JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

İnsan femorasının ön yönünden SRμCT deneyleri için tek tip boyutta kortikal kemik örnekleri temin etmek için jeolojik (koring) örnekleme protokolü yaptık. Bu yöntem minimal yıkıcı, verimlidir, düzensiz örnek şekillerinden görüntüleme yapıtlarını en aza indiren ve mikroarşitektif görselleştirme ve analizi geliştiren silindirik örneklerle sonuçlanır.

Özet

Kemik, insan ömrü boyunca yapısı değişen dinamik ve mekanik olarak aktif bir dokudur. Kemik remodeling işleminin ürünleri geleneksel iki boyutlu teknikler kullanılarak önemli ölçüde incelenmiştir. Masaüstü mikro bilgisayarlı tomografi (μCT) ve senkrotron radyasyon mikro bilgisayarlı tomografi (SRμCT) aracılığıyla X-ışını görüntüleme teknolojisindeki son gelişmeler, insan kortikal kemiği içindeki mikroskobik yapıların daha eksiksiz bir resmini sağlayan diğer 3D görüntüleme tekniklerine (örneğin, SEM) göre daha geniş bir görüş alanının (FOV) yüksek çözünürlüklü üç boyutlu (3D) taramalarının elde edilmesine izin verdi. Bununla birlikte, örnek, veri analizini etkilediği bilinen çizgi yapıtlarının görünümünü sınırlamak için FOV içinde doğru bir şekilde ortalanmalıdır. Önceki çalışmalar, düzensiz şekilli rektilineer kemik bloklarının tedarikinin, düzensiz kenarlar veya görüntü kesilmesi nedeniyle görüntüleme yapıtlarıyla sonuç olduğunu bildirmiştir. SRμCT deneyleri için insan femorasının ön yönünden sürekli boyutlu kortikal kemik çekirdeği örnekleri temin etmek için jeolojik örnekleme protokolü (koring) uyguladık. Bu koring yöntemi verimli ve doku için minimal yıkıcıdır. Dönme sırasında izometrik olması ve tarama boyunca X-ışını ışınları için düzgün bir yol uzunluğu sağlaması nedeniyle görüntüleme yapıtlarını azaltan tekdüze silindirik örnekler oluşturur. Özlü ve düzensiz şekilli örneklerin X-ışını tomografik verilerinin görüntü işlemesi, kortikal kemik mikro mimarisinin görselleştirilmesini ve analizini iyileştirme tekniğinin potansiyelini doğrulamamaktadır. Bu protokolün bir amacı, çeşitli yüksek çözünürlüklü kemik görüntüleme deneyleri için uyarlanabilen kortikal kemik çekirdeklerinin çıkarılması için güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem sunmaktır. Çalışmanın kapsamlı bir amacı, SRμCT için uygun fiyatlı, tutarlı ve basit standartlaştırılmış bir kortikal kemik tedariki oluşturmaktır. Bu prosedür, biyolojik antropoloji, yerbilimleri veya malzeme bilimleri gibi sert kompozit malzemeleri yaygın olarak değerlendiren ilgili alanlardaki araştırmacılar tarafından daha da uyarlanabilir.

Giriş

Görüntüleme teknolojisindeki son gelişmelerle birlikte, X-ışını görüntüleme verilerini çok yüksek çözünürlükte elde etmek artık mümkün. Masaüstü mikro-CT (μCT) sistemleri, tahribatsız doğası nedeniyle iptal edilen kemiği görüntüleme için geçerli standarttır1. Bununla birlikte, kortikal kemiğin mikroyapısal özelliklerinin görüntülenmesi sırasında, μCT kullanımı daha sınırlı olmuştur. Çözünürlük kısıtlamaları nedeniyle, masaüstü sistemleri osteosit lacunae gibi kortikal gözeneklerden daha küçük mikroyapısal özellikleri görüntülemek için gereken çözünürlüğe sahip olamaz. Bu uygulama için, SRμCT bu sistemlerin daha fazla çözünürlüğü nedeniyle idealdir1. Örneğin, Kanada Işık Kaynağı'nda (CLS) BiyoMedikal Görüntüleme ve Terapi (BMIT) kiriş hatları2 üzerinde yapılan deneyler, 0,9 μm kadar küçük voksellerle görüntüler üretilmiştir. Önceki çalışmalar1,3,4,5 bu çözünürlüğü, insan uzun kemiklerinden kortikal kemik örneklerinden projeksiyonlar ve sonraki üç boyutlu (3D) renderlar elde etmek için kullanmıştır ( Şekil1) osteosit lacunar yoğunluğunu ölçmek için 4,6,7,8,9 ve lacunar şekli ve boyutundaki varyasyon3 insan ömrü boyunca ve cinsiyetler arasında. Daha fazla çalışma insanlarda osteon bantlama varlığını göstermiştir10Daha önce adli antropolojik literatürde sadece insan olmayan memeliler ile ilişkili olduğu bilinen bir fenomen.

Olağanüstü çözünürlüğe ulaşmak için, X-ışını ışını, genellikle maksimum numune boyutunu birkaç milimetre çapında sınırlayan görüş alanına (FOV) ince bir şekilde odaklanmalıdır. Şu anda, literatürde bu kısıtlamaları karşılayan kemik numunesi alımını özetleyen kapsamlı, standartlaştırılmış prosedürler açıklanmamıştır. FOV içindeki örneklerin ortalanması, 1) numunenin görüntüleme sırasında 180° dönerken ortalanmış kalmasını ve 2) görüntü kesilmesi olmadığından tarama yapıtlarının sınırlı olmasını sağlamak için kritik öneme sahiptir. Başka bir deyişle, numunenin FOV dışındaki hiçbir kısmı, FOV içindeki odak noktasına giren kirişe müdahale etmemektedir. Bu durumda, yeniden yapılandırma algoritması tam olarak doğru bir yeniden yapılandırma için gereken bazı zayıflama verilerinden mahrumdur. Ayrıca, 360 ° (tam dönüş) taramalarının ışın sertleştirme etkilerini en aza indirdiğini, ancak görüntüleme sırasında yanlış hizalama ve örnek hareketin neden olduğu eserleri artırdığını belirtmek gerekir. Bu nedenle, 360° tarama genellikle daha temiz veriler üretecek olsa da, görüntüleme süresi iki katına çıkarılır ve bu nedenle deneysel maliyet ile veri kalitesi arasındaki bir uzlaşma ele alınmalıdır.

Kemik görüntüleme deneylerinin önemli ve sıklıkla göz ardı edilen bir yönü, taramadan önce gerçekleştirilen doğru ve tekrarlanabilir numune hazırlama tekniğidir. SRμCT yöntemlerini deneylerine dahil eden çalışmalar, örnekleme protokollerinden kısaca bahseder, ancak yazarlar örneklerini toplamak için kullanılan belirli metodoloji hakkında çok az ayrıntı sağlarlar. Bu tür çalışmaların çoğu, rastgele boyutlardaki rektilinear kemik bloklarının kesilmesinden bahseder, ancak genellikle 3 , 4 , 10 , 11,12,13,14kullanılan aletler veya gömme malzemeleri hakkında daha fazla bilgi sağlamaz. Bazı araştırmacılar genellikle ilgi çekici bir bölgeden (ROI) rektilinear kemik bloklarını çıkarmak için el tipi döner aletler kullanırlar (örneğin, Dremel) 3,4,10,11,12,13,14. Bu yöntem, FOV'dan daha büyük olabilecek, tarama yapıtlarının ve görüntü kesilme olasılığını artıran, biçimsiz boyutlandırılmış örneklerle sonuçlanır. Bu tür numuneler genellikle hassas bir elmas gofret testeresi (örneğin, Buehler Isomet) kullanılarak daha fazla rafine etmeyi gerektirir. Elde edilen veri kümelerinin en yüksek kalitede olduğundan ve sonraki sonuçların yinelenebilir olduğundan emin olmak için tutarlı boyutlara sahip örneklerin (yüzde ikiye/mm' ye) tedariki önemlidir.

Numune tedarik metodolojisinin sınırlı raporlaması, önceki bir çalışmada gerçekleştirilen yöntemlerin kullanımına ve/veya doğrulandırılmaya çalışıldığında ekstra bir zorluk katmanı ekler. Şu anda, araştırmacılar örnekleme prosedürleri hakkında daha fazla bilgi için doğrudan yazarlarla iletişime geçmelidir. Burada ayrıntılı olarak açıklanan protokol, biyomedikal araştırmacılara iyice belgelenmiş, çoğaltılabilir ve uygun maliyetli bir örnekleme tekniği sağlar. Bu makalenin birincil amacı, mikroaritektif verilerin doğru görselleştirilmesi ve çıkarılması için bir freze matkap presi ve elmas coring biti kullanarak sürekli olarak boyutlandırılmış kortikal kemik çekirdeği örneklerinin nasıl temin edilmesi konusunda kapsamlı bir öğretici sağlamaktır. Bu yöntem, yüksek basınçlı kaya mekaniğindeki sert malzeme bloklarından tek tip, küçük çaplı (1-5 mm) silindirleri rutin olarak toplamak için kullanılan prosedürlerden15 , 16,17,18,19.

Protokol

Tüm örnekler, Toledo Üniversitesi, Tıp ve Yaşam Bilimleri Koleji ve Kuzeydoğu Ohio Tıp Üniversitesi'ndeki (NEOMED) mumyalanmış kadavra donörlerinden, bağışçının kendilerinin veya donörün en yakın akrabasının bilgilendirilmiş onayıyla elde edildi. Akron Üniversitesi İnsan Denekleri Koruma Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB), bu örnekleri yaşayan bireylerden temin edildikleri için tam IRB incelemesinden muaf gördü. Yaş, cinsiyet ve ölüm nedeni gibi demografik bilgiler tüm bağışçılar için mevcuttu. Seçilen bireyler, ölüm anında kemik tadilatını etkileyebilecek kemik etkileyen durumları veya tedavi rejimlerine maruz kalmayı belgelemediler. Kadavra modern erkek ve kadın femorasından yaşları 19 ile 101 arasında değişen (ortalama = 73,9 yaş) kortikal kemik örnekleri alındı. Femoral midshaft, kortikal gözeneklilik20 , 21,22,23,24ve kemik dokusunun malzeme yoğunluğu25 ,26,27varyasyon incelemeleri de dahil olmak üzere kapsamlı bir şekilde çalışılmış ve böylece mikroyapısal analizler için yaygın olarak kullanılan bir yerhalinegelmiştir.

1. Doku Temini ve Maceration

  1. Sol femoranın orta diafizlerinden ~7,5 cm kemik blokları temin etmek için dalma kesme karbür bıçağı (kompozit malzemeler için) ile donatılmış salınımlı bir testere kullanın.
  2. Femoral blokları toz proteaz enzimi ve musluk suyu çözeltisi ile dolu fırın güvenli bir cam kabın içine 45 °C'de ayarlanmış bir inkübatörde 1 saat bekletin.
  3. Kuluçkadan sonra, künt diseksiyon veya diş aletleri kullanarak kalan yumuşak dokuları ve periosteumu dikkatlice çıkarın.
    NOT: Yumuşak dokuları çıkarmak için keskin aletler (örneğin neşter) kullanmaktan kaçının. Bu tür aletler, μCT taramalarında tespit edilebilen kemikte hasara neden olabilir, numune korumasını ve tarama veri kalitesini etkileyebilir.
  4. Kemik bloklarını ultrasonik bir temizleyiciye 20:1 parça musluk suyu ile 5-10 dakika boyunca temizleyerek (bkz. Malzeme Masası)veya el tipi su ipi (örneğin, Waterpik) kullanarak medüller boşluktaki döküntüleri veya tıkanıklıkları giderin.
  5. Kemik bloğunu bir numune kabına batırın ve% 70 etanol ile doldurun. Lipitleri çıkarmak için kemiğin en az 24 saat ıslamasına izin verin.
    NOT: Ksilenler lipitleri çıkarmak için de kullanılabilir. Bununla birlikte, ksilenlerde uzun süre ıslatmak, emülgatör olduğu için kemiği kırılgan veya tebeşirli hale getirebilir.
  6. 24 saat sonra, kemik bloklarını etanolden çıkarın ve ortam sıcaklığında 24-48 saat boyunca kurumaya bırakın.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir.

2. Doku kesitleri

  1. 140 °C'ye ayarlanmış bir sıcak tabağa 75 x 25 mm cam mikroskop kaydırağı yerleştirin. Slaytın ortasında çok miktarda termal epoksi reçinesi eritin (bkz. Malzeme Tablosu).
    1. Mikroskopi (<50 μm) için ek ince bölümler hazırlıyorsanız, trabeculae'yi korumak için kemik bloğunun iki parçalı bir epoksiye gömülmesi gerekebilir. Ayrıca, kırılgan numuneler (örneğin, diagenetik kemik veya yüksek trabekülerize numuneler) için bu protokolü uygularken, örnekleri bir epoksiye gömmek gereklidir.
      NOT: Bu protokolde kullanılan kemik örnekleri mumyalanmış kadavra örneklerinden alındı. Taze örnekler otopside veya SRμCT yoluyla yumuşak doku yapılarını (örneğin vaskülat) incelemek için cerrahi bir vakadan toplanırsa, epoksi ile emprenye bu tür dokulara zarar verebilir. Bu durumlarda, alternatif bir yapıştırıcı veya montaj ortamı önerilir (örneğin, çift taraflı bant, modelleme kili).
  2. Kemik bloğunun alt yönünü mikroskop kaydırağındaki termal epoksi reçinesine, kemiğin uzunluğu slayda dik olacak şekilde bastırın. Kemiğin altını kaplamak ve slayda güvenli yapıştırma sağlamak için numuneyi ileri geri kaydırın.
  3. Termal epoksinin gözeneklere ve/veya çatlaklara fitillenebilmesi için monte edilen numuneyi sıcak plakada ~5 dakika dinlendirin.
    NOT: Slayttaki epoksi, en iyi yapıştırma için kabarcık içermemelidir. Kabarcıkları kaldırmak için örneği slaytta ileri geri kaydırın. Kabarcıklar genellikle kemiğin içinde sıkışan su ve/veya etanol nedeniyle oluşur ve buharlaşır.
  4. Monte edilmiş numune ile kaydırağı künt forseps kullanarak sıcak plakadan çıkarın ve oda sıcaklığında ~10 dakika soğumaya bırakın. Aynanın slaydı yeterince kavramasını sağlamak için jilet kullanarak slaydın kenarından herhangi bir epoksiyi çıkarın.
  5. Yapışık numune ile slaydı bir cam slayt aynasına takın ve mandreni yavaş hızlı bir kesit testeresinin döner koluna monte edin (bkz. Malzeme Tablosu, Şekil 2).
    NOT: Bu protokolde bir Buehler IsoMet testeresi kullanılırken, IsoMet yerine kullanılabilecek başka hassas kesit testereleri de mevcuttur (örneğin, Leco, Exakt, Smartcut, CT3, Buehler Petrothin, Well Diamond Wire).
  6. Bıçağın numuneye temas etmesini ve transekte etmesini sağlamak için konumlandırma kadranını kullanarak döner kolu ayarlayın. Numuneyi, kemiğin bir kesiti uzunluğuna dik kesilecek şekilde konumlandırın.
  7. Kolun ağırlığına karşı koymak için kesme kolunun uzak tarafına ağırlıklar ekleyin.
    NOT: Yetersiz karşı ağırlık kullanılırsa, numune bıçağın üzerinde dayanabilir ve bıçağın kırılmasına neden olabilir.
  8. Testerenin sıvı haznesine kesme sıvısı (kesme sıvısına 20:1 parça su) ekleyin.
  9. Elmas gofret bıçağını sıkıca sabitleyin ve sıvı seviyesinin bıçağın kesme kısmını batırmasını sağlayın. Hızı 200 RPM olarak ayarlayın ve numuneyi yavaşça bıçağın üzerine 200 RPM'ye 200 ayarlayın (Şekil 3).
  10. Bıçak ve mandrenin sallanmamasını ve/veya zıplamamasını sağlayın. Aşırı hareket dikkat edilirse, kesmeye devam etmeden önce testereyi derhal durdurun ve bıçak ve/veya ayna kolu montajını sıkın. Mandren agresif bir şekilde yukarı ve aşağı hareket ediyorsa ek karşı ağırlıklar ekleyin. Görünür yan yana hareket de dahil olmak üzere aşırı hareket bıçağın kırılmasına neden olabilir.
  11. İlk kalın bölüm, her ek kesime paralel olarak iyi tanımlanmış bir yüzey sağlamak için bir 'atık kesimi'dir. İlk atık kesildikten sonra, döner kolu kaldırın ve konumlandırma kadranını kullanarak mandreni 5 mm'ye doğru hareket ettirün. Bu yöntemle mikroskopi için daha kalın bölümler (~1 mm) daha fazla toplanabilir.
    NOT: Değerli doku tasarrufu sağlamak için atık kesimi atlanabilir. Bununla birlikte, bir numuneyi düzensiz bir kenarla bölümlerken, numunenin zirvesinin teğetsel olarak koring matkap ucunun kenarına dizilmesi önemlidir.
    1. Kesirleme yaparken bıçağın kerf'ini hesaba kattığınızdan emin olun. Örneğin, 0,5 mm'lik bir kerf içeren bir bıçaktan 5 mm'lik bir bölüm almak için numuneyi hareket ettirip 5,5 mm'yi bıçağa doğru fırlatın.
  12. Bölümleme tamamlandıktan sonra, termal epoksiyi eritmek için monte edilmiş numune ile cam kaydırağı sıcak bir tabağa yerleştirin. Bu, kemik blokların slayttan hızlı bir şekilde çıkarılmasını sağlar.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir.

3. Örnek koring

  1. 2.2-2.4 adımlarında açıklandığı gibi termal epoksi yapıştırma tekniğini kullanarak sığ bir alüminyum tenekenin altına (~8 cm çapında) 5 mm kemik bölümleri monte edin.
  2. Tenekeyi freze matkap presinin XY makine masasına yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu)ve elle sıkma sabitleme kelepçeleri (Şekil 4).
  3. Değirmen delici mandrenine 2 mm iç çaplı içi boş şaftlı kuyumcunun elmas uçlu koring matkap ucu (bkz. Malzeme Masası)yerleştirin. Tenekeden korselenmeyi önlemek için derinlik sınırlayıcıyı ayarlayın (Şekil 5).
  4. Periosteum, endosteum veya yüksek trabekülerize alanlarla yakın temastan kaçınırken kemik örneğinin merkezi ön yönünü matkap ucunun altına hizalayın.
    NOT: Kortikal kalınlık bireyler arasında, özellikle artan yaşla birlikte değiştiğinden, orta-ön femoral kortizlerin otomatik seçimi mümkün değildir.
  5. Numuneyi tamamen örtmek için tenekeyi damıtılmış suyla doldurun. Bu, ısı birikmesini, numunenin yanmasını ve/veya koring sırasında matkap ucunun zarar görmesini önler.
    NOT: Koringin neden olduğu ısı hasarı olasılığını değerlendirmek için, koring ucu kemiklerin yüzeyine ilk kez nüfuz ettiği için damıtılmış sudan sıcaklık okumaları elde etmek için kızılötesi bir termometre kullanılmıştır. Sıcaklık, bu test için korselenen on örnek arasında 22,9 - 23,9 °C arasında 1 °C arasında değişmektedir. Bu nedenle, ısı kaynaklı hasarın ihmal edilebilir olduğunu savunuyoruz.
  6. Çekirdek biti ve kemik arasındaki ilk birkaç temas örneği için, kemiğin üst yüzeyinde bir halka takmak için hafif basınç uygulayın. Bu, koring işleminin başında matkap ucunun sapmasını önler ve ucun doğru yerleştirilmesini sağlar.
  7. Koring sırasında, ucu su yüzeyinin altında tutarken matkap ucunu numunenin içine ve dışına kaldırın. Sıkışmış kemik tozunu temizlemek ve kalıntıların matkap ucunu tıkamamasını sağlamak için bu tekniği birkaç saniyede bir sürdürün.
    NOT: Çekirdek konik bir şekil oluşturuyorsa, muhtemelen 1) kemik tozunu coring bitinden temizlemek için yeterli zaman izin vermiyor ve 2) koring çok hızlı gerçekleşiyor. Artan hız, numuneden büyük parçaları koparabilir ve üstün yönü toz haline getirebilir.
  8. Koring tamamlandıktan sonra, elde edilen kemik çekirdeği içi boş saplı matkap ucuna yerleşebilir (Şekil 6). Çekirdeği bitten çıkarmak için bir çift ince uçlu tokmak veya küçük bir Allen anahtarı kullanın (Şekil 2).
  9. Çekirdekli numuneyi etiketli bir mikrosantrifüj tüpünde görüntülemeye kadar serin ve kuru bir yerde saklayın.

4. Kortikal kemik çekirdeklerinden kemik mikro mimarisi parametrelerini değerlendirmek için görüntü işleme rutinleri

  1. μCT görüntülerinin yeniden yapılandırılması
    1. SRμCT projeksiyon görüntülerinin yeniden yapılandırılması için en son NRecon sürümünü https://www.bruker.com/products/microtomography.html indirin ve yükleyin.
    2. Masaüstünde NRecon kısayolu seçin ve ilişkili GPUReconServer görünecektir.
    3. İstediğiniz veri kümesini açılır pencerede açın. Pencere görünmüyorsa, dataviewer penceresinin sol üst köşesindeki klasör simgesini seçin.
    4. SRμCT alımından ilk projeksiyonu seçin. Çıktıaltında, Yatırım Getirisi Kullan ve ON Ölçekleseçimlerini kaldırın.
    5. Yeniden yapılandırma dosyası hedefini seçin. Gözat'ı seçin ve Keşifadlı yeni bir klasör oluşturun. Seçilen dosya biçimi BMP(8) olmalıdır.
    6. Yanlış Hizalama Telafisi 'nebakın.
      NOT: Bu tahmin genellikle düzeltmeye yakındır. Kaba 3D render, sağ ve sol kenarların mümkün olduğunca yakın hizalanması için üst üste binen görüntüleri kaydırmak için okları yukarı ve aşağı hareket ettirerek manuel olarak ayarlanabilir.
    7. Ayarlaraltında, Yumuşatma , Işın Sertleştirme, CS Döndürme, FOV'dan Daha Büyük Nesne ve Halka Yapı algoritmalarıuygulamak için istediğiniz seçimleri seçin.
    8. Otomatik 'i seçerek Çıktı altındaki histogramı ayarlayın.
      NOT: Elde eden görüntü soluk olabilir.
    9. Yeniden yapılandırmayı işlemeye başlamak için Başlat'ı seçin.
    10. Kanal/osteosit lacunar indeksleri için standart isimlendirme kullanın28. Bunlar şunları içerebilir: toplam VOI doku hacmi (TV), kanal hacmi (Ca.V), toplam kanal sayısı (Ca.N), ortalama kanal çapı (Ca.Dm), kortikal gözeneklilik (Ca.V/TV), yüzde olarak verilen, toplam lacunae sayısı (N.Lc) ve ortalama lacunar hacmi (Lc.V). Mm3 (N.Lc/BV) başına lacunar yoğunluğunu belirlemek için kemik hacmi (BV) toplam hacim eksi kanal hacmi (TV-Ca.V) olarak hesaplanır.
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
  2. Yeniden Yapılandırılmış Görüntülerden Mikroarşitektif Verilerin Toplanması
    1. Mikroarşektif parametrelerin analizi için CTAnalyser'in en son sürümünü https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html indirin ve yükleyin.
      NOT: CTAnalyser'ın ücretsiz sürümü işlevsellikle sınırlıdır. Bu nedenle, daha ayrıntılı analizler yapmak için tam bir lisans satın almanız önerilir.
    2. Resim | Altında Özellikler | Piksel boyutunu değiştir, piksel boyutunun uygulanan μCT görüntüleme protokolüyle eşleştiğinden emin olun.
      NOT: ImageJ veya benzer bir programdaki görüntüleri düzenliyorsanız, kaydettikten sonra TIFF dosyasına gömülü üstbilginin değiştirileceğini ve analiz yazılımının veri kümesini içe aktarırken piksel boyutunu değiştireceğini unutmayın.
    3. Seçin Özel İşleme görev listesi oluşturmak için (bkz. Tamamlayıcı Malzemeler) tarama veri kümesinden kemik mikro mimarisini analiz etmek için. CTAnalyser'a özel eklentileri kullanarak osteosit lacunar ağ parametreleri için genel bir protokol burada aşağıdaki gibidir:
      NOT: Eklenti görev listesi, örneğin FOV'da görünen tek konu olduğu veri kümeleri için iyi çalışır. Numuneyi boş alan çevrelerse, yatırım getirisi uygulanması gerekir. Aksi takdirde, 3D Analiz ve Bireysel Nesne Analizi'nde toplanan değerler yapay olarak azaltılacaktır.
      1. Analiz yazılımında Özel İşleme menüsünü açmadan önce görüntüleri sıfırlamak ve/veya ayarlamak için (örneğin, ImageJ veya benzeri bir düzenlemeden) yeniden yükleyin.
      2. Görüntülerdeki gürültüyü azaltmak için, yuvarlak çekirdekli ve yarıçapı 2-3 olan 3B alana Gauss düşük geçişli bir filtre uygulayın.
        NOT: Bu ayarlar, deneme yanılma testi yoluyla bildirilen SRμCT denemelerinden veri kümelerine uygulanmıştır. Amaç, veriler için en kaliteli rekonstrüksiyonları elde etmekti. Yeniden yapılandırma ayarlarını her benzersiz deneysel kuruluma uyacak şekilde ayarlayın.
      3. Vasküler kanalları vurgulamak için düşük ve yüksek değerler seçerek görüntülere genel gri tonlama eşik uygulayın. Şekil 8B ve 8B'de görülen yeniden yapılandırılmış dilimler 0-155 örnek eşiğini tasvir eder.
        NOT: 4.2.3.2 adımına benzer şekilde, burada uygulanan eşik ayarları kapsamlı deneme yanılma yoluyla seçilmiştir. Eşik, kullanılan her deneysel kurulum ve μCT görüntüleme sistemi için ayarlanmalıdır.
      4. Sadece kanalları izole etmek için osteosit lacunae'nin hacimsel piksel (voxel) boyut aralığındaki 3D alandaki beyaz lekeleri çıkarmak için despeckle (denoise).
        NOT: 0,9 μm piksel boyutunda alınan insan kortikal kemiğinin SRμCT taraması için osteosit lacuna için alt sınır 13 vokseldir.
      5. Kanallardaki eserleri çıkarmak için 2D alandaki siyah lekeleri çıkarmak için despeckle. Bunlar 2B olarak oldukça büyük olabilir, böylece <15.000 piksel olan özellikleri kaldırın.
      6. Kanallarda sıkışan yumuşak dokuları izole etmek için, görüntülerin kalitesine bağlı olarak 2 veya 3 yarıçaplı yuvarlak bir çekirdekle Morfolojik çalışma işlevini kullanarak gözenekleri 3D alanda genişletin.
      7. 4.2.3.5 adımıyla aynı ayarları kullanarak ek bir Despeckle işlevi gerçekleştirin. kanallar içindeki izole yumuşak dokuları çıkarmak için.
      8. 4.2.3.6 adımından genişlemeyi aşındırın. 2 veya 3 yarıçaplı yuvarlak bir çekirdek kullanarak Morfolojik işlem işlevini kullanma. Bu adımın yarıçapı Yordam 4.2.3.6'da kullanılan yarıçapla eşleşmelidir.
      9. 3D Analiz'i çalıştırın ve damar kanallarının hacmi için hangi parametrelerin hesaplanacağını seçin. Genellikle, temel değerler yeterli bilgi sağlayacaktır.
      10. Bit eşlemleri kaydet ile işlenen görüntüleri dizindeki özel bir alt klasöre kaydedin.
        NOT: Amira/Avizo, Dragonfly, Drishti gibi bir program kullanarak işlenen görüntülerden 3D rekonstrüksiyon görüntüsü oluşturuyorsanız, görüntülerin tek renkli (1 bit) olarak kaydedilmeleri önerilir.
      11. Vasküler kanalların sayısını hesaplayın ve Tek Tek Nesne Analizi işlevini kullanarak boyutlarını, şekillerini ve yönelimlerini tanımlayın.
      12. 4.2.3.1 – 4.2.3.3 adımlarını yineleyin. osteosit lacunar analizi için görüntüyü sıfırlamak için.
      13. Despeckle işlevini kullanarak 3D alandaki beyaz lekeleri çıkarın ve bu tür eserlerin lacunar boyutunun alt sınırından daha küçük olmasını sağlayın. Bu adım, gerçek osteosit lacunae'yi korurken, kortikal gözenekler gibi görünebilecek gürültüyü taramadan kaldırır. 0,9 μm piksel boyutunda insan SRμCT taramaları için bu alt sınır 13 vokseldir.
      14. Lacunar boyutunun üst sınırından daha büyük beyaz lekeleri çıkarmak için bir kez daha despeckle. Adım 4.2.3.13'te listelenen ayarlara sahip insan SRμCT veri kümeleri için bu sınır 2743 vokseldir.
      15. Özellikle osteosit lacuna ile ilgili mikroyapısal bilgileri ayıklamak için 3D Analiz gerçekleştirin.
      16. Osteosit lacunae'yi yalıtmak için işlenen görüntüleri kaydetmek için Bitmapleri Kaydet'i seçin.
      17. Seçilen İlgi Hacmi (VOI) içindeki osteosit sayısını 3B olarak hesaplamak için Bireysel Nesne Analizi gerçekleştirin.
        NOT: Görev listesi oluşturulduktan ve test edildikten sonra, CTAnalyser, veri ayıklamayı hızlandırmak ve tekdüze görüntü işlemeyi sağlamak için bunların kullanılabileceği bir toplu iş yöneticisi (BatMan) işlevine sahiptir. Yordam 4.2.3 için örnek ayarları içeren bir görev listesi. Ek Malzemeler'debulunabilir.

Sonuçlar

Açıklanan çekirdek örnekleme yönteminin son derece etkili ve verimli olduğu kanıtlanmıştır. Bu protokolü kullanan korse numuneleri, CLS BMIT-BM kiriş hattı 2 üzerindeki deneyler için 1,49 μm voksel boyutunda~2mm FOV ile >300 sürekli boyutlu numunelerin tedarikine izin verdi. Çekirdek çapının tutarlılığını doğrulamak için, insan ön femoral çekirdeklerinin bir alt kümesinin uzunluğu (üst, orta, alt) boyunca üç ölçüm yapıldı (n=69). Çekirdeklerin orta...

Tartışmalar

Sınırlı FOV kurulumları ile yüksek çözünürlüklü SRμCT görüntüleme için tek tip ve silindirik kortikal kemik çekirdeği örnekleri temin etmek için kapsamlı, standartlaştırılmış bir protokol olmamıştır. Burada ayrıntılı olarak açıklanan protokol, SRμCT görüntüleme için sürekli olarak boyutlandırılmış kortikal kemik çekirdeği örneklerinin nasıl temin edilmesi ve daha sonra mikroarctektif verilerin doğru görselleştirilmesi ve çıkarılması hakkında kapsamlı bir öğretici...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu makalede açıklanan araştırma, Kanada Yenilik, Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi, Saskatchewan Üniversitesi, Saskatchewan Hükümeti, Batı Ekonomik Çeşitlendirme Kanada, Ulusal Araştırma Konseyi Kanada ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri tarafından desteklenen Kanada Işık Kaynağı'ndaki BMIT tesisinde gerçekleştirildi. Yazarlar, Kanada Işık Kaynağı'ndaki beamline bilim adamlarına, özellikle Adam Webb, Denise Miller, Sergey Gasilov ve Ning Zu'ya SkyScan SRμCT ve beyaz ışın mikroskop sistemlerinin kurulumu ve sorunlarının giderilmesindeki yardımları için teşekkür etmek istiyor. Ayrıca Toledo Üniversitesi Tıp ve Yaşam Bilimleri Koleji'nden Beth Dalzell'e ve Kuzeydoğu Ohio Tıp Üniversitesi'nden Dr. Jeffrey Wenstrup'a bu çalışma için kadavra örneklerine erişim için teşekkür ederiz. JM Andronowski, Akron Üniversitesi ve Adli Bilimler Adli Bilimler Ulusal Adalet Araştırma ve Geliştirme Enstitüsü tarafından sağlanan başlangıç araştırma fonları (2018-DU-BX-0188) ile desteklenmektedir. RA Davis, Akron Üniversitesi tarafından sağlanan bir lisansüstü asistanlık tarafından desteklenmektedir. Koring ve testereleme için kullanılan ekipman ve malzemeler, Akron Üniversitesi ve NSF tarafından CW Holyoke'ye EAR-1624242 hibesi tarafından sağlanan başlangıç fonları tarafından satın alındı.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1-1/8" plunge cutting carbide for compositesWarrior6181228.6mm plunge
70% EthanolFisher ScientificBP82015003.8 Liters
Blunt-tipped forcepsFisher Scientific10-300
Centrifuge tubesThermoFisher55398
Crystalbond 509-3 EpoxyTed Pella821-3
CTAnalyserBruker microCTv.1.15.4.0Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html
Dental Tool KitAmazon787269885110
Diamond wafering saw blade for composite materialBuehler#11-4247
Drill PressJet Mill/Drill350017Model: JMD-15, benchtop drill presses are suitable substites, but typically lack a translatable machine table for positioning samples beneath the drill stem
Fine-tipped forcepsFisher Scientific22-327379
Fixturing clamps for XY machine table for mill/drillMSC Industrial Supply#04804571
Glass microscope slidesTed Pella2600575x50mm slides, 1mm thick
Glass slide chuckBuehler#112488Large enough to hold 75x50mm glass slides
Hot plate capable of reaching 140 °CThermoScientificHP88850105
IncubatorNAPCOModel 4200
Isocut FluidBuehler111193032Lubricant; 30mL
Jeweler's diamond coring drill bitOtto Frei#119.0502mm inner diameter hollow stem coring bit
NReconBruker microCTv.1.6.10.2Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography.html
Oscillating sawHarbor Freight62866
Oven-safe glass dishesPyrex1117715Glass food storage container
Precision slow-speed saw (Isomet 1000)Buehler111280160
Razor bladesAmazon25181
Shallow aluminum tinsAmazonB01MRWLD0R~8cm diameter
Specimen cupsAmazon616784425436 885334344729
Tergazyme detergentAlconox1304-11.8kg box
Ultrasonic cleanerMTI CorporationKJ201508006

Referanslar

  1. Andronowski, J. M., Crowder, C., Soto Martinez, M. Recent advancements in the analysis of bone microstructure: New dimensions in forensic anthropology. Forensic Sciences Research. 3 (4), 278-293 (2018).
  2. Wysokinski, T. W., et al. Beamlines of the biomedical imaging and therapy facility at the Canadian light source - part 3. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 775, 1-4 (2015).
  3. Carter, Y., Suchorab, J. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Normal variation in cortical osteocyte lacunar parameters in healthy young males. Journal of Anatomy. 225 (3), 328-336 (2014).
  4. Carter, Y., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Femoral osteocyte lacunar density, volume and morphology in women across the lifespan. Journal of Structural Biology. 183 (3), 519-526 (2013).
  5. Langer, M., et al. X-Ray Phase Nanotomography Resolves the 3D Human Bone Ultrastructure. PLoS ONE. 7 (8), 35691 (2012).
  6. Peyrin, F., Dong, P., Pacureanu, A., Langer, M. Micro- and Nano-CT for the Study of Bone Ultrastructure. Current Osteoporosis Reports. 12 (4), 465-474 (2014).
  7. Dong, P., et al. 3D osteocyte lacunar morphometric properties and distributions in human femoral cortical bone using synchrotron radiation micro-CT images. Bone. 60, 172-185 (2014).
  8. Gauthier, R., et al. 3D micro structural analysis of human cortical bone in paired femoral diaphysis, femoral neck and radial diaphysis. Journal of Structural Biology. 204 (2), 182-190 (2018).
  9. Giuliani, A., et al. Bisphosphonate-related osteonecrosis of the human jaw: A combined 3D assessment of bone descriptors by histology and synchrotron radiation-based microtomography. Oral Oncology. 82, 200-202 (2018).
  10. Andronowski, J. M., Pratt, I. V., Cooper, D. M. L. Occurrence of osteon banding in adult human cortical bone. American Journal of Physical Anthropology. 164 (3), 635-642 (2017).
  11. Andronowski, J. M., Mundorff, A. Z., Pratt, I. V., Davoren, J. M., Cooper, D. M. L. Evaluating differential nuclear DNA yield rates and osteocyte numbers among human bone tissue types: A synchrotron radiation micro-CT approach. Forensic Science International: Genetics. 28, 211-218 (2017).
  12. Britz, H. M., et al. Prolonged unloading in growing rats reduces cortical osteocyte lacunar density and volume in the distal tibia. Bone. 51 (5), 913-919 (2012).
  13. Maggiano, I. S., et al. Three-dimensional reconstruction of Haversian systems in human cortical bone using synchrotron radiation-based micro-CT: morphology and quantification of branching and transverse connections across age. Journal of Anatomy. 228 (5), 719-732 (2016).
  14. Cooper, D. M. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Hallgrímsson, B. Three-dimensional microcomputed tomography imaging of basic multicellular unit-related resorption spaces in human cortical bone. The Anatomical Record Part A: Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 228 (7), 806-816 (2006).
  15. Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J., Ulrich, C. Rheology of magnesite: Rheology of Magnesite. Journal of Geophysical Research: Solid Earth. 119 (8), 6534-6557 (2014).
  16. Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K. Reversible water weakening of quartz. Earth and Planetary Science Letters. 374, 185-190 (2013).
  17. Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J. Dislocation creep of polycrystalline dolomite. Tectonophysics. 590, 72-82 (2013).
  18. Raterron, P., Fraysse, G., Girard, J., Holyoke, C. W. Strength of orthoenstatite single crystals at mantle pressure and temperature and comparison with olivine. Earth and Planetary Science Letters. 450, 326-336 (2016).
  19. Millard, J. W., et al. Pressure Dependence of Magnesite Creep. Geosciences. 9 (10), 420 (2019).
  20. Thomas, C. D. L., Feik, S. A., Clement, J. G. Regional variation of intracortical porosity in the midshaft of the human femur: age and sex differences. Journal of Anatomy. 206 (2), 115-125 (2005).
  21. Jowsey, J. Age Changes in Human Bone. Clinical Orthopaedics and Related Research. 17, 210 (1960).
  22. Martin, R. B., Pickett, J. C., Zinaich, S. Studies of skeletal remodeling in aging men. Clinical Orthopaedics and Related Research. (149), 268-282 (1980).
  23. Martin, R. B., Burr, D. B. Mechanical implications of porosity distribution in bone of the appendicular skeleton. Orthopedic Transactions. 8, 342-343 (1984).
  24. Bousson, V., et al. Distribution of Intracortical Porosity in Human Midfemoral Cortex by Age and Gender. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (7), 1308-1317 (2001).
  25. Goldman, H. M., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Bromage, T. G. Relationships among microstructural properties of bone at the human midshaft femur. Journal of Anatomy. 206 (2), 127-139 (2005).
  26. De Micheli, P. O., Witzel, U. Microstructural mechanical study of a transverse osteon under compressive loading: The role of fiber reinforcement and explanation of some geometrical and mechanical microscopic properties. Journal of Biomechanics. 44 (8), 1588-1592 (2011).
  27. Martin, R. B., Boardman, D. L. The effects of collagen fiber orientation, porosity, density, and mineralization on bovine cortical bone bending properties. Journal of Biomechanics. 26 (9), 1047-1054 (1993).
  28. Cooper, D. M. L., Turinsky, A. L., Sensen, C. W., Hallgrímsson, B. Quantitative 3D analysis of the canal network in cortical bone by micro-computed tomography. The Anatomical Record Part B: The New Anatomist. 274 (1), 169-179 (2003).
  29. Crowder, C., Heinrich, J., Stout, S. D. Rib histomorphometry for adult age estimation. Forensic Microscopy for Skeletal Tissues: Methods and Protocols. , 109-127 (2012).
  30. Pfeiffer, S. Paleohistology: Health and disease. Biological Anthropology of the Human Skeleton. , 287-302 (2000).
  31. Bone Hedges, R. E. M. diagenesis: an overview of processes. Archaeometry. 44 (3), 319-328 (2002).
  32. . The use of formaldehyde imbedded human remains in experimental procedures Available from: https://capa-acap.net/sites/default/files/basic-page/capa_2017_program_final_no_cover.pdf (2017)
  33. Currey, J. D., Brear, K., Zioupos, P., Reilly, G. C. Effect of formaldehyde fixation on some mechanical properties of bovine bone. Biomaterials. 16 (16), 1267-1271 (1995).
  34. Asaka, T., Kikugawa, H. Effect of formaldehyde solution on fracture characteristics of bovine femoral compact bone. Journal of the Japan Institute of Metals. 69 (8), 711-714 (2005).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 160Kortikal Kemik3D G r nt lemeKompozit Dokularmikro BTSenkrotronG r nt leme

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır