriş DNA miktarına göre amplifikasyon döngüleri sayısını ayarlayın. Düşük girişli FFPE-RNA örnekleri (<100 ng) için 16-18 amplifikasyon döngüsü önerirken, yüksek giriş örnekleri (1.000 ng) genellikle 12-14 ramplasyon turunda yeterli kitaplık miktarı üretir.
6. PcR amplifikasyon ve üreticinin talimatlarına göre temizleme yi takiben, kütüphane konsantrasyonu ve molekül dağılımını uygun bir platformda analiz ederek kütüphane kalitesini değerlendirin (örneğin, Agilent Bioanalyzer DNA Chip, bkz. Malzeme Tablosu). Astar tepeli (~80 bp) veya adaptör-dimer tepeli (~128 bp) olan numuneler için, bu zirveleri kaldırmak için temizlemeyi tekrarlayın.
7. Her kitaplık için ortalama kitaplık boyutunu hesaplayın (örneğin, Bioanalyzer 2100 Expert yazılımını kullanarak).

3. Sıralama kütüphanesi QC

1. Kütüphanelerin aşırı astar ve adaptör-dimer içermeyen ve sonraki sıralama için yeterli konsantrasyona sahip olduğu tespit edildikten sonra, qPCR ile daha fazla quantitate.
   NOT: Küme oluşturmanın kitaplık konsantrasyonuna karşı hassasiyeti nedeniyle, hatalı sıralamanın düşük performans veya aşırı yüklemeden kaynaklanan hatalı sıralama yı önlemek için doğru niceleme hayati önem taşır. Nicel gerçek zamanlı PCR (qPCR) yöntemleri, aşırı kümeleme ile sonuçlanmadan Illumina platformlarında küme yoğunluğunu artırmak için yararlıdır. QPCR yöntemi, tüm kütüphane moleküllerinin nitel ve/veya nicel analizine dayanan yöntemlerden (örn. Agilent Bioanalyzer) daha hassastır, çünkü akış hücresinde kümeler oluşturacak her iki uçta da bağdaştırıcı dizileri bulunan şablonları ölçer. Ancak, sonuçların standart bir eğriyle karşılaştırılabilmesi için tüm örneklere boyut düzeltmesi uygulandığından kitaplık boyutu önceden bilinmelidir.
   DİkKAT: QPCR yaparken laboratuvar önlükleri ve eldivenler her zaman giyilmelidir ve prosedür üreticinin talimatlarına uygun olarak biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır.
   1. Uygun bir kit (örneğin, Illumina kütüphaneleri için KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix, Library Quantification kitinin bir parçası, Malzeme Tablosu'nabakınız) kullanarak hata önleme için her örnek için üç kopyaiçeren bir 96 kuyu plakası ayarlayın, standartlar, pozitif kontrol (örneğin, PhiX kontrolü, Bkz. Malzeme Tablosu)ve şablon kontrolü (NTC) olmadan. NTC DNA kütüphanesi olmadan qPCR karışımıdır. Pozitif kontrol bilinen konsantrasyon ve parça boyutu ile herhangi bir kütüphane olabilir.
      1. Satıcı protokolünden sonra standartların en az altı seyreltme hazırlayın.
   2. Tüm bileşenleri (yani, qPCR ana karışımı, kütüphaneler, standartlar) ekledikten sonra, sızdırmazlık filmi ile plakayı kaplayın ve filmin plakayla eşit ve güvenli bir şekilde temas etmesini sağlamak için bir squeegee kullanın.
   3. Girdap ve en az 1 dakika için 1.500 rpm plaka aşağı spin. Görsel kuyuların dibinde hava kabarcıkları olduğundan emin olmak için plakayı inceleyin.
   4. Üreticinin önerdiği ayarları kullanarak plakayı termal döngüye (örn. CFX96 Dokunmatik Sistem, bkz. Malzeme Tablosu)ayarlayın.
   5. Çalıştırılan klasörü veri çözümlemesi için erişilebilen bir yere kaydedin.
   6. Veri analizi sırasında eğimin -3,1 ile -3,6 aralığında olup olmadığını, verimliliğin %90'dan %110'a ve R^2'nin (standart eğri için elde edilen korelasyon katsayısı) 0,98'den az olmadığını kontrol edin.
2. Havuzlama: Sıralamaya hazır kütüphanelerin qPCR konsantrasyonu alındıktan sonra, örnek başına gerekli sıralama okuma sayısına ve enstrümanın sıralama çıktısına bağlı olarak, kütüphanelerin her birinin havuz equimolar tutarları.
3. Havuzların QC 'si: 3.1 adımda açıklandığı gibi aynı protokolü takiben qPCR ile kütüphane havuzlarını tekrar quantitate.

4. Sıralama

1. Çalışma parametrelerine bağlı olarak, sıralama reaktif kitlerini çekin ve kullanım kılavuzunu izleyerek eritin. Illumina araçları üzerinde sıralama için tüm kullanım kılavuzlarının en son sürümleri için Illumina web sitesini kontrol edin.
2. Reaktiflerin tamamen çözülmüş olduğundan emin olun ve reaktiftepsisini 4 °C'ye yerleştirin. Reaktifler çözüldükten sonra en geç 2 saat içinde koşmaya başlanmalıdır. Bunu yapmamak çalışma sonuçlarının kalitesini etkileyebilir.
3. Reaktifleri karıştırmak için kartuş5x ters ve yavaşça hava kabarcıkları azaltmak için tezgah dokunun.
4. 30 dakika oda sıcaklığında bir kenara unwrapped akış hücre paketi ayarlayın.
5. Akış hücre paketini aç ve akış hücresinin cam yüzeyini tüy bırakmayan bir alkol mendili ile temizleyin. Bardağı düşük tiftikli laboratuvar dokusuyla kurutun.
6. Illumina "Deney Yöneticisi" uygulamasını açın. "Örnek Sayfa Oluştur" seçeneğini seçin, ardından Sequencer'ı seçin ve "Sonraki" seçeneğini tıklayın.
7. Örnek sayfayı Illumina sequencer ölçütlerine (örneğin, Illumina Deney Yöneticisi, yazılım kılavuzu) temel alınıp yükleyin.
8. İstemlerde, reaktif kiti barkodunda tarar ve çalıştır Kurulum Parametrelerini girin (örn. tek bir indekslenmiş PE 75 döngüsü çalışması için 76-8-76girin).
9. Sıralayıcı kullanım kılavuzu önerisine göre kütüphane havuzunu denatüre ve seyreltin (örneğin, Illumina'dan NextSeq 500 Sistem kılavuzu, bkz. Malzeme Tablosu).
10. PhiX kontrol kitaplığını (Bkz. Malzeme Tablosu)uygun konsantrasyona (örneğin, NextSeq için 1,8 pM) denatüre ve seyreltin.
11. %1 PhiX kontrol hacmi oranı elde etmek için örnek kitaplığı ve PhiX denetimini karıştırın.
12. Denatüre ve seyreltilmiş numuneyi belirlenen rezervuardaki reaktif kartuşu içine yükleyin.
13. Akış hücresini, tampon kartuşu ve reaktif kartuşu'nu yükleyin.
14. Çalışma parametrelerinin sistem kontrolünden geçmesini sağlamak için otomatik bir denetim ve gözden geçirme gerçekleştirin.
15. Otomatik denetim tamamlandığında, sıralama çalışmasına başlamak için Başlat'ı seçin.

5. Veri analizi ve kalite değerlendirmesi

NOT: Tipik bir RNA-seq veri analizi iş akışı(Şekil 1)önişleme ve QC, genom ve post hizalama QC, gen ve transkript nicelleştirme, örnek korelasyon analizi, farklı örnek gruplar arasında diferansiyel analiz, tedavi koşulları ve gen seti zenginleştirme ve yol analizi içerir.

RNA-seq verileri, gen profillemenin doğruluğunu etkileyebilecek ve hatalı sonuçlara yol açabilecek kalite sorunları olabilir. Bu nedenle, kalite, kontaminasyon, kapsama alanı önyargı sıralama ve eserlerin diğer kaynakları için ilk QC kontrolleri çok önemlidir. Burada açıklanan iş akışına benzer bir RNA-Seq QC ardışık hattı uygulamak, yapıları algılamak ve akış aşağı çözümlemeden önce filtreleme veya düzeltme uygulamak için önerilir.

1. Ön
   NOT: Bu demultiplexing içerir, sıralı okuma kalitesinin değerlendirilmesi, GC içeriği, sıralama adaptörleri varlığı, overrepresented k-mers, ve PCR çoğaltılmış okuma. Bu bilgiler sıralama hatalarını, PCR yapılarını veya kontaminasyonu algılamaya yardımcı olur.
   1. Demultiplex Illumina sıralama illumina yazılım aracı bcl2fastq2 örnek levha tanımlanan her örnek için ham FASTQ dosyaları oluşturmak için kullanarak çalıştırın. Barkod çakışması yoksa sıralama hatalarını tolere etmek için örnek dizin barkodlarında bir uyumsuzluk olmasına izin verin.
   2. Sıralama okumalarında herhangi bir kalite veya anormallikleri tespit etmek için ham FASTQ dosyaları üzerinde kalite kontrolü gerçekleştirmek için FASTQC¹⁵ yazılım aracını çalıştırın.
   3. Adaptör ve düşük kaliteli bazlar kırpma için, Cutadapt¹⁶ veya Trimmomatic¹⁷ yazılım araçlarını kullanarak sıralama bağdaştırıcılarını ve düşük kaliteli üsleri kırpın. Kesilmiş okumaları çift uçlu fastq dosyalarına kaydedin.
   4. Kontaminasyon ekranı
      1. Diğer türler ile olası çapraz kontaminasyon tespit etmek için¹⁸ FASTQ_screençalıştırın.
      2. Kirleyen türlerin taksonomlarını belirlemek için Kraken2^19'un miniKraken'ini çalıştırın.
2. Referans genomve post hizalama QC hizalama
   1. Kesilmiş okumalar STAR hizalayıcı²⁰kullanılarak bir referans genom dizisine (GRCh Build hg19 veya hg38) hizalanabilir. Birleştirilmiş transkript hizalama kılavuzu için Gencode ek açıklama GTF dosyasını uygulayın. Yeni splice kavşaklara karşı duyarlılığı artırmak için STAR 2-pass çalıştırılması tavsiye edilir. İkinci geçişte, tüm okumalar açıklamalı gen ve transkriptler ve ilk geçişten yeni kavşaklar kullanılarak yeniden eşlenecektir.
   2. Hizalama sonrası QC gerçekleştirin.
      1. Örneklerdeki benzersiz veya çoğaltılmayan okuma miktarını belirleyerek kitaplık karmaşıklığını değerlendirmek için Picard'ın²¹İşaret kopyalarını çalıştırın.
      2. Kodlama, intronic, intergenik, UTR bölgeleri ve gen gövdesi kapsama alanlarını haritalamak için Picard'ın CollectRnaSeqMetrics programını çalıştırın.
      3. RSeQC^22'yi okuma çiftinin iç mesafesini belirlemek için çalıştırın, CDS eksonları, 5'UTR, 3'UTR, intron, TSS_up_1kb, TSS_up_5kb, TSS_up_10kb, TES_down_1kb, TES_down_5kb, TES_down_10kb, GC içeriğini okuyun, bağlantı doygunluğu ve kitaplık iplikçik bilgileri arasında dağıtımı okuyun.
      4. HTML formatındatoplu bir rapor oluşturmak için çoklu QC²³ çalıştırın.
3. Gen niceleme ve düzeltme analizi
   1. RSEM^24'u, genler ve transkriptler üzerindeki normal okuma sayısının yanı sıra ham sayımı elde etmek için çalıştırın. RPKM (milyon okuma başına ekson modelinin kilobaz başına okuma), FPKM (milyon eşlenen okuma başına ekson modelinin kilobaz başına parçaları) ve TPM (milyonda transkript) gibi okuma sayısı ölçümü en sık bildirilen RNA-seq gen ifade değerleridir. Gürültülü bir eşiğin altında ifade edilen genler (TPM < 1 veya ham sayım <5 gibi) filtrelenebilir.
   2. HTSeq-count veya featureCounts gibi programları kullanarak her transkript dizilerine eşlenen okumaların ham sayısını toplamak için transkript niceliği gerçekleştirin.
   3. Toplu iş efektlerini belirlemek ve verilen veri kümesi^25'inkalite haritasını değerlendirmek için Bir R komut dosyası kullanarak Temel Bileşenler Analizini (PCA) çalıştırın. Farklı ölçümler arasındaki Pearson korelasyon kullanılarak örnek korelasyon analizi yapılabilir.
4. Diferansiyel gen ekspresyonu analizi
   1. Program edgeR^26,,27 ve/veya limma-Voom^28'i kullanarak örnek koşullar arasında gen diferansiyel analizi ni yapın ve TPM, TMM, DESeqveya UpperQuartilegibi normalleştirme yöntemlerini kullanın. TMM
   2. Karşılaştırma için iki deglistesi kümesi ni çağırmak ve algılama hassasiyetini ve doğruluğunu artırmak için son DEG'leri almak için en az iki diferansiyel analiz yazılımı aracı çalıştırması önerilir.
5. Gen seti zenginleştirme ve yol analizi
   1. DeGs'lerin biyolojik koşullar arasında istatistiksel olarak anlamlı, uyumlu farklılıklar gösterip gösteremesini belirlemek için farklı ifade edilmiş genlerin (DEGs) listesinin ölçümüne göre transkriptlerin sıralamasına göre 29 , 30 gen seti zenginleştirme analizi (GSEA)^29,30 gerçekleştirin.
   2. Gene Ontology³¹, DAVID32^,33, veya diğer kullanılabilir yazılım araçları gibi kaynakları kullanarak işlev analizi gerçekleştirin.³³

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan metodoloji, 7-32 yıl boyunca çeşitli koşullarda saklanan 67 FFPE numunesine uygulanmıştır (ortanca numune depolama süresi 17,5 yıl idi). Burada sunulan veri seti ve analiz sonuçları daha önce tanımlanmış ve Zhao ve ark.^11'deyayınlanmıştır. Daha önce açıklandığı gibi örnek kalitesinin kontrol edilmesinde (örneğin, Şekil 2'dekiörnek izler), DV 100'ün DV_200'den daha kullanışlı olduğu bulunmuştur, çünk...

Tartışmalar

Burada açıklanan yöntem FFPE-RNA örneklerinden iyi sıralı veri elde etmek için gereken ana adımları özetlemektedir. Bu yöntemle göz önünde bulundurulması gereken başlıca noktalar şunlardır: (1) Numune işleme ve donma ve çözülme döngüleri en aza indirilerek ekstraksiyondan sonra RNA'nın mümkün olduğunca iyi korunduğundan emin olun. Ayrı QC aliquots çok yararlıdır. (2) Verilen örnek kümesi için en iyi olan QC metrik kullanın. RIN değerleri ve DV₂₀₀ genellikle bozulmuş numu...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939BA
Agilent DNA 7500 Kit	Agilent	5067-1506
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent	5067-4626
Agilent RNA 6000 Nano Kit	Agilent	5067-1511
AllPrep DNA/RNA FFPE Kit	Qiagen	80234
CFX96 Touch System	Bio-Rad	1855195
Library Quantification kit v2-Illumina	KapaBiosystems	KK4824
NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina	New England Biolabs	E7765S	https://www.neb.com/protocols/2017/02/07/protocol-for-use-with-ffpe-rna-nebnext-rrna-depletion-kit
NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat)	New England Biolabs	E6310L
NextSeq 500 Sequencing System	Illumina	SY-415-1001	NextSeq 500 System guide: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/nextseq/nextseq-500-system-guide-15046563-06.pdf
NextSeq PhiX Control Kit	Illumina	FC-110-3002
NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (150 CYS)	Illumina	20024907
10X Genomics Magnetic Separator	10X Genomics	120250
Rotator Multimixer	VWR	13916-822
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad	1851197
Sequencing reagent kit	Illumina	20024907
Flow cell package	Illumina	20024907
Buffer cartridge and the reagent cartridge	Illumina	20024907
Sodium hydroxide solution (0.2N)	Millipore Sigma	SX0607D-6
TRIS-HCL Buffer 1.0M, pH 7.0	Fisher Scientific	50-151-871