Mikro Bilgisayarlı Tomografi (Mikro-BT) Görüntüleme Yöntemi Ile Uzay Uçuşu Sonrası Küresel Oküler Yapının Değerlendirilmesi

Özet

Uzay uçuşunun oküler yapılarda hasara yol açıp açmadığını belirlemek için yüksek çözünürlüklü mikro bilgisayarlı tomografi görüntülemeyi kullanan bir protokol sayılmaktadır. Protokol ex vivo kemirgen oküler yapıların mikro-CT kaynaklı ölçüm gösterir. Oküler hasarı değerlendirmek için tahribatsız üç boyutlu bir teknik kullanarak uzay uçuşundan sonraki oküler morfolojik değişiklikleri değerlendirme yeteneğini gösteriyoruz.

Özet

Raporlar, bir uzay uçuşu ortamına uzun süre maruz kalmanın, Uluslararası Uzay İstasyonu (ISS) görevi sırasında ve sonrasında astronotlarda morfolojik ve fonksiyonel oftalmik değişikliklere yol açarak ortaya çıkan raporlar olduğunu göstermektedir. Ancak, bu uzay uçuşu kaynaklı değişikliklerin altında yatan mekanizmalar şu anda bilinmemektedir. Bu çalışmanın amacı, mikro-BT görüntüleme kullanılarak fare retinası, retina pigment epiteli (RPE), koroid ve sklera tabakasının kalınlığını değerlendirerek uzay uçuşu ortamının oküler yapılar üzerindeki etkisini belirlemekti. 10 haftalık C57BL/6 erkek fareler 35 günlük bir görev için UUİ'de bulundu ve doku analizi için canlı olarak Dünya'ya döndü. Karşılaştırma için, dünya üzerindeki yer kontrol (GC) fareler aynı çevre koşulları ve donanım muhafaza edildi. Oküler doku örnekleri, sıçramadan sonraki 38(±4) saat içinde mikro-BT analizi için toplandı. Retinanın kesitinin görüntüleri, RPE, koroid ve sabit gözün sklera tabakası mikro-CT görüntüleme alma yöntemi kullanılarak eksenel ve sagital görünümde kaydedildi. Mikro-BT analizi, uzay uçuşu örneklerinde retina, RPE ve koroid tabaka kalınlığının kesit alanlarının GC'ye göre değiştirilmelerini, uzay uçuşu örneklerinin kontrollere göre önemli ölçüde daha ince kesitler ve katmanlar gösterdiğini göstermiştir. Bu çalışmadan elde edilen bulgular, mikro-BT değerlendirmesinin oküler yapı değişikliklerini karakterize etmek için hassas ve güvenilir bir yöntem olduğunu göstermektedir. Bu sonuçların çevresel stresin küresel oküler yapılar üzerindeki etkisinin anlaşılmasını iyileştirmesi beklenmektedir.

Giriş

Uzay uçuşunun mikroyerçekimi ortamında, sıvı kaymasının neden olduğu artmış intrakranial basınç (ICP) uzay uçuşuyla ilişkili nöro-oküler sendrom (SANS)^{1,,2,,3,4,5'e}katkıda bulunmuş olabilir. Nitekim, astronotların% 40 üzerinde sırasında ve uluslararası bir Uzay İstasyonu (ISS) misyonu⁶sonra SANS deneyimli, NASA Twins^Study7 uzay uçuşu konu da dahil olmak üzere . SANS mevcut patofizyolojisi optik disk ödemi gibi fizyolojik değişiklikler içerir, küre düzleştirici, koroidal ve retina kıvrımları, hiperopik kırılma hata kaymaları, ve sinir lifi tabakası infarktları (yani, pamuk yün lekeleri) ve iyi belgelenmiştir^5,8. Ancak, değişikliklerin ve hasarın gelişmesine katkıda bulunan faktörlerin altında yatan mekanizmalar belirsizdir. SANS'i daha iyi anlamak için, retinal yapı ve fonksiyondaki uzay uçuşuyla ilişkili değişiklikleri karakterize etmek için hayvan modelleri mevcuttur.

Aynı hayvanlar üzerinde yapılan bir önceki araştırmada, 35 günlük uzay uçuşunun fare retinası üzerindeki etkisini rapor ettik. Sonuçlar, uzay uçuşunun retina ve retina lösi damarlarında önemli hasara yol açtığıve hücre ölümü, inflamasyon ve metabolik stresle ilişkili bazı proteinlerin/yolların uzay uçuşu sonrasında önemli ölçüde değiştiğini açıklığa^kavuşturur.

Şu anda, hastalık gelişimi ve ilerlemesini izlemek için kurulmuş noninvaziv görüntüleme teknikleri çeşitli yanı sıra çeşitli çevresel stres, aynı zamanda yaygın olarak küçük kemirgen modellerinde kullanılan fizyolojik tepkiler vardır. Bu tekniklerden biri, anatomik yapıları ve patolojik süreçleri değerlendiren ve fareler¹⁰kadar küçük organizmalar üzerinde başarıyla kullanılan mikro-BT'dir.

Mikro-BT mikroboyutlu bir çözünürlük elde edebilirsiniz, ve uygun kontrast madde 10 eklenmesi ile yumuşak dokuların hacimsel analizi için yüksek kontrast sağlayabilir^{10,11,12,13,14}. Mikro-BT teknolojisi, numunelerin geometrik profilindeki fiziksel hasarı en aza indirdiği ve yapılar arasındaki mekansal ilişkiyi değiştirmediği için brüt anatomi, ışık mikroskobu ve histoloji incelemesi gibi geleneksel yöntemlere göre avantajlıdır. Buna ek olarak, yapıların üç boyutlu (3D) modelleri mikro-CT görüntüleri^12,,14yeniden inşa edilebilir. Bugüne kadar, uzay ortamına maruz kaldıktan sonra görme bozukluğu gösteren kanıtlara rağmen, retinal yapı ve fonksiyon uzay uçuşu ile ilişkili değişikliklerin daha iyi anlaşılması için hayvan modellerinde az sayıda veri mevcuttur. Mevcut çalışmada, fareler uulalı 35 günlük bir görev için iss gemiye retina, RPE ve koroid katmanları mikro-CT kullanarak mikroyapı ölçülerek oküler doku yapıları üzerinde uzay ortamının etkisini belirlemek için uçakla edildi.

Protokol

Çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nda özetlenen önerileri takip etti ve Loma Linda Üniversitesi (LLU) ve Ulusal Havacılık ve Uzay İdaresi 'nin (NASA) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Bu uçuş deneyi ile ilgili daha ayrıntılı bilgi başka bir yerde bulunabilir^9,15.

1. Uçuş ve kontrol koşulları

NOT: Ağustos 2017'de SpaceX tarafından 35 günlük bir görev için 12.

1. SpaceX'in Dragon kapsülü ile Dünya'ya dönmeden önce, fareler NASA'nın Kemirgen Habitats (RH) 26-28 °C ortam sıcaklığında 35 gün boyunca uçuş boyunca 12 saatlik ışık / karanlık döngüsü ile iss içinde yaşamak var.
2. Yer Kontrol (GC) farelerini uçuşta kullanılan aynı muhafaza donanımına yerleştirin ve telemetri verilerine dayanarak sıcaklık ve karbondioksit (CO₂₎seviyeleri gibi çevresel parametreleri mümkün olduğunca yakın eşleştirin.
3. Yem GC fareler uzay tabanlı meslektaşları olarak aynı NASA gıda bar diyet. Hem uzay uçuşu hem de GC farelere su ve gıdaya aynı reklam libitum erişimi sağlayın.

2. Farelerin uçuş sonrası değerlendirilmesi

1. Dünya'ya düştükten 28 saat sonra fareleri Loma Linda Üniversitesi'ne (LLU) taşıyın. Bir kez orada, hayvan muhafaza donanım fareler i çıkarın ve hayatta kalma ve sağlık için değerlendirmek.
   NOT: Gözlem üzerine, teftiş personeli tüm farelerin 35 günlük uzay görevinden sağ kurtulduğunu ve iyi durumda olduklarını, yani fark edilir bir eksiklik/anormallik olmadığını bildirdi.

3. Uzay uçuşundan sonra fare gözlerinin kesilmesi ve korunması

1. 38(±4) saat içinde (n=20/grup), fareleri %100 CO_2'de ötenazi yedirin ve gözlerini toplayın.
2. Sağ göz retinalarını inceleyin ve steril cryovials yerleştirin, sıvı nitrojen snap-freeze, ve kullanımdan önce −80 °C'de tutun.
3. Fosfat tamponlu salin (PBS) 24 saat için% 4 paraformaldehit tüm sol gözleri düzeltmek ve daha sonra mikro-CT tahliller için fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulayın.

4. Mikro-BT taraması için numune hazırlama

1. Fiksasyondan sonra farelerin gözlerini etanolde susuz kalın. Sabit numunenin daha fazla veya ani büzülmesini önlemek için, dereceli bir etanol çözeltisi serisi kullanın: 1 saat boyunca %50 etanol ile başlayıp etanol çözeltilerinin konsantrasyonlarını 1 saat boyunca artırın: 70, 80, 90, 96 ve %100.
   NOT: Farelerin gözleri bir başlık odasında ele alınmalıdır.
2. Fosfathomolybdic asit (PMA) boyama
   DİkKAT: PMA'nın aşındırıcı, kanserojen ve organlar için toksik olması nedeniyle, duman başlığı kullanımı da dahil olmak üzere uygun koruyucu kişisel ekipman gereklidir.
   1. Boyama çözeltisini hazırlayın: 100 mL mutlak etanolde 10 mg PMA.
   2. 6 gün boyunca farelerin gözlerini lekele (10 wt. % fosfathomolybdic asit - PMA mutlak etanoliçinde çözünmüş)
   3. Taramadan önce, göz örneklerini önce mutlak etanolle yıkayın ve ardından her gözü %100 mutlak etanolle doldurulmuş tek tek 2 mL plastik kaplara yerleştirin. Tama sırasında stabilize numunelere pamukped ekleyin.

5. Mikro-BT tarama ve analiz

NOT: SkyScan 1272 tarayıcı, bir masaüstü X-Ray Micro-CT sistemi, farelerin gözlerindeki retina hasarının değerlendirilmesi için kullanıldı

1. Yumuşak doku örneğini uygun bir numune tutucuya monte edin. X-ışını BT ölçümleri sırasında herhangi bir hareketi önlemek için, numunenin tutucuya sıkıca oturmasını sağlayın(Şekil 1).
2. Her numunenin titiz bir şekilde hizalanması üzerine, numuneyi x-ışınları ile ayrı ayrı taz.riyi takın.
   1. Yazılımı açtıktan sonra, örneği çerçeveye ortaleyin. Protokolde, hiçbir filtre kullanmayın ve pikseli 4 μm'de artırmak için matrisi ayarlayın. Örnek merkezini çerçevede tutmak için mikro konumlandırmayı kullanın.
   2. Bundan sonra, kontrast aracısını en üst düzeye çıkarmak için parametreyi denetleyin. Kalibrasyonu gerçekleştirmek için numuneyi çıkarın ve düz alan düzeltmesinin %80'den büyük olup olmadığını kontrol edin.
   3. Kalibrasyondan sonra, numuneyi tarama odasına yeniden yerleştirin. Tarama için 0,400'lük bir dönüş adımı, ortalama 4 çerçeve, 30 rasgele hareket kullanın ve örnekleri 180° döndürün.
3. Tekrarlanan ölçümler için bir konumlandırma jig kullanın. Açıklandığı gibi gerçekleştirilen faz kontrastı geliştirmesi sayesinde, 50 keV ve 80 mA'da kapalı mikro odaklı x-ışın tüpü (tungsten anodu) tarafından üretilen x ışınlarından 4 μm'ye kadar küçük nesne ayrıntıları tespit edilebilir.
   NOT: En yüksek görüntü kalitesine sahip genel bt taramaları üretmek için seçim için bu bölümde belirtilen edinme parametreleri.
4. Taramadan sonra, verileri yeniden oluşturmak için yazılımı (örneğin, NRecon) kullanın.
   1. Histogramı ayarlayın ve tüm numuneler için aynı aralığı (0 - 0,24) kullanın. İlgi alanı yeniden oluşturma bir daire ydi ve ölçekler veya etiketler kullanılmadı.
   2. Tarama sırasında yapıları azaltmak için, 20'lik ışın sertleştirme düzeltmesi, 1'in düzgünleştirme düzeltmesi, 6'lık bir halka artifakı azaltma sıyrıkve yanlış hizalama telafisinde değişiklik yapmamasını sağlamak için. Yeniden yapılandıktan sonra, numunenin ilgi alanı içinde olduğu doğrulandı.
   3. Görüntülerin optik sinir ve gözlerin mercek lerine paralel bir düzlem kullanarak yeniden konumlandırın.
5. Taramadan sonra, yeniden oluşturulan görüntüleri her üç görünümde de görselleştirmek için yazılımı (örn. DataViewer) kullanın.
   NOT: Gerekirse, bu yazılım ile, görüntüleri standart bir analiz yapmak için göz optik sinir ve lens paralel bir düzlem kullanılarak yeniden konumlandırılmış olabilir.
6. Açıklayıcı analiz
   1. Yazılımdaki bir ölçüm aracını kullanarak yapıları ölçün (örneğin, CTAn). Analiz için ilgi bölgesini sınırlamak için optik sinirkullanın. Hesaplama, protokol ölçümleri gerçekleştirmek için orta dilim kullanılır. Bu değerlendirme tanımlayıcı analiz(Şekil 2 ve Şekil 3)ile gerçekleştirilmiştir.
   2. Sagittal(Şekil 2)ve eksenel görünümde retina, retina pigment epiteli (RPE), koroid ve sklera tabakası ölçümleri yapın (Şekil 3). Ortalamayı hesaplamak için her yapının üç ölçümünü alın.

Sonuçlar

Yukarıdaki protokolü uyguladıktan sonra retina, RPE, koroid ve sklera tabakasının ortalama kalınlığı mikro-BT taramaları kullanılarak kaydedildi (Şekil 1). Bu teknik, gözlerin üç farklı görünümde çok düzlemsel rekonstrüksiyonu gösterdi. Analiz sırasında gözlemci, numunenin tam ortasındaki analizi standartlaştırmak için tüm numunede ilerleyebildi.

Mikro-BT analizi, lineer ölçümlerin yapıldığı sagital ve eksenel görünümde(Şekil 2 ve Şekil 3)gözlerin kesit alanlarını gösterdi. RPE ve koroid tabakası GC grubuna kıyasla uzay uçuşu grubunda anlamlı veya trend daha düşüktü(Şekil 3).

Şekil 1: Yumuşak dokunun mikro-BT prosedürü. (A) Yumuşak doku örneği (fare gözü). (B) Örnekler fosfat tampon çözeltisinde (PBS) %4 formaldehit olarak sabitlendi. Fiksasyondan sonra farelerin gözleri etanolle susuz kaldı. Sabit numunenin daha fazla ve ani bir büzülmesini önlemek için, 1 saat için %50 etanol ve listelenen konsantrasyonlarda aşağıdaki etanol çözeltileri ile başlayan dereceli etanolik çözeltiler serisi 1 saat kullanıldı: 70, 80, 90, 96 ve %100. (C) Farelerin gözleri fosfathomolybdic asit (PMA) 6 gün boyunca boyandı, mutlak etanol le yıkandı ve daha sonra mutlak etanol dolu bireysel 2 mL plastik kaplara yerleştirildi. (D) Fare gözlerindeki retina luzunu değerlendirmek için bir masaüstü X-ışını mikro-CT sistem tarayıcısı kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Bir yer kontrol faresinin sagittal görünümü. Görüntünün sağ tarafındaki gözün katmanları yukarıdan aşağıya, retinadan (0,077 mm), retina pigment tabakasından (RPE, 0,038 mm), koroid (0,041 mm), sklera (0,059 mm) olarak açıklamalı olarak açıklanır. Bu rakam Overbey ve ark.¹⁵alınmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Yer kontrol faresinin eksenel görünümü. Görüntünün sağ tarafındaki gözün katmanları yukarıdan aşağıya, retinadan (0,144 mm), retina pigment tabakasından (RPE, 0,051 mm), koroid (0,041 mm), sklera (0,073 mm) olarak açıklamalı olarak açıklanır. Bu rakam Overbey ve ark.¹⁵alınmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Retina tabakasının ortalama kalınlığı, RPE tabakası ve uzay uçuşu ve kontrol gruplarında mikro-BT ile ölçülen koroid tabakası. Sayımlar grup başına beş retina da ortalaması ydı. Değerler standart hata (SEM) ± ortalama kalınlık olarak temsil edildi. Ortalamanın SEM'si hata çubuklarıyla işaretlenir. Uzay uçuşu (FLT) grubunda yer kontrol (GC) grubuna göre kesit kalınlığı anlamlı olarak daha düşük '*' (p < 0.05) olarak belirtilir. Bu rakam Overbey ve ark.¹⁵alınmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

Bu çalışmanın sonuçları, özellikle retina, RPE ve gözün koroid tabakaları başta olmak üzere GC gruplarına kıyasla mikro-CT tekniğini kullanarak uzay uçuşu fare gözünde yapısal değişiklikler olduğunu göstermiştir. Mikro-BT manipülasyon gerek kalmadan değişiklikleri karakterize etmek için etkili ve tahribatsız bir teknik sağlar. PMA boyama kullanımı, yeniden yapılanma sonrası net 3D tomografik görüntüleri başarılı bir şekilde elde etmek için mikro-CT görüntülerin kalitesini artırdı ve numunenin yapısını fiziksel olarak değiştirme ihtiyacını önceden belirtti. Bu görüntülerin bir yararı da, tüm ilgi alanının dijital olarak görüntülenmesi ve bu nedenle bulguların tekrarlanabilirliğinin yanı sıra erişilebilirliği de artırmasıdır. Bu çalışma sırasında üretilen mikro-CT görüntüleri sayesinde, hedeflenen örnek her tabakanın kalınlığının belirlenmesi için retina, RPE, koroid ve sklera tabakası gibi birden fazla yapının farklılaşmasını gösterdi.

Protokol içinde kritik bir adım, örneklerin boyutları ve dokuları nedeniyle manipülasyonudur. Numunenin işlenmesi, hazırlık sırasında numuneye baskı yapılmadan dikkatle yapılmalıdır. Mikro-BT bazı sınırlamalar vardır: çözünürlük ve parametreler için standart değerlerin eksikliği. Tarama sırasında, farklı mikro-CT tarayıcılar farklı görüntü işleme algoritmaları olabilir; henüz bir gri tonlama için kalibrasyon herhangi bir sorunun üstesinden gelmek için takip edilebilir. Taramadan sonra, görüntülerin rekonstrüksiyonu doku ve yapılacak analizdayalı olmalıdır. Görüntü kalitesi tomografik sisteme, ayarlara, numune boyutuna ve hazırlama yöntemlerine bağlı olduğundan kritik olabilir^16,17.

Çeşitli normal ve patolojik doku türlerinin incelenmesinde başarılı olması nedeniyle, diğer analizler için hacimsel verilerin derlenmesi için gelecekteki araştırmalarda mikro-BT görüntüleme yetenekleri kullanılmalıdır. Bu nedenle, bu çalışmanın amacına dayanarak, iki boyutlu ölçümler kullanmak kabul edilebilir, ancak brüt 3D yapının segmentasyonu da tüm numunenin kesin bir anahat sağlamak için yararlı olabilir. Tahribatsız bir tekniğin tüm avantajlarına rağmen, mikro-BT immünohistokimya gibi diğer yöntemlerin yerini almaz, ancak istenirse sonraki histoloji analizlerini tamamlar ve sağlar.

Uzun bir uzay uçuşu durumu sırasında ve sans olarak tanımlanan uzay görevi sonrasında astronotlar yapısal ve fonksiyonel oküler değişiklikler bir dizi üretir. Bulgular hiperopik vardiya, küre düzleştirici, koroidal / retina lifleri ve pamuk yün^{lekeleri 19}içerir. Bu hayvan mikro-BT çalışmasında astronotların optik koherens tomografisinin (OKT) retinal sinir lif tabakasının kalınlaşma, retina ve koroidal tabakaincelmesi bulgusu belgelenmiştir. Bu sonuçlar beklenmedikti. Bu tutarsızlık kafa karıştırıcı faktörlerden kaynaklanabilir. Farelerin insana göre sınırlı sefaload sıvı değişimi var. Bu sıvı değişimi eksikliği yerçekimsel değişikliklere farklı tepkiler uyandırmış olabilir. İkinci olarak, fareler sıçramadan sonra 38 saat içinde kesildi, ve yeniden adaptasyon için akut bir yanıt da retina ve koroid morfolojik değişikliklere katkıda bulunabilir. Bu olasılığın teyidi, uzay uçuşu sırasında ve görevden sonra uzun vadede daha fazla ölçüm gerektirir.

Bu çalışmanın sonuçları, uzay uçuş koşullarının, özellikle yerçekimsel değişikliklerin, gözde akut ve kısa süreli bir tepkiye yol açabileceğini göstermektedir. Oküler üzerindeki akut değişikliklerin retina fonksiyonu ve uzay uçuşuna bağlı yapı değişiklikleri mekanizması üzerindeki sonuçlarını belirlemek için daha fazla araştırma yapılması gerekmektedir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 wt. % phosphomolybdic	Sigma	12026-57-2
Ethanol absolute by Baker Analyzed	VWR	80252500
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Merck	L1825
X-ray micro-CT system SkyScan 1272 scanner	Bruker