Zebrabalığında Fonksiyonel Floresan Silika Nano partikülleri ile Ksenogreftli İnsan Kanser Hücrelerinin Vivo Hedeflemesinde

Özet

Burada açıklanan vivo insan kanser hücrelerini hedef işlevsel nano tanecikleri yeteneğini incelemek için zebra balığı embriyoları kullanmak için bir yöntemdir. Bu yöntem, büyük hayvanlarda ve klinik çalışmalarda gelecekteki testler için optimal nano partiküllerin değerlendirilmesi ve seçilmesi için izin verir.

Özet

Kanser hücrelerini tespit etme, hedefleme ve yok etme yeteneğine sahip nano partiküllerin geliştirilmesi nanotıp alanında büyük ilgi görüyor. In vivo hayvan modelleri biyomedikal uygulama için nanoteknoloji köprü için gereklidir. Fare preklinik test için geleneksel hayvan modeli temsil eder; ancak, fareler tutmak için nispeten pahalı ve her anneden sınırlı döl nedeniyle uzun deneysel döngüleri var. Zebra balığı kanser araştırmaları da dahil olmak üzere gelişimsel ve biyomedikal araştırmalar için güçlü bir model sistemi olarak ortaya çıkmıştır. Özellikle, optik şeffaflık ve hızlı gelişimi nedeniyle, zebra balığı embriyoları iyi kanser hücrelerinin davranışı ve mikro çevre ile etkileşimleri gerçek zamanlı in vivo izleme için uygundur. Bu yöntem, şeffaf Casper zebra balığı embriyolarında insan kanser hücrelerini ve fonksiyonel nano partiküllerini sırayla tanıtmak ve kanser hücrelerinin gerçek zamanlı olarak nano partiküller tarafından in vivo tanıma ve hedeflemesini izlemek için geliştirilmiştir. Bu optimize edilmiş protokol, folat grupları ile işlevsel hale getirilmiş floresan etiketli nano taneciklerin, farklı bir florokrom ile etiketlenmiş metastatik insan servikal epitel kanseri hücrelerini özellikle tanıyıp hedefleyebildiğini göstermektedir. Tanıma ve hedefleme işlemi test edilen nano partiküllerin 30 dk sonrası enjeksiyonu kadar erken bir sürede gerçekleşebilir. Tüm deney sadece yetişkin balık birkaç çift üreme gerektirir ve tamamlamak için 4 günden az sürer. Ayrıca, zebra balığı embriyoları fonksiyonel bir adaptif bağışıklık sistemi eksikliği, insan kanser hücrelerinin geniş bir yelpazede engraftment izin. Bu nedenle, burada açıklanan protokolün yararı insan kanser hücrelerinin çeşitli nano tanecikleri test sağlar, memeliler ve klinikte gelecekteki test için her özel kanser bağlamında optimal nano tanecikleri seçimi kolaylaştıran.

Giriş

Kanser hücrelerini tespit etme, hedefleme ve yok etme yeteneğine sahip nano partiküllerin geliştirilmesi hem fizikçiler hem de biyomedikal araştırmacılar için büyük ilgi çekicidir. Nanotıp ortaya çıkması çeşitli nano tanecikleri gelişmesine yol açtı, bu ligands ve / veya kemoterapötik^ilaçlar1 hedefleme ile konjuge gibi^{1 ,2,3}. Nano partiküllerin eklenen özellikleri, biyolojik sistemle etkileşimlerini, biyolojik olayları yüksek verimlilik ve doğrulukla algılamalarını ve izlemelerini ve terapötik uygulamaları sağlarlar. Altın ve demir oksit nano partikülleri öncelikle bilgisayarlı tomografi ve manyetik rezonans görüntüleme uygulamalarında sırasıyla kullanılır. Altın ve demir oksit nano tanecikleri enzimatik faaliyetleri kolorimetrik tahliller yoluyla kanser hücrelerinin tespiti ne izin, floresan nano tanecikleri de in vivo görüntüleme uygulamaları için uygundur⁴. Bunlar arasında, ultraparlak floresan nano tanecikleri özellikle yararlıdır, daha az parçacıklar ve azaltılmış toksisite ile erken kanserleri tespit etme yetenekleri nedeniyle⁵.

Bu avantajlara rağmen nano partiküller uygun nanomalzemelerin seçimi ve sentez sürecinin optimizasyonu için in vivo hayvan modellerini kullanarak deney gerektirir. Ayrıca, tıpkı ilaçlar gibi, nano tanecikleri etkinliğini ve toksisite belirlemek için preklinik test için hayvan modelleri güveniyor. En yaygın olarak kullanılan preklinik model fare, olan bakım nispeten yüksek bir maliyetle gelen bir memeli. Kanser çalışmaları için, ya genetiği değiştirilmiş fareler veya ksenogreftli fareler genellikle^{kullanılır 6,7}. Bu deneylerin uzunluğu genellikle haftalar cakadar uzanır. Özellikle, kanser metastazı çalışmaları için, kanser hücreleri doğrudan kuyruk damarları ve dalak 8 gibi yerlerde farelerin dolaşım sistemine enjekte edilir^8,9,10. Bu modeller sadece tümör hücreleri ekstravaze ve uzak organları kolonize metastaz son aşamalarını temsil eder. Ayrıca, görünürlük sorunları nedeniyle, özellikle farelerde tümör hücrelerinin tümör hücre göçü ve nanopartikül hedefleme izlemek zordur.

Zebra balığı(Danio rerio)yüksek fecundity nedeniyle kanser araştırmaları için güçlü bir omurgalı sistemi haline gelmiştir, düşük maliyetli, hızlı gelişme, optik şeffaflık, ve genetik korumaları^11,12. Fare modeli üzerinde zebra balığı bir diğer avantajı balık yumurtaları ex utero döllenme, hangi embriyoların gelişimi boyunca izlenmesini sağlar. Embriyonik gelişim zebra balığında hızlıdır ve 24 saat sonrası döllenme (hpf) içinde omurgalı vücut düzlemi zaten^13. 72 hpf ile, yumurta koro yumurtadan, kızartma aşamasına embriyonik geçiş. Zebra balığının şeffaflığı, özellikle Casper suşu^14,kanser hücrelerinin göç ve tanıma ve canlı bir hayvan nano tanecikleri tarafından hedefleme görselleştirmek için eşsiz bir fırsat sağlar. Son olarak, zebra balığı doğuştan gelen bağışıklık sistemini geliştirmek 48 hpf, adaptif bağışıklık sistemi geride kalan ve sadece fonksiyonel hale ile 28 gün postfertilizasyon¹⁵. Bu zaman farkı, bağışıklık reddi yaşamadan zebra balığı embriyolarına insan kanser hücrelerinin çeşitli nakli için idealdir.

Burada açıklanan şeffaflık ve canlı floresan nano tanecikleri tarafından insan kanser hücrelerinin tanınması ve hedefolduğunu göstermek için zebra balığı hızlı gelişimi yararlanan bir yöntemdir. Bu araştırmada, kırmızı floresan proteini ifade etmek için genetik olarak tasarlanmış insan servikal kanser hücreleri (HeLa hücreleri) 48 hpf embriyonun perivitellin boşluğundaki vaskülar bölgeye enjekte edildi. 20-24 saat sonra, HeLa hücreleri zaten balık dolaşım sistemi yoluyla embriyolar boyunca yayılmıştı. Belirgin metastazı olan embriyolara, zengin kılcal yatağın bulunduğu gözün hemen arkasında ~0.5 nL'lik bir nanopartikül çözeltisi enjekte edildi. Bu tekniği kullanarak, ultraparlak floresan silika nano tanecikleri 20-30 dk enjeksiyon sonrası hızlı bir şekilde HeLa hücrelerini hedefleyebilir. Sadeliği ve etkinliği nedeniyle, zebra balığı belirli kanser hücrelerini hedef yetenekleri için nano tanecikleri çeşitli test etmek için sağlam bir in vivo modeli temsil eder.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri Boston Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından #PROTO201800543 protokolü altında onaylanmıştır.

1. Casper zebra balığı embriyolarının nesli

1. Şeffaf Casper zebra balığı embriyoları oluşturmak için doğal üreme için yaş en az 3 ay yetişkin Casper balık seçin.
2. Akşam iki odalı çiftleştirici tankları balık suyuyla doldurun, üst tankları bölücüler kullanarak ayırın, bir erkek balığı odanın bir tarafına, bir veya iki dişi balığı da odanın diğer tarafına yerleştirin ve balığı bir gecede bölücüler tarafından ayırın.
3. Ertesi sabah 8:00'de ışıklar açıkken bölücüleri dışarı çekin. Yapay zenginleştirme tesisleri ekleyin ve su sığ bir alan oluşturmak için biraz üst oda eğim. 3-4 saat için balık doğurmak için izin verin.
4. Balıkiçeren miyon tanklarının üst odalarını kaldırın ve orijinal tanklarına geri döndürün.
5. Bir örgü ağ üzerinden su dökerek alt odalarında bulunan yumurta toplamak. Yumurtaları steril petri kabına, her çan başına 200 yumurtadan fazla olmayan bir yoğunlukta aktarın. Herhangi bir ölü veya döllenmemiş yumurta çıkarın ve tatlı balık suyu ile çanak 2/ 3 dolu doldurun.
   NOT: Döllenmiş ve sağlıklı yumurtalar yarı saydam ve yuvarlak olmalıdır. Bulutlu, beyaz veya sakat olan tüm yumurtalar çıkarılmalıdır. Balık suyu, balık tesisindeki balık tanklarında elde edilir.
6. Bir gecede 28.5 °C'de kuvözdeki embriyoları kuluçkaya yatırın.
7. Bleach embriyolar ertesi sabah standart protokolü kullanarak Zebrafish Book¹⁶açıklandığı gibi , ve geri kuvöz (isteğe bağlı adım) embriyolar koymak.
8. Öğleden sonra 24 hpf embriyoyu kuvözden alın ve pronase kullanarak embriyoları dekoron.
   1. Petri kabındaki embriyolardan mümkün olduğunca çok balık suyu çıkarın ve kabına pronase çözeltisinden (balık suyunda 1 mg/mL) birkaç damla ekleyin. Petri kabını yavaşça döndürün. Bir kez korolar parçalanma belirtileri göstermek, pipet yukarı ve aşağı embriyolar embriyoları serbest bırakmak için koroları yıkmak için birkaç kez.
   2. Embriyoların çoğunluğu korolar dışında bir kez süreci sona erdirmek için Petri kabına hemen taze balık suyu ekleyin. Yüzen koroları kaldırmak için balık suyu kullanarak embriyoları 3 kat daha fazla durulayın. Embriyoları kuvöze geri ver.

2. Transplantasyon için insan kanser hücrelerinin hazırlanması

1. Kuluçka sıcaklığını tam olarak 35,5 °C'ye ayarlayın. Kuvöz içinde bir termometre kullanarak tutarlı ve istikrarlı bir sıcaklık sağlamak için kuvöz izleyin.
2. Otoklav 1 L balık suyu cam şişede. Agarose tamamen eriyene kadar 100 mL otoklav balık suyuna 3 g elektroforez dereceli agarose ekleyerek %3 agarose çözeltisi yapın.
   1. 3 / 4 dolu olana kadar bir Petri kabına sıcak agarose çözeltisi dökün. Mikroenjeksiyon kalıbını agarose'un üzerine yerleştirin. Kalıbın Petri kabının alt kısmıyla temas halinde olmadığından ve altında kabarcıklar oluşmadığından emin olun.
   2. Çözeltinin katılamasını bekleyin ve kalıbı plakadan dikkatlice çıkarın. Plakayı otoklavlı balık suyuyla doldurun ve plakayı 4 °C'de saklayın. HeLa hücrelerini hasat etmeden önce 35,5 °C'lik kuluçka makinesinde agarose plakasını ve balık suyunu önceden ısıtın.
3. Aşağıdaki ayarları kullanarak bir pipet çekmecesi üzerinde 1,0 mm O.D. x 0,78 mm borosilikat cam kılcal damarları çekin: 500 basınç, 560'ta ısı, 100'de çekme, 100'de hız ve 200'de zaman/gecikme. Bir etanol havlu ile silinmiş olan büyük bir Petri çanak macun üzerinde saklayın iğneler.
   DİkKAT: Çekilen iğneler çok keskin ve kırılgandır. İşlem yaparken dikkatli olun.
4. MS222'yi otoklavlı balık suyuna eriterek triain metansülfonat (MS222, 4 mg/mL) stok çözeltisi hazırlayın. Kullanmadan önce girdap. Sulandırın MS222 stok çözeltisi 1:100 balık suyunda (yani, 200 μL MS222 stok çözeltisi ekleyin 20 mL balık suyuna 40 μg/mL nihai konsantrasyona) aşağıdaki işlemler için embriyoları anestezik edin.
5. Kültür hLabel HeLa hücreleri PLenti6.2_miRFP670 lentivirus ile transducing protokol kullanılarak^{açıklanan 17}. Transplantasyondan önce RFP+ HeLa hücreleri 30 dk-1 saat.
   NOT: İnsan HeLa hücreleri 37 °C'de %5 CO₂ile desteklenerek tam büyüme ortamında %70'e kadar biraraya gelirken (%10 FBS ile DMEM orta) doku kültürü kuvözde kültürlenmiştir.
   1. Bir doku kültürü başlık aspirasyon tarafından HeLa hücre ortamı çıkarın. Kısaca serum tüm izlerini kaldırmak için steril PBS ile hücre tabakası durulayın.
   2. T-75 şişesine 3,0 mL steril Tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve enzimatik sindirimi kolaylaştırmak için hücreleri 37 °C doku kültürü kuluçka makinesine 3-5 dakika süreyle geri yerleştirin. Hücrelerin ~% 80 askıya alana kadar mikroskop altında şişe gözlemleyin.
   3. Şişeye 6-8 mL tam büyüme ortamı ekleyin. Hücreleri hafifçe boruhaline getirerek 15 mL steril bir tüpe toplayın. Santrifüj 135 x g 5 dk.
   4. Süpernatant aspire ve tam büyüme ortamı3 mL HeLa hücreleri resuspend. Yukarıdaki yıkama adım 2x tekrarlayın. Hücreleri tam büyüme ortamının 1 mL'sinde yeniden askıya alın ve hemositometre kullanarak mikroskop altındaki hücreleri sayın.
   5. Hücreleri tekrar aşağı döndürün, süpernatantı çıkarın ve 1,5 mL mikrosantrifüj tüpteki hücreleri 5 x 10⁷ hücre/mL konsantrasyonda yeniden askıya alın. Balık tesisine taşırken tüpü bir elinde tutarak hücreleri sıcak tutun.
      NOT: Embriyolara enjekte edilmeden önce veya sırasında hücreleri 35,5 °C'lik kuvözde saklayarak hücreleri her zaman sıcak tutun.

3. İnsan kanser hücrelerinin nakli

1. Transplantasyon dan önce etanol havlu (örneğin, makas, cımbız, plastik pipetler, jiletler) kullanarak çalışma alanını temizleyin.
2. Embriyoları agarose plakasının olukları içinde plastik bir pipet kullanarak hizalayın. Ön öne bakacak şekilde embriyoları yan tarafa yatırın.
   NOT: Balık suyunun embriyoları kapsadığından emin olun. Kanser hücrelerini enjekte etmemek ve kontrol olarak kullanmak için bazı embriyoları bir kenara koyun.
3. Hava kaynağını ve mikroenjektörü açın. Bir P200 ucu kullanarak hela hücrelerini kuvözden ve pipetten çıkarTın. 3 μL'lik hücre karışımını bir jel yükleme ucunu kesme ucu yla hemen bir iğneye yükleyin. Ucu dikkatlice iğnenin keskin alt ucuna doğru takın. Gerekirse, hücre karışımı keskin ucunu doldurmak için iğne aşağı hareket sağlamak için iğne sallayın.
   1. İğneyi iğne tutucuya takın. Dikkatle iğne ucu açık kırmak için cımbız bir çift kullanın. İğne ucunun içindeki tüm hava kabarcıklarını dışarı itmek için mikroenjektörün basıncını ve süresini ayarlayın. Enjeksiyon damlacıklarının boyutu ~1 nL olana kadar basıncı ve enjeksiyon süresini azaltın.
   2. Enjeksiyon plakasını mikroskop altında, embriyoların sarısı tarafının iğneye bakacak şekilde uygun bir konuma yerleştirin. Seyreltilmiş MS222 çözeltisinin beş damlasını (40 μg/mL) ekleyerek embriyoları uyuşdurun.
   3. Enjektörü yerleştirin ve iğnenin her embriyonun perivitellin boşluğuna dokunmasına izin verin.
4. Ayak pedalına basarak perivitelline boşluğunun altındaki vaskülarize bölgede embriyolara hücre karışımı enjekte edin.
5. Enjeksiyon plakasını bir sonraki embriyoya taşımak için baskın olmayan eli kullanın. Enjeksiyona devam etmek için ayak pedalına aynı anda basarken enjektörü uzatmak ve geri çekmek için baskın eli kullanın. Pipet enjekte edilmiş embriyolar üzerine steril balık suyu birkaç damla. Plakaüzerindeki tüm embriyoların enjeksiyonu tamamlandıktan sonra, embriyoları steril balık suyuyla yıkayın, steril bir Petri kabına koyun ve hemen 35,5 °C kuvöze taşıyın.
6. 3 saat sonra, enjekte edilen embriyoları inceleyin ve ölü olanları çıkarın.
7. Canlı embriyoları 35,5 °C'lik kuvöze geri verin ve HeLa hücrelerinin enjeksiyon bölgesinden vücudun diğer bölgelerine yayılmasını sağlamak için 20-24 saat kuluçkaya yatırın.
   NOT: Hücreler 28.5 °C'de iyi olmadığı için embriyolar 35.5 °C'de tutulur ve insan kanser hücrelerinin hayatta kalmasına ve göç etmesine izin verilir, balık embriyoları normalde kuluçkaya yatırılır.

4. Nano partiküllerin veya aracın enjeksiyonu

1. Ertesi sabah nakledilen embriyoları beş damla seyreltilmiş MS222 çözeltisi ile anestezi edin. Bu embriyolar öldürecek, çünkü çok fazla MS222 eklemeyin. Floresan mikroskop altında, rfp+ HeLa hücrelerinin kuyruk metastazı olan embriyoları dikkatlice toplayın ve steril balık suyu içeren yeni bir Petri kabına yerleştirin.
2. Aşağıdaki ayarları kullanarak bölüm 2'de açıklandığı gibi enjeksiyon iğneleri yapın: 500'de basınç, 645'te ısı, 60'ta çekme, 50'de hız ve 100'de zaman/gecikme.
3. Embriyoları hizalamak ve aracı (örn. H₂O) veya nanopartikül çözeltisini iğneye hizalamak için 3.1-3.3 adımlarında prosedürleri uygulayın.
4. Gözün arkasına 0.5 nL 1 mgL nanopartikül çözeltisi enjekte edin ve 3.5-3.6 adımlarında açıklandığı gibi enjeksiyona devam edin(Şekil 1B). Gözlerin arkasındaki bu konum kılcal damarlarla zenginleştirilmiştir, nano partiküllerin dolaşıma girmesini sağlar.
5. Benzer bir prosedürü takiben, nano partikülleri embriyolara uzaklaştırmak için kullanılan araca (örneğin, H₂O) HeLa hücreleri nakledilen ve (yani kontroller) olmayanlara enjekte edin (Şekil 1A, C).
6. Enjekte edilen tüm embriyoları 35.5 °C'de kuluçkaya yatırın.

5. Nano partiküllerin ve kanser hücrelerinin görüntülenmesi ve izlenmesi

1. 0, 30, 60, 90, 120, 180 ve 210 dk nano taneciklerin postenjeksiyon sonrası bir floresan mikroskop altında enjekte embriyolar inceleyin dolaşımda dağılımlarını ve kanser hücresi hedefleme derecesini izlemek için. Test edilen nanopartikül türüne bağlı olarak kanser hücrelerinin nano partiküller tarafından hedef alınması 30 dk enjeksiyon sonrası olarak görülebilir.
2. Pipet 2-3 embriyobir Petri kabına ve seyreltilmiş MS222 çözeltisi (40 μg/mL) beş damla ekleyerek onları hareketsiz hale getirin. Embriyolar yüzmeyi bıraktıktan sonra, embriyoların yanlarında yatmasını sağlamak için suyun çoğunu çıkarın.
3. Embriyoları hizalamak için ucuna bağlı ince, yumuşak bir fırça içeren bir pipet kullanın, böylece ön tarafları öne bakacak şekilde yanlarında uzanın ve sadece bir gözü görünür.
4. Tüm embriyoyu yakalamak ve kuyruk alanını yakalamak için daha yüksek büyütmede (6,4x) tekrarlamak için embriyoları düşük büyütmede (2 x) kırmızı, mavi ve parlak alan kanallarıyla görüntüleyin. Nano partiküllerin kanamasını önlemek için kırmızı kanalın altındaki embriyoya odaklanın.
   NOT: Embriyolar görüntüleme sırasında hareket etmemelidir. Herhangi bir hareket bulanık görüntülere ve farklı kanallardan gelen görüntülerin çakışamama larına yol açacaktır.
5. Görüntülemeden hemen sonra embriyolara taze balık suyu ekleyin ve kuvöze geri verin. Embriyoları farklı zaman noktalarında görmek için 5.2-5.4 adımlarını tekrarlayın.

Sonuçlar

Şekil 1'deki protokol şeması bu çalışmanın genel prosedürlerini göstermektedir. Şeffaf Casper erkek ve dişi yetişkin balıkembriyooluşturmak için yetiştirildi (bölüm 1). RFP+ HeLa hücreleri zebra balığı embriyolarının perivitellin boşluğu altında vaskülarize bölgeye 48 hpf'de enjekte edilmemiş embriyolar ile kontrol edildi (bölüm 3). Mikroenjeksiyon deneyimli bireyler için, embriyoların sağkalım oranı genellikle y?...

Tartışmalar

Burada açıklanan protokol, nano partiküllerin metastatik insan kanser hücrelerini tanıma ve hedefleme yeteneğini test etmek için in vivo bir sistem olarak zebra balığı kullanır. Çeşitli etkenler deneylerin başarılı bir şekilde yürütülmesini etkileyebilir. İlk olarak, embriyoların tam olarak 48 hpf geliştirilmiş olması gerekir. Embriyoların doğru gelişim evresi, insan kanser hücrelerinin nakline dayanmalarını ve hayatta kalmalarını sağlar. 48 hpf'den küçük embriyolar, daha yaşlı ve d...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	KSE scientific	BMK-A1705
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	1.0 mm O.D. x 0,78 mm
Computer and monitor	ThinkCentre	X000335
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)	Corning	10-013-CV	sold by Fisher
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F0926
Fish incubator	VWR	35960-056
Hemocytometer	Fishersci brand	02-671-51B
Magnetic stand	World Precision Instruments	M10
Microloader tip	Eppendorf	E5242956003	sold by Fisher
Micromanipulator	Applied Scientific Instrumentation	MMPI-3
Needle Puller	Sutter instruments	P-97
Olympus MVX-10 fluorescent microscope	Olympus	MVX-10
P200 tip	Fishersci brand	07-200-293
PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X)	Corning	21-030-CV	sold by Fisher
Petri dish	Corning	SB93102	sold by Fisher
Plastic pipette	Fishersci brand	50-998-100
pLenti6.2_miRFP670	Addgene	13726
Pneumatic pico pump	World Precision Instruments	SYSPV820
Pronase	Roche-Sigma-Fisher	50-100-3275	Roche product made by Sigma- sold by Fisher
Razor blade	Fishersci brand	12-640
SZ51 dissection microscope	Olympus	SZ51
Tricaine methanesulfonate	Western Chemicals	NC0872873	sold by Fisher
Trypsin-EDTA	Corning	MT25053CI	sold by Fisher
Tweezer	Fishersci brand	12-000-122