P. aeruginosa Anti-Enfektiflerin Klinik Öncesi Değerlendirilmesi Için Hava-Sıvı Arabiriminde Bronşiyal Epitel Hücrelerin in enfekte 3D Eş Kültür

Özet

Biz cfbe41o kullanarak enfekte hava yollarının üç boyutlu ortak kültür modeli için bir protokol tarif^- hücreler, THP-1 makrofajlar, ve Pseudomonas aeruginosa, hava-sıvı arayüzü nde kurulan. Bu model aynı anda antibiyotik etkinliğini test etmek için yeni bir platform sağlar, epitel bariyer fonksiyonu, ve inflamatuar belirteçleri.

Özet

akciğer enfeksiyonlarının tedavisi için fDrug araştırma yüksek karmaşıklık tahmine dayalı in vitro modellerdoğru ilerliyor. Akciğer modellerinde bakterilerin çok yönlü varlığı epitel dizilişi yeniden adapte edebilir, bağışıklık hücreleri mikroortamda bakterilere karşı inflamatuar bir yanıt koordine ederken. In vivo modelleri kistik fibrozis bağlamında yeni anti-enfektifleri test etmek için tercih olsa da, hala doğru insanlarda bu tür hastalıkların in vivo koşulları ve tedavi sonuçları taklit etmez. İnsan hücrelerine (bronşiyal epitel ve makrofajlar) ve ilgili patojenlere dayalı enfekte hava yollarının kompleks in vitro modelleri bu boşluğu kapatabilir ve yeni anti-enfektiflerin kliniğe çevrilmesini kolaylaştırabilir. Bu amaçla, insan kistik fibrozis bronkil epitel hücre hattı CFBE41o bir co-kültür modeli^- ve THP-1 monosit kaynaklı makrofajlar, hava-sıvı arayüzü (ALI) koşullarda P. aeruginosa tarafından insan bronşiyal mukoza bir enfeksiyon taklit kurulmuştur. Bu model yedi gün içinde ayarlanır ve aşağıdaki parametreler aynı anda değerlendirilir: epitel bariyer bütünlüğü, makrofaj transmigration, bakteriyel sağkalım, ve inflamasyon. Bu protokol, yeni anti-enfektifleri keşfetmek ve akciğerlere aerosol dağıtımını optimize etmek için uygun olabilecek ilaç etkinliğini ve konak yanıtlarını değerlendirmek için sağlam ve tekrarlanabilir bir sistemi tanımlar.

Giriş

Pseudomonas aeruginosa kistik fibrozis ilgili bir patojen (CF) akciğer dokusu^bozukluğukatkıda 1. Aljinat ve diğer mukoid eksopolisakkaritler gibi polisakkaritlerin üretimi, inatçı bakteriyel yapışmayol açar hastalığın ilerlemesini koordine eder, bakterilere antibiyotik teslim sınırlar ve konak bağışıklık sistemine karşı bakterileri korur². P. aeruginosa'nın planktonik evreden biyofilm oluşumuna geçişi bu bağlamda kritik bir konudur ve antibiyotik toleransının oluşmasını da kolaylaştırmaktadır.

CF bağlamında, fare öncelikle bir model olarak kullanılmıştır. Ancak fareler CF mutasyonları^3'ündevreye girmesiyle bu hastalığa kendiliğinden yakalanmazlar. Bakteriyel biyofilm gelişimi ve ilaç duyarlılık çalışmalarının çoğu Petri kapları gibi abiyotik yüzeylerde yapılmıştır. Ancak, bu yaklaşım in vivo karmaşıklığı temsil etmez. Örneğin, önemli biyolojik engeller, bağışıklık hücreleri yanı sıra mukozal epitel de dahil olmak üzere yoktur. P. aeruginosa epitel hücreleri için oldukça toksik olmasına rağmen, bazı gruplar insan bronşiyal hücreleri ile daha önceki bir P. aeruginosa biyofilm yetiştirmek başardık. Bu hücreler CFTR mutasyonu olan kistik fibrozis hastalarından (CFBE41o^- cells)⁴ kökenli ve antibiyotik etkinliğini değerlendirmek için izin⁵ veya enfeksiyon sırasında CFTR protein düzeltme değerlendirmek için izin⁶. Böyle bir model uyuşturucu etkinliğinin öngörülebilirliğini artırmak için gösterilmiştir, ilaç geliştirme sonraki aşamalarında başarısız ilaçlar ile sorunların karakterizasyonu sağlayan ek olarak⁷.

Ancak, akciğerde, mukozal epitel havaya maruz kalır. Ayrıca, doku makrofajları gibi solunum yollarında bulunan bağışıklık hücreleri, solunan patojenler veya parçacıklara karşı önemli bir rol oynamaktadır⁸. Makrofajlar bronşiyal lümen ulaşmak ve enfeksiyon mücadele için farklı hücre katmanları üzerinden göç. Ayrıca, inhale ilaçlar da pulmoner hava-kan bariyeri ek bir hücresel olmayan unsur olarak mukus varlığı ile başa çıkmak zorunda⁹. Nitekim, birkaç karmaşık üç boyutlu (3D) in vitro modeller geliştirilmiştir, in vivo alaka artırmak amacıyla. Ortak kültür sistemleri sadece ilaç keşfi için in vitro sistemlerin karmaşıklığını artırmakla kalmıyor, aynı zamanda hücre-hücre etkileşimlerini de incelemeyi mümkün kılmasını sağlıyor. Bu tür karmaşıklık makrofaj göçü ile ilgili çalışmalarda ele alınmıştır¹⁰, nötrofiller tarafından antimikrobiyal peptidlerin serbest bırakılması¹¹, enfeksiyonda mukus rolü⁹, ve aşırı hasara epitel hücre reaksiyonu¹². Ancak, cf genetik mutasyon özellikleri güvenilir bir CF enfekte in vitro modeli, havaya maruz kalan (artan fizyolojik durum), ve bağışıklık hücreleri entegre hala eksik.

Bu boşluğu kapatmak için, enfekte hava yollarının istikrarlı insan 3D eş kültürü için bir protokol uyguluyoruz. Model insan CF bronşiyal epitel hücreleri ve makrofajlar oluşur, P. aeruginosa ile enfekte ve hem difüzyonel hem de immünolojik bariyer temsil yeteneğine sahip. Anti-enfektifleri makul derecede yüksek iş kaynağında test etmek amacıyla, bu ortak kültür iyi plaka kesici uçların geçirilebilir filtre zarı üzerinde iki insan hücresi hattı kullanılarak kurulmuştur: CFBE41o^- ve THP-1 monosit türevi makrofajlar. Ayrıca, sonunda aerosolize anti-enfektifler birikimi çalışma^{için 13}, model hava-sıvı arayüzü (ALI) yerine sıvı kaplı koşullar (LCC) kurulmuştur.

Burada rapor olarak, Bu model sadece bir antibiyotik tedavisi üzerine bakteriyel sağkalım değil, aynı zamanda hücre sitotoksisitesi, epitel bariyer bütünlüğü, makrofaj transmigration ve inflamatuar yanıtları, ilaç gelişimi için gerekli parametreler olan değerlendirme sağlar.

Bu protokol pulmoner hava yollarının inhalasyon tedavisi için iki ilgili hücre tipini biraraya getirir: makrofajlar ve CF bronşiyal epitel. Bu hücreler geçirilme destek uçlarının zıt taraflarında tohumlanır ve hücrenin havaya maruz kalmasına izin verir (hava-sıvı arabirimi (ALI) koşulları olarak adlandırılır. Konak hücrelerin bu co-kültür daha sonra P. aeruginosaile enfekte . Her iki konak hücre hatları insan kökenlidir: epitel hücreleri kistik fibrozis bronşiyal epitel temsil, CF kanalında bir mutasyon ile (CFBE41o^-), ve THP-1¹⁴ hücreleri iyi karakterize makrofaj benzeri hücre hattı vardır. Makrofaj benzeri hücreler karşı bölmeye eklenmeden önce kuyu plaka uçlarının üst tarafında bir konfluent epitel tabakasının oluşmasına izin verilir. ALI'de ortak kültür kurulduktan sonra sistem apikal tarafta P. aeruginosa ile aşılanır. Bu enfekte co-kültür sistemi daha sonra bir antibiyotik etkinliğini değerlendirmek için kullanılır, örneğin tobramisin. Aşağıdaki son noktalar analiz edilir: transepitelyal elektrikdirenci (TEER), hücre-hücre ve hücre-bakteri etkileşimlerinin konfokal lazer tarama mikroskopisi (CLSM) ile görselleştirilmesi, koloni oluşturan birimlerin (CFU) sayılarak bakterisel sağkalım, konak hücre sağkalım (sitotoksisite) ve sitokin salınımı açısından epitel bariyer bütünlüğü.

Protokol

1. Geçirimli destek uçlarında hücrelerin büyümesi ve farklılaşması

1. CFBE41o yetiştirmek^- % 10 fetal buzağı serumu (FCS), %1 esansiyel olmayan amino asitler ve %5 CO₂ atmosferi ile 37 °C'de 600 mg/L glikoz içeren 13 mL minimum esansiyel ortama (MEM) sahip bir T75 şişesinde. Hücrelere her 2-3 günde bir taze ortam ekleyin.
   1. 3 mL tripsin- Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile şişede %70 birleştiğinde hücreleri 37°C'de 15 dakika ayırın. 7 mL taze MEM ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında 4 dk (RT) için 300 x g'de santrifüj edin. Supernatant atın ve yavaşça yukarı ve aşağı borulama tarafından kümeleri bozarak mem yeni 10 mL ekleyin.
   2. Hücreleri otomatik hücre sayacı veya hemositometre odasıyla sayın. Geçirgen destekli 12 kuyulu plakalarda 2 x 10⁵ hücre/kuyu yoğunluğuna sahip tohum hücreleri (gözenek boyutu 3 μm, bkz. Malzemeler Tablosu).
      NOT: Otomatik hücre sayacı hücre numarasını, boyut dağılımını ve hücrelerin canlılığını belirler (bkz. Malzemeler Tablosu). Gözenek boyutu 0.4 m olan geçirimli destekler burada kullanılabilir; ancak, makrofajlar, bu durumda, doğrudan apikal tarafa eklenmelidir ve bunların hücre içi göçü bu durumda değerlendirilmeyecektir.
   3. Geçirgen desteğin apikal tarafına hücre süspansiyonunun 500 μL'si ve bazolateral tarafta 1,5 mL taze ortam ekleyerek sıvı-sıvı durumundaki (LLC) tohum hücreleri. Daha sonra hücreleri 37°C'de %5 CO_2'ninaltında 72 saat kuluçkaya yatırın.
   4. Hava-sıvı arabirimi (ALI) kültürüne geçiş yapmak için, tohumlamadan sonraki üçüncü gün, ortamı önce bazolateral taraftan, sonra apikal taraftan çıkarın. Bazolateral tarafa 500 μL taze MEM ekleyin ve hücreler bir eşzamanlı monolayer oluşturana kadar her iki günde bir orta yı değiştirin.
      NOT: Bu protokolde kullanılan koşullar için, CFBE41o^- hücreler genellikle kültür 3-7 gün sonra confluent vardır.
   5. CFBE41o kuluçka tarafından gün 7 epitel bariyer özelliklerini değerlendirmek^- apikal tarafında 500 μL hücreli orta ve 1.5 mL bazolateral tarafında 1 h, 37 ° C altında% 5 CO₂.
   6. StX2 çubuk elektrot ve epitel volt-ohmmetre ile transepitel elektrikdirenci (TEER) ile bariyer özelliklerini ölçün; 7 gün sonra bu 300 Ω×cm²'den yüksektir.
      NOT: Sonunda, bazı membran uçlarında hücrelerde düşük TEER bulunur. Bu nedenle TEER < 300 Ω×cm²'li geçirimli kesici uçlar kullanılmaz.
2. THP-1 hücreleri yetiştirmek için, Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 orta% 10 FCS ile takviye 13 mL kullanarak bir T75 şişesinde büyümek ve% 5 CO₂altında 37 ° C inkübat . Yeni bir T75 şişesinde 2 x 10⁶ hücre/mL hücre tohumlayarak hücreleri her iki günde bir bölün.
   NOT: Diferansiye olmayan THP-1 hücreleri süspansiyonda monosit olarak yetiştirilir.
   1. THP-1 hücrelerini aşağıdaki gibi ayırt edin. 4 dk için 300 x g bir T75 santrifüj içeriği. Supernatant atın, taze ortamda pelet resuspend ve yeni bir T75 koymak. 10 ng/mL Phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) ekle RPMI'deki hücreleri 37 °C'de 48 saat ve %5 CO₂ atmosfer^15'einküttür.
      NOT: PMA ile farklılaşmadan sonra hücreler artık çoğalmaz ve şişeye bağlanır.
   2. THP-1 makrofaj benzeri hücreleri ayırmak için, 37 °C'de fosfat tamponlu salin (PBS) ile bir kez yıkayın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 0,5 mM EDTA içeren 3 mL hücre dekolmanı çözeltisi (örn. accutase) ile inkümide.
   3. Hücre kopmasını aramak için ters bir mikroskop altındaki hücreleri inceleyin. RT'de 4 dk için 300 x g'de 7 mL taze orta ve santrifüj ekleyin.
      NOT: Makrofajlar da tripsin-EDTA, 37 °C 20 dk ile ayrılabilir. Ancak, tripsin makrofajlara seçilen hücre ayırma çözeltisinden daha serttir (bkz. Malzemeler Tablosu).
   4. Süpernatant çıkardıktan sonra, THP-1 ortamının 3 mL'lik makrofaj hücrelerini 15 mL konik tüpe yeniden askıya alın, 1.1.2'de açıklandığı gibi hücreleri sayın. ve ortak kültürü kurmadan önce 37 °C'de %5 CO_2'nin altında maksimum 1 saat kuluçkaya yatırın.
      NOT: Süspansiyondaki THP-1 hücreleri, ortak kültürü daha fazla görüntülemek için canlılık boyalarıyla boyanabilir. Bu adımda, aşağıdaki yordamı kullanın (adım 1.2.5).
   5. Hücre canlılığının 10 μM'lik tablosu (hücre içi esterazlar tarafından asetat moieties'in dönüştürülmesine göre, hücre süspansiyonuna 3 μL'lik hücre canlılık boyasının uygulandığı Malzeme Tablosu'nabakın). 37 °C'de 20 dk, %5 CO_2'deinküler, boyayı çıkarmak için PBS 37°C ile 1x yıkayın.
      NOT: Oda sıcaklığında (RT) 4 dk için 300 x g boya kaldırmak için hücreleri santrifüj.

2. Geçirimli desteklerde epitel-makrofaj eş kültürünün oluşturulması

1. CFBE41o kullanın^- ALI'de TEER ≥ 300 Ω×cm² ile monolayers (adım 1.1.6.). Orta yı alt odadan çıkarın, steril cam Petri kabının (50 mm x 200 mm) içindeki desteği dikkatlice ters çevirin ve bir hücre kazıyıcı kullanarak membranın alt tarafındaki membran gözenekleri aracılığıyla büyümüş hücreleri çıkarın.
   NOT: 3 μm gözenek boyutu nedeniyle, epitel hücreleri basolateral yan doğru gözenekleri ile büyümeye eğilimindedir. Bu nedenle, bir bu tarafta makrofajlar eklemeden önce bunları kaldırmak gerekir. CFBE41o^- akciğer epitel hücreleri bu adımda lekeli olabilir. Adım 1.2.5'teki yordam kullanılabilir; ancak, hücre süspansiyonu yerine MEM'deki boya çözeltisi geçirgen destek üzerine yapışan hücrelere (sadece 500°L apikal taraf) uygulanır.
2. PMA-diferansiye edilmiş THP-1 makrofajlarının hücre süspansiyonundan 2 x 10⁵ hücre/kuyu (200 μL RPMI) kullanın ve hücreleri ters eklerin bazolateral tarafına yerleştirin.
3. Petri yemeklerini dikkatlice kapatın ve %5 CO_2'ninaltında 37 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın.
4. Uçları 12 kuyulu mikroplakalara geri yerleştirin ve ALI koşullarını korumak için geçirgen kesici ucun basolateral tarafına 500 μL MEM ortamı ekleyin. Hücreler enfeksiyona hazır.

3. Enfeksiyon P. aeruginosa tarafından

NOT: Aşağıdaki tüm adımlar biyogüvenlik seviyesi 2 (BSL2) laboratuvarında yapılmalıdır.

1. 15 mL likolin likit suyu (LB) bir Erlenmeyer şişesinde (50 mL) p. aeruginosa PAO1-GFP kolonisi ile 300 μg/mL ampisilin ile desteklenir.
   NOT: P. aeruginosa diğer suşları da burada kullanılabilir, örneğin, PAO1 yabani tip, PA14, veya klinik suşları, kendi yetiştirme protokolleri aşağıdaki.
2. Bakterileri 37°C'de 18 saat kuluçkaya yatırın, 180 rpm'de sallayarak.
3. İçeriği 18 saat sonra 50 mL konik tüpe ve santrifüje 3850 x g'de 5 dk aktarın. Supernatant atın ve 37 ° C steril PBS 10 mL ekleyin.
4. Dalga boyu 600 nm'deki bir spektrofotometredeki optik yoğunluğu ölçün ve hücre kültürü ortamını kullanarak bakterilerin konsantrasyonunu 2 x 10⁵ CFU/mL'lik son konsantrasyona ayarlayın. Bu, epitel hücre başına bir bakterinin çokluğuna (MOI) karşılık gelir.
5. Geçirgen desteğin apikal tarafına 100 μL bakteriyel süspansiyon ekleyin (adım 2.4.) ve bakterilerin hücrelere bağlanmasını sağlamak için 37 °C'de %5 CO_2'nin altında kuluçkaya yatırın. Daha sonra, ALI koşullarını geri yüklemek için bir pipet ile dikkatle apikal sıvı çıkarın. Bazı örnekleri kontrol olarak enfekte edilmemiş tutun.
   NOT: Bu aşamada, bağlı bakteriler LB agar (bkz. adım 5.4/5.5) ilk bakteri inoculum belirlemek için kaplama olmalıdır.
6. Hücrelerde bakteriyel yapışma sonra ilgi ilaç kuluçka. Tedavi deneyleri için, hücre ortasında seyreltilmiş bir ilaç çözeltisinin 500 μL'sini ekleyin (bu protokolde tobramisin 6 μg/mL kullanıldı) apikal tarafa. Bazolateral tarafta ilaç olmadan hücre orta 1.500 μL ekleyin.
   NOT: İlaçları çözüm olarak aşılamak yerine, model aerosol birikimine de adapte edilebilir. Bu amaçla, ALI'deki hücreler bazolateral taraftan 500 μL hücre ortası ile beslenirler. İlaç daha sonra ilk nebulized ve uygun bir cihaz (burada açıklanmaz) tarafından apikal bölmede mevduat izin verilir. Enfekte ve tedavi edilen örnek, 4-7. Bu adımdan itibaren, geçirgen destekler ya görüntüleri oluşturmak için kullanılabilir (bölüm 4) ya da bakteri büyüme ve memeli hücre canlılığı sonuçları almak için, diğerleri arasında (bölüm 5-7).

4. Konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) için numune hazırlama

1. Ortak kültür, enfeksiyon ve ilaç tedavisinin kurulmasından sonra, apikal ve bazolateral taraftan tüm ortamı çıkarın. 37°C'de PBS ile 1 x yıkayın ve hücreleri %3 paraformaldehit (PFA) ile 1 saat boyunca RT'de (bazik/600°L'de 300 μL) düzeltin. Hücre çekirdekleri oda sıcaklığında 30 dk için 5 μg/mL DAPI-PBS ile boyanır.
   DİkKAT: PFA tehlikelidir.
2. Membranları neşter kullanarak kesin ve montaj ortamı kullanarak iki adet 12 mm'lik mikroskopi kapağı kaydırağı arasına yerleştirin (bkz. 4 °C'de saklanmadan önce 30 dk akış tezgahı içinde kurumasını bekleyin. Konfokal tarama mikroskopisi ile görselleştirin.
   NOT: Ortak kültürden sonra ve montajdan önce sıkı kavşaklar immünboyama yapılabilir. Bunun için hücreler 30 dakika boyunca paraformaldehit %3 ile sabitlenir, PBS ile tekrar yıkanır ve PBS'de saponin %0.05/BSA %1 ile permeabilize edilir. Bu protokolde zonula oklüden proteini (ZO-1) fare anti-insan ZO-1 antikor (1:400, inkübasyon 4 °C gecede) ile tespit edilmiştir. Örnekler daha sonra keçi anti-fare IgG antikor Alexa Fluor 633 (1:2000 kırmızı) ile RT 2 saat için kuluçka yada dı. Çekirdekler DAPI (1 μg/mL) ile boyanmış ve kapaklara montaj ortamı ile monte edilmiştir.
3. Depolanan membranları görüntülemek için konfokal mikroskop kullanın. Algılama için 405, 488, 505 veya 633 nm'de 25x veya 63x su daldırma hedefleri ve lazerler seçin. Görüntülerde 1024 x 1024 piksel çözünürlüğe sahip olmalıdır.
   NOT: Lazerler kullanılan lekeye göre seçilir.
4. Apikal ve kesit görünümleri edinin ve görüntüleme yazılımı kullanarak üç boyutlu bir modelin yapımı için zeta-stack modunu (10-15 yığınlar) kullanın.

5. Koloni oluşturan birimler (CFU) ile bakteri çoğalmasının ölçülmesi

1. Bağlı olmayan bakterilerin CFU değerlendirmek için apikal ve bazolateral orta (bakteri içeren) toplamak. Apikal ve bazolateral kenarlardan 500 μL toplayın ve havuzlayın.
   NOT: Bu süspansiyonu doğrudan bakterileri (adım 5.4) veya santrifüjü 10 dk için 21.250 x g'de saymak için kullanın ve ekstrasellüler bakterileri saymak için PBS'deki laktat dehidrogenazını (LDH) ve/veya PBS'de yeniden askıya alınmasını değerlendirin (adım 5.4).
2. Geçirgen desteğin her bölmesine 500 μL steril deiyonize soğuk su ekleyerek hücrelere bağlı ve/veya içselleştirilmiş bakterilerin hayatta kalmasını değerlendirin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübasyon hücreleri.
   NOT: Numuneler lb agar (bkz. adım 5.4) veya daha sonra kaplama için -20 °C'de dondurulmuş (tüm kesici plaka olarak) üzerine kaplanabilir.
3. Yapışık/içselleştirilmiş bakterilerin CFU'yu değerlendirmek için, 37°C'de 10 dakika (dondurulmuşsa) erime numuneleri. Her kuyu için pipet uçlarını kullanarak, bağlı tüm içeriği çıkarmak için membran yüzeyini ve pipetleri yukarı ve aşağı kazıyın.
   NOT: Bu adımda tüm epitel hücreleri lysed ve yapışık / internalize bakteriler kaplamalı bir süspansiyon olarak kullanılabilir.
4. Her iki fraksiyonları bakteriyel süspansiyon ile, PBS Tween-80 0.05% kullanarak 1/10 seri seyreltme gerçekleştirmek ve LB agar plakaları üzerinde bakteri plaka.
   NOT: 1 ile 10 arasında seyreltme önerilir. Bakteriler, tek kolonilerin ilk olarak tanımlandığı en yüksek seyreltmede sayılmalıdır.
5. 30°C'de 16-72 h'de kolonilere inkübedin ve CFU'yu buna göre hesaplayın.
   NOT: Plaka kuluçka sırasında 30°C sıcaklık tedavi-numuneler ve kolonilerin gecikmeli büyümesini gözlemlemek için gereklidir.

6. Laktat dehidrogenaz talimi ile hücre sitotoksisitesinin değerlendirilmesi

1. LDH tsay¹⁶için hücre canlılığı değerlendirmesi için bakteri içeren enfekte hücrelerin supernatant kullanın (adım 5.1). 10 dk için 21.250 x g de supernatant santrifüj bakteri pelet ve sonunda hücrelerin geri kalanı. LDH salınımını ölçmek için bakteriiçermeyen süpernatant'ı kullanın.
   NOT: Supernatant bu teşbit ile LDH ölçmeden önce dondurulmuş olmamalıdır.
2. Supernatant'ın 100 μL'sini 96 kuyulu bir plakaya aktarın ve LDH tsay çözeltisinin 100 μL'sini ekleyin (Malzeme Tablosu'nabakın). Karanlıkta 5 dakika oda sıcaklığında kuluçka, sonra 492 nm emici okuyun.

7. İnsan sitokinlerinin salınımını değerlendirmek

1. Sitokin nicelemi için ELISA veya sitometrik boncuk dizisi immunoassay¹⁷kullanın (Bkz. Malzemeler Tablosu). Bunun için, 10 dk için 21.250 x g'de adım 5.1'den itibaren santrifüj süpernatant ve analize kadar 15 gün boyunca -80 °C'yi hemen veya saklayın.
2. Supernatants'ı ticari olarak kullanılabilen bir ELISA kiti yle değerlendirin.
   NOT: Prosedür, plakaların yakalama antikorile kaplanması, numunelerin (100 μL) ve sitokin standartlarının eklenmesi, inkübasyon, yıkama ve sitokin varlığının kolorimetrik ölçümünü sağlamak için algılama antikorilatını içeren üretim talimatlarını izler. Alternatif olarak, akış sitometrisi ticari olarak mevcut kitleri aracılığıyla sitokinleri ölçmek için kullanılabilir (bkz. Malzeme Tablosu).

Sonuçlar

Şekil 1A, permeable desteklerin apikal ve bazolateral tarafında 24 saat büyüdükten sonra insan bronşiyal epitel hücrelerinin ve makrofajların ortaya çıkan eş kültürünün morfolojisini göstermektedir. Epitel bariyer bütünlüğü daha yüksek TEER (834 Ω×cm²) ve CLSM ile sıkı kavşak proteini ZO-1(Şekil 1B)için immünboyama ile gösterilir. Enfekte olmayan CFBE41o bariyer bütünlüğü açısından gözlenen aynı sonuçlar^-...

Tartışmalar

Bu yazıda enfekte hava yollarının 3Boyutlu ortak kültür için bir protokol açıklar, insan kistik fibrozis bronşiyal epitel hücre hattı CFBE41o tarafından oluşturulan- ve insan monosit kaynaklı makrofaj hücre hattı THP-1. Protokol, aynı anda ilaç etkinliği ve konak yanıtları test ederken önemli parametreler olan epitel bariyer bütünlüğü, makrofaj transmigration, bakteri sağkalım ve inflamasyon, değerlendirilmesi sağlar. Modeldeki yenilik, akut bakteriyel enfeksiyon (yani P. aeruginosa)

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	Accutase	AT104
Ampicillin	Carl Roth, Germany	HP62.1
CASY TT Cell Counter and Analyzer	OLS Omni Life Sciences	-
CellTrace Far Red	Thermo Fischer	C34564
Centrifuge Universal 320R	Hettich, Germany	1406
CFBE41o- cells	1. Gruenert Cell Line Distribution Program 2. Sigma-Aldrich	1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 2. SCC151
Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm	World Precision Instruments, Sarasota, USA	STX2
Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM	Leica, Mannheim, Germany	TCS SP 8
Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits	Affymetrix eBioscience, USA	15541037
Cytokines Panel I and II	LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA).	740102
Cytotoxicity Detection Kit (LDH)	Roche	11644793001
D-(+) Glucose	Merck	47829
Dako Fluorescence Mounting Medium	DAKO	S3023
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)	Thermo Fischer	D1306
Epithelial voltohmmeter	World Precision Instruments, Sarasota, USA	EVOM2
Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile	Corning, Amsterdam, Netherlands	353181
Fetal calf serum	Lonza, Basel, Switzerland	DE14-801F
Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633	Invitrogen	A-21050
L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle	Roche, Mannheim, Germany	10127230001
LB broth	Sigma-Aldrich, Germany	L2897-1KG
MEM (Minimum Essential Medium)	Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.	11095072
Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.	11140050
P. aeruginosa strain PAO1	American Type Culture Collection	47085
P. aeruginosa strain PAO1-GFP	American Type Culture Collection	10145GFP
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16%	EMS DIASUM	15710-S
Phosphate buffer solution buffer	Thermo Fischer	10010023
Petri dishes	Greiner	664102
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, Germany	P8139-1MG
Precision Cover Glasses	ThorLabs	CG15KH
Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody	BD Transduction Laboratories	610966
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK	11875093
Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter)	Normax, Portugal	5058561
Saponin	Sigma-Aldrich, Germany	S4521
T75 culture flasks	Thermo Fischer	156499
THP-1 cells	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany)	No. ACC-16
Tobramycin sulfate salt	Sigma	T1783-500MG
Trypsin-EDTA 0.05%	Thermo Fischer	25300054
Tween80	Sigma-Aldrich, Germany	P1754