Viral Kaynaklı Nöroinflamatuar Yanıtları İncelemek Için Fare Ayak Takımı Aşılama Modeli

Özet

Ayak takımı aşılama modeli in vivo viral kaynaklı nöroinflamatuar yanıtları karakterize etmek için değerli bir araçtır. Özellikle, viral kinetik ve ilgili immünopatolojik süreçlerin periferik sinir sisteminde başlatılan net bir değerlendirme sağlar.

Özet

Bu protokol farelerde alfaherpesvirus enfeksiyonu sırasında nöroinflamatuar yanıtların başlatılması ve geliştirilmesi için kullanılan bir footpad aşılama modeli açıklar. Alfaherpesvirüsler periferik sinir sisteminin ana işgalciler ilerler gibi (PNS), Bu model viral çoğaltma kinetik karakterize etmek için uygundur, CNS PNS onun yayılması, ve ilişkili nöroinflamatuar yanıtlar. Ayak takımı aşılama modeli virüs parçacıkları nın ayak takımı epidermisindeki birincil enfeksiyon bölgesinden epidermisin, ter bezlerini ve dermisi innerve eden duyusal ve sempatik sinir liflerine yayılmasını sağlar. Enfeksiyon dorsal kök gangliyonu siyatik sinir yoluyla yayılır (DRG) ve sonuçta beyne omurilik yoluyla. Burada, bir fare footpad pseudorabies virüs (PRV), bir alfaherpesvirüs yakından herpes simpleks virüsü (HSV) ve varisella-zoster virüsü (VZV) ile ilgili aşılanır. Bu model PRV enfeksiyonu ciddi inflamasyon neden olduğunu göstermektedir, ayak ve DRG nötrofil infiltrasyon ile karakterize. Yüksek inflamatuar sitokin konsantrasyonları daha sonra ELISA tarafından homojendokularda saptanır. Buna ek olarak, DRG'de PRV geni ile protein ekspresyonu (qPCR ve IF boyama yoluyla) ile pro-inflamatuar sitokin üretimi arasında güçlü bir korelasyon gözlenmektedir. Bu nedenle, ayak takımı aşılama modeli alfaherpesvirüs kaynaklı nöropatilerin altında yatan süreçlerin daha iyi anlaşılmasını sağlar ve yenilikçi tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yol açabilir. Buna ek olarak, model periferik nöropatiler üzerinde araştırma rehberlik edebilir, multipl skleroz ve PNS ilişkili viral kaynaklı hasar gibi. Sonuçta, uyuşturucu gelişimi için bir maliyet-etkin in vivo aracı olarak hizmet verebilir.

Giriş

Bu çalışma, PNS'den CNS'ye ve ilişkili nöroinflamatuar yanıtlara kadar virüslerin replikasyonve yayılmasını araştırmak için bir footpad aşılama modelini açıklamaktadır. Ayak takımı aşılama modeli yoğun nöronlarda alfahiçvirüs enfeksiyonu çalışmak için kullanılmıştır^1,2,3. Bu modelin temel amacı nörotropik virüsler CNS ulaşmadan önce PNS ile maksimal bir mesafe seyahat etmek için izin vermektir. Burada, bu model psödorabis virüsü (PRV) ile enfekte farelerde belirli bir nöropati (nöropatik kaşıntı) gelişiminde yeni anlayışlar elde etmek için kullanılır.

PRV birkaç iyi bilinen patojenler ile ilgili bir alfaherpesvirus (yani, herpes simpleks tip 1 ve 2 [HSV1 ve HSV2] ve varisella-zoster virüsü [VZV]), hangi soğuk yaralar, genital lezyonlar ve su çiçeği neden, sırasıyla⁴. Bu virüslerin hepsi pantropik ve belirli bir doku tipi için yakınlık göstermeden birçok farklı hücre tipleri enfekte edebiliyoruz. Ancak, hepsi ev sahibi türlerin PNS (ve bazen, CNS) işgal ederek karakteristik bir nörotropizm sergiler. Doğal konak domuz, ama PRV en memeliler bulaştırmak olabilir. Bu doğal olmayan konaklarda, PRV PNS enfekte ve şiddetli bir pruritus indükler "deli kaşıntı", perakut ölüm takip^5,6. PRV enfeksiyonunun klinik sonucu ve patogenezinde nöroimmün yanıtın rolü tam olarak anlaşılamamıştır.

Ayak takımı aşılama modeli PRV footpad epidermal hücrelerde enfeksiyon başlatmak için izin verir. Daha sonra, enfeksiyon epidermis innerve duyusal ve sempatik sinir lifleri içine yayılır, ter bezleri, ve dermis. Enfeksiyon yaklaşık 60 saat içinde DRG siyatik sinir yoluyla hareket eden virüs parçacıkları tarafından yayılır. Enfeksiyon omurilik yoluyla yayılır, sonuçta hayvanlar moribund (82 h post-enfeksiyon) haline geldiğinde arka beyne ulaşan. Bu süre zarfında doku örnekleri toplanabilir, işlenebilir ve virüs replikasyonu ve immün yanıt ın belirteçleri için analiz edilebilir. Örneğin, PRV patogenezinde klinik, virolojik ve nöroinflamatuar süreçlerin başlatılması ve gelişimi arasında korelasyon lar kurmak için farklı dokularda histolojik inceleme ve viral yük nicelliği yapılabilir.

Ayak takımı aşılama modeli kullanılarak farelerde PRV'ye bağlı pruritusun hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırılabilir. Ayrıca, Bu model herpesvirus enfeksiyonları sırasında virüs kaynaklı nöroinflamasyon başlatılması ve gelişimi içine yeni bir fikir sağlayabilir. Alfaherpesvirüs kaynaklı nöropatilerin altında yatan süreçlerin daha iyi anlaşılması yenilikçi tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yol açabilir. Örneğin, bu model post-herpezik lezyonları olan hastalarda nöropatik kaşıntı mekanizmaları araştırmak için yararlıdır (örneğin, herpes zoster, zona) ve ilgili insan hastalıkları için farelerde yeni terapötik hedefleri test.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri Princeton Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından gözden geçirilip onaylanan bir protokole (sayı 2083-16 ve 2083-19) uygun olarak yapılmıştır. Bu çalışma, Princeton Üniversitesi biyogüvenlik komitesi tarafından onaylanmış tam donanımlı bir laboratuarımız olan biyogüvenlik seviyesi-2 (BSL-2) gerekliliklerini sıkı bir şekilde izleyerek yapılmıştır. Fare ayak takımı aşınması, viral aşılama, fare diseksiyonu ve doku toplama gibi işlemler Princeton Üniversitesi biyo-çevreleme hayvan tesis odasında bir biyolojik güvenlik kabininde (BSC) gerçekleştirildi. Prosedürü gerçekleştirenler tek kullanımlık gece elbiseleri, baş örtüsü, göz koruması, steril eldivenler, cerrahi maskeler ve ayakkabı kılıfları giydiler.

1. Fare ayak takımı aşınması

1. Bir C57BL/6 fare anestezi (5-7 hafta eski) izofluran gaz anesteziile, küçük bir anestezi sistemi (oda) ile% 3 dozda teslim.
   1. Fareyi, aşıdan önce arka ayak altlığı nda, cerrahi anestezi düzlemine yerleştirin. Fareye diyaframlı bir burun konisi (hayvanın namlusuna uyacak kadar büyük bir yarık) takın ve sabit dozda izofluran gazı anestezik %1,5-2,0 oranında anestezi kağıda takın.
   2. Başparmak forseps ile güçlü çimdikleme tarafından oluşturulan ağrılı uyarıcı bir yanıt için yakından fareyi izleyin.
2. Hafifçe düz forceps ile bir arka ayak takımı kavramak.
   1. Yavaşça arka ayak takımı glabrous cilt aşındırın yaklaşık 20x, topuk ve yürüyüş pedleri arasında, bir emery kurulu (100-180 kum). Çok sık abrading veya çok fazla basınç uygulayarak kanama neden etmeyin.
   2. İnce forceps kullanarak, yavaş yavaş stratum basale ortaya çıkarmak için aşınma ile ayrılmış stratum korneum soyma.

2. PRV ayak takımı aşısı

1. % 2 fetal sığır serumu (FBS) ve % 1 penisilin/streptomisin içeren DMEM ortamlarında istenilen titreye seyreltilmiş virüs inokülünü hazırlayın (Malzeme Tablosu).
   1. PK15 hücrelerindeki virüs stoğundaki plak oluşturan birimlerin (PFU) sayısını hesaplayın ve standartlaştırın ve viral inokülü buna göre seyreltin.
      NOT: Bu çalışmada 8 x 10⁶ PFU dozunda İİV (PRV-Becker) öldürücü suşu kullanılmıştır. Bu doz, tüm aşılanmış hayvanların 82 saat post-inoülzyon (hpi) klinik semptomlar gösterdisağlamak için önceki bir ön deneyde optimize edilmiştir.
   2. Buz üzerinde virüs inoculum tutun ve kullanmadan önce yavaşça karıştırın.
2. Abraded pad (topikal uygulama) üzerine virüs inoculum (8 x 10⁶ PFU) bir 20 μL damlacık ekleyin. Sahte aşıları (sadece orta) paralel olarak gerçekleştirin.
3. Virüsün adsorpsiyonuna yardımcı olmak için 10 x'i iğnenin şaftına hafifçe sürtün. İğne ucu ile çizilmekaçının. Bu adımı her 10 dakikada bir tekrarlayın.
4. Abraded ayak takımı kuruyana kadar fareyi 30 dk anestezi altında tutun.
5. Anesteziyi durdurduktan sonra fareyi sternal recumbency'yi koruyana kadar izleyin ve klinik takip ve örnekleme için ayrı bir kafese yerleştirin.

3. Fare diseksiyonu ve doku toplama

1. Enfeksiyon dan sonra uygun zamanlarda, fareyi boğulma yöntemi (CO₂) ile ötenaziedin.
   NOT: Bu çalışmada, PRV-Becker enfekte fareler için insancıl uç nokta (hayvanlar terminal belirtileri göstermeye başladığınızda) 82 hpi olduğunu. Ötenazi kontrol hayvanları paralel olarak.
2. İğneler/iğneler kullanarak fare nin ventral tarafını cerrahi bir paspasın üzerine yerleştirin. Farenin uzuvlarını iğnelerle cerrahi bir köpük tahtasına sabitle. Kürk kontaminasyonunu en aza indirmek için farenin ventral tarafını %70 etanol ile ıslayın.
3. Forceps kullanarak kürk ve cilt dış tabaka çimdik ve üretral açılış yakınındaki ince makas kullanarak küçük bir başlangıç kesi yapmak.
   1. Bu açıklıktan çeneye kadar orta ventral taraftaki kesite devam edin.
   2. Ön ekstremitelerin ve arka ekstremitelerin ekstremitelerine doğru iki lateral kesi uzatın.
   3. Altta yatan kas tabakasından cildi ayırın ve yan aşağı pin.
   4. Karın boşluğuaçın ve toraks tabanına kadar eğim. İki transversal kesi yaparak karın boşluğunun açılmasını tamamlayın.
   5. Her iki yan tarafta diyafram ve kaburga keserek torasik boşluğu açın.
      NOT: Göğüs kafesinin kenarlarının kesilmesi kalbi kesme riskini önler.
   6. Kalp, akciğerler, dalak, pankreas, karaciğer, böbrekler ve mesane gibi açık organları 1,5 mL mikrotüpler de toplayın. Tüpleri buzda tut.
   7. Topuk ve yürüyüş pedleri arasında abraded footpad kesin ve adım 3.3.6 açıklandığı gibi bir tüp doku parçası yerleştirin.
4. Fare nin yan tarafını yukarı yerleştirin ve kürkü %70 etanolile ısla. Vertebral sütun ortaya çıkarmak için deri tabakası nı kesin.
   1. Pelvis bölgesinde küçük bir kesi yapın. Arka bacaklardan baş doğru deri şerit.
   2. Bacakları ve kolları, her iki taraftaki omurilik kolonuna paralel ve yakın bir makasla keserek çıkarın.
   3. Kafatasının tabanında (C1-C2 seviyesi) kafa kes.
   4. Foramen magnumdan frontal kemiğe kadar olan makasla kafatasını kesin.
   5. Kafatasını forceps kullanarak yanal yönlerde çekin.
   6. Yavaşça forceps kullanarak beyin dışarı kepçe ve adım 3.3.6 açıklandığı gibi devam edin.
5. Kavisli makas kullanarak kas, yağ ve yumuşak dokuları keserek omurilik temizleyin. Kuyruğunu kes. Bozulmamış omurgayı steril buz gibi fosfat tamponlu salin (PBS) içeren 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Omurilik ve DRG daha fazla diseksiyon kadar buz tüpleri tutun.

4. Omurilik ve DRG ekstraksiyonu

NOT: Fare diseksiyonundan hemen sonra vertebra kolonundan omurilik ve DRG alın. Omurilik ve DRG ekstraksiyon için protokol bir önceki yayın dan uyarlanmıştır⁷.

1. Buz gibi PBS tüpünden vertebra kolonunu çıkarın ve soğutmadan sonra daha kolay hale gelen kalan yumuşak dokuları çıkarın.
2. Bir jilet kullanarak omurlar (T1, L1 ve S2 seviyeleri) aracılığıyla sütunda üç enine kesim yapın. Üç parçayı steril buz gibi PBS içeren 15 mm'lik Petri kabına yerleştirin. Daha sonraki çözümlemeiçin segmentlerin kökenini takip edin ve işaretleyin.
3. Bir segment alın ve forceps arasında güvenli, sırt tarafı yukarı bakacak şekilde. Bir jilet kullanarak orta hattan tek bir uzunlamasına keserek sütunu iki eşit yarıya bölün.
4. Her iki yarıya da yeni steril buz gibi PBS içeren yeni bir Petri kabına yerleştirin. Sol ve sağ tarafları ayırt edebilmek için segmentin doğru yönünü sağlayın.
5. Bir diseksiyon mikroskop altında, yavaşça ince forceps kullanarak bir rostral için bir rostral her yarısından vertebra sütunundan omurilik soyma.
6. 500 μL steril buz gibi PBS içeren 1,5 mL mikrotüplerde her iki omurilik yarılarını toplayın. Tüpleri buzda tut.
7. Yavaşça DRG ortaya çıkarmak için omurilik bir tarafında diğer menenjler kaldırın.
8. Maruz kalan spinal sinir kavrayarak ayrı ayrı her DRG çıkarın ve omurilik yavaşça dışarı çekin. Toplanan DRG'yi buz gibi PBS içeren 15 mm'lik Petri kabına yerleştirin. Tüm ipsilateral ve kontralateral DRG'yi omurilik segmentinden ayrı olarak hasat edin ve adım 4.5'te açıklandığı gibi ilerleyin.
   NOT: DRG beyaz spinal sinir boyunca yuvarlak şeffaf bir yapı olarak görülebilir.
9. Diğer iki spinal kolon segmentini kullanarak 4.3-4.7 adımlarını 30-45 dk içinde tekrarlayın.
10. Tüm tüpleri 4 °C'de 3 dk yüksek hızda (17.900 x g)santrifüj edin.
11. Sıvı nitrojen de süpernatant ve flash-freeze tüpleri aspire. Daha fazla doku homojenizasyonu için tüpleri -80 °C'de saklayın.
12. Alternatif olarak, 4.9 adımdan sonra histopatolojik analizler ve/veya immünororeskans boyamaiçin temizlenmiş DRG ve diğer fare dokularını düzeltin ve kesitleyin.

5. Doku homojenizasyonu

1. Buz üzerinde dondurulmuş doku örnekleri içeren tüpleri eritin.
2. 100 mg doku tartın ve steril çelik boncuk ve 0,5 M EDTA (pH = 8,0), 1 M Tris-HCl (pH = 8,0), 5 M NaCl, %10 SDS içeren 2 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve kokteyl inhibitörü tabletleri proteaz edin.
3. 2 dk için 20 döngü/s'de homogenizer kullanarak oda sıcaklığında (RT) dokuları bozun, ardından 1 dk bekleme süresi, ardından 2 dk için 20 döngü/s.
4. Tüpü rt'de 10 dk yüksek hızda (17.900 x g)santrifüj edin.
5. Yeni bir tüpte süpernatant (500 μL) toplayın ve inflamatuar belirteçleri ve viral yükleri ölçmek için ELISA ve qPCR yapana kadar -20 °C'de saklayın.
   NOT: QPCR için, RNase içermeyen malzeme (yani, boncuk, tüp, vb) ile tüm örnekleri toplamak ve% 1 betamercaptoetanol içeren RNA lysis tampon ile dokuları bozabilir (Malzeme Tablosu).

6. Dondurulmuş DRG bölümlerinin hazırlanması ve immünofloresan boyanmesi

1. Doku işleme
   1. Parçalara dolanve temizlenmiş DRG'yi %1 paraformaldehit (PFA) ile 2 saat BOYUNCA RT'de sabitleyin.
   2. PBS'de %10 sakaroz ile 15 mL'lik bir tüpe doku aktarın. Gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
   3. PBS'de %20 sakaroz ile 15 mL'lik bir tüpe doku aktarın. Gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
   4. PBS%30 sakaroz ile 15 mL tüp içine doku aktarın. Gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
   5. Bir kriyomold kullanarak OCT dokular gömmek ve hızlı dondurma için kuru buz blokları yerleştirin.
   6. Numuneleri kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.
2. Kriyoding hazırlığı
   1. -80 °C'den donmuş bloğu çıkarın ve 30 dakika boyunca kriyostat oda sıcaklığında dengelemesine izin verin.
   2. 15 μm kalınlığında DRG cryosection ve slaytlar üzerine bölümleri monte.
   3. Slayta monte edilmiş dokunun etrafına hidrofobik bir daire çizmek için bir kalem kullanın.
   4. Slaytları 4 °C'de boyama ya da boyama kadar tutun.
3. İmmünofloresan boyama
   1. DRG bölümlerini 3x PBS'de 10 dakika boyunca RT'de yıkayın.
   2. 37 °C'de 1 saat boyunca istenilen primer antikor (örneğin, PRV glikoprotein B'ye karşı fare antikoru) ile 100 μL'lik kesitleri kuluçkaya yatırın. % 10 negatif keçi serumu içeren PBS primer antikor seyreltin.
   3. Adımı 6.3.1'i tekrarlayın.
   4. 37 °C'de 50 dakika boyunca istenilen ikincil antikor (keçi anti-fare Alexa Fluor 488) 100 μL ile bölümleri kuluçkaya yatırın. Sadece PBS'de sekonder antikor seyreltin.
   5. Bölüme PBS'de seyreltilmiş 100 μL DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindole) boya ekleyin. Daha fazla kuluçka numunesi 37 °C'de 10 dk.
   6. Adımı 6.3.1'i tekrarlayın.
   7. Örnekleri floresan montaj ortamı nı kullanarak cam kaydıraklarüzerine monte edin ve kapak lı olarak emniyete alayın ve örtün.

7. Parafin gömülü doku kesitlerinin hazırlanması ve H&E boyandırı

1. 4 °C'de 24 saat boyunca %10 formalin ile dokuyu düzeltin.
2. Parafin katıştırma ve sabit dokuların kesiti için standart işlem çizelgesi ni gerçekleştirin. Transfer sabit dokular 70% etanol ve süreç yükseltilmiş alkoller ile ksilen ve parafin takip, daha önce açıklandığı gibi⁸.
   NOT: Kasetlerin içinde DRG gibi küçük doku örneklerini saklamak için polyester süngerkullanın.
3. Standart deparafinizasyon yapın ve ardından doku kesitlerinin H&E boyantisyonu, daha önce açıklandığı gibi⁹.

Sonuçlar

Fare ayak takımı aşılama modeli in vivo alfaherpesvirus enfeksiyonunun immünopatogenezinin karakterizasyonuna olanak sağlar, buna inolanmış ayak lıktan sinir sistemine enfeksiyonun replikasyonu ve yayılması ve spesifik nöroinflamatuar yanıtların indüksiyonu da dahil olmak üzere.

Bu çalışmada, ilk olarak fare arka ayak takımı aşılanmış ve ya mock-aşılanmış ya da PRV (PRV-Becker) öldürücü bir suşu ile aşılanmış aşılanmış. Aşınma yeri kontrol ayak takı...

Tartışmalar

Burada açıklanan ayak takımı aşılama modeli alfaherpesvirüs enfeksiyonu sırasında nöroinflamatuar yanıtların başlatılması ve gelişimini araştırmak için yararlıdır. Ayrıca, bu in vivo modeli çoğaltma kinetik kurmak ve PNS CNS alfaherpesvirus yayılması nı kurmak için kullanılır. Bu diğer aşılama modelleri için bir alternatif, yan deri aşılama modeli gibi, hangi derin dermal çizilme dayanır¹³, veya intrakranial rota, doğrudan CNS içine virüs tanıttı

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody anti-PRV gB	Made by the lab		1/500 dilution
Aqua-hold2 pap pen red	Fisher scientific	2886909
Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files)	Revlon
Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	11836170001
C57BL/6 mice (5-7 weeks)	The Jackson Laboratories
DAPI solution (1mg/ml)	Fisher scientific	62248	1/1000 dilution
Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm	Sigma-Aldrich	P5731500
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Hyclone, GE Healthcare life Sciences	SH30022
Dulbecco's Phophate Buffer Saline (PBS) solution	Hyclone, GE Healthcare life Sciences	SH30028
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone, GE Healthcare life Sciences	SH30088
Fine curved scissors stainless steel	FST	14095-11
Fluoromount-G mounting media	Fisher scientific	0100-01
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
Isothesia Isoflurane	Henry Schein	NDC 11695-6776-2
Microcentrifuge tube 2ml	Denville Scientific	1000945
Microtube 1.5ml	SARSTEDT	72692005
Negative goat serum	Vector	S-1000
Penicillin/Streptomycin	Gibco	154022
Precision Glide needle 18G	BD	305196
Razor blades steel back	Personna	9412071
RNA lysis buffer (RLT)	Qiagen	79216
Stainless Steel Beads, 5 mm	Qiagen	69989
Superfrost/plus microscopic slides	Fisher scientific	12-550-15
Tissue lyser LT	Qiagen	69980
Tissue-Tek OCT	Sakura	4583
488 (goat anti-mouse)	Life Technologies	A11029	1/2000 dilution