Hücre altı kompartmana özgü Redoksduyarlı Yeşil Floresan Protein kullanılarak Hücresel Oksidasyonun Değerlendirilmesi

Özet

Bu protokol hücre içinde hücre altı bölmesi özgü redoks durumunun değerlendirilmesi açıklanır. Redoksduyarlı floresan prob bozulmamış hücrelerde uygun oranmetrik analiz sağlar.

Özet

Hücre içi oksidasyon/redüksiyon dengesinin ölçülmesi, bir organizmanın fizyolojik ve/veya patofizyolojik redoks durumuna genel bir bakış sağlar. Tiyoller, azaltılmış dithiol ve okside disülfür oranları ile hücrelerin redoks durumunu aydınlatmak için özellikle önemlidir. Tasarlanmış sistein içeren floresan proteinler redoksduyarlı biyosensörler için yeni bir dönem açar. Bunlardan biri olan redoksduyarlı yeşil floresan protein (roGFP), adenoviral transdüksiyonlu hücrelere kolayca girilebilir ve hücre altı bölmelerin redoks durumunun hücresel süreçleri bozmadan değerlendirilmesine olanak sağlar. RoGFP azaltılmış sistein ve oksitlenmiş sistinler sırasıyla 488 nm ve 405 nm, emisyon ile 525 nm uyarma maxima var. Bu indirgenmiş ve oksitlenmiş formların oranlarının değerlendirilmesi hücre içinde redoks dengesinin uygun hesaplanmasına olanak sağlar. Bu yöntemde canlı hücre içindeki redoks durumunu değerlendirmek için ölümsüzleştirilmiş insan üçlü negatif meme kanseri hücreleri (MDA-MB-231) kullanılmıştır. Protokol adımları sitosolik roGFP ifade etmek için adenovirüs ile MDA-MB-231 hücre hattı transdüksiyon, H₂O₂ile tedavi ve hem akış sitometri ve floresan mikroskopi ile sistein ve sistin oranının değerlendirilmesi içerir.

Giriş

Oksidatif stres 1985 yılında Helmut Sies tarafından "eski lehine prooksidant-antioksidan dengesi nde bir bozukluk" olarak tanımlanmıştır¹, ve araştırma bir bolluk organizmaların hastalık elde etmek için yapılmıştır-, beslenme-, ve organizmaların yaşlanmaya özgü redoks durumu^1,2,3. O zamandan beri, oksidatif stres anlayışı geniş hale gelmiştir. Hastalıklara ve/veya yaşlanmaya karşı antioksidan kullanma hipotezlerinin test edilmesi oksidatif stresin sadece zarar vermekle kalmamış, aynı zamanda hücrelerde başka rolleri de olduğunu göstermiştir. Ayrıca, bilim adamları serbest radikallerin sinyal iletimi için önemli bir rol oynadığını göstermiştir². Tüm bu çalışmalar makromoleküllerin redüksiyon-oksidasyon (redoks) oranındaki değişikliklerin belirlenmesinin önemini güçlendirmiştir. Enzim aktivitesi, antioksidanlar ve/veya oksidanlar ve oksidasyon ürünleri çeşitli yöntemlerle değerlendirilebilir. Bunlar arasında, thiol oksidasyonunu belirleyen yöntemler tartışmasız en çok kullanılan lar dır çünkü hücrelerdeki antioksidanlar ve prooksidantlar arasındaki dengeyi ve^{organizmaları}4 . Özellikle glutatyon (GSH)/glutatyon disülfür (GSSG) ve/veya sistein (CyS)/sistin (CySS) arasındaki oranlar organizmaların redoks durumunu izlemek için biyobelirteç olarak kullanılmaktadır².

Prooksidantlar ve antioksidanlar arasındaki dengeyi dengelemek için kullanılan yöntemler esas olarak hücrelerdeki azaltılmış/oksitlenmiş proteinlerin veya küçük moleküllerin seviyelerine dayanır. Batı lekeleri ve kütle spektrometresi, azaltılmış/okside makromoleküllerin (protein, lipidler vb.) oranlarını genel olarak değerlendirmek için kullanılır ve GSH/GSSG oranları spektrofotometri ile değerlendirilebilir⁵. Bu yöntemlerin ortak bir özelliği, hücre lisisi ve/veya doku homojenizasyonu ile sistemin fiziksel tedirginliğidir. Bu analizler, farklı hücresel bölmelerin oksidasyon durumunu ölçmek gerektiğinde de zorlaşır. Tüm bu tedirginlikler, adak ortamında eserlere neden olur.

Redoks duyarlı floresan proteinler hücrelerde bir rahatsızlık neden olmadan redoks dengesini değerlendirmek için avantajlı bir dönem açtı⁶. Hücre içi bölmeleri hedefleyerek, hücre içi aktivitelerin ölçülmesine izin verebilirler (örneğin, mitokondri ve sitosolun redoks durumunu atayarak) hücresel organeller arasındaki çapraz konuşmayı araştırmak için. Sarı floresan protein (YFP), yeşil floresan protein (GFP) ve HyPeR proteinleri Meyer ve meslektaşları tarafından gözden geçirilir⁶. Bu proteinler arasında, redoks duyarlı GFP (roGFP) onun CyS farklı floresan okumalar nedeniyle benzersizdir (ör. 488 nm / em. 525 nm) ve CySS (ör. 405 nm/525 nm) kalıntılar, hangi oranmetrik analiz izin, Y^7FPgibi diğer redoks duyarlı proteinlerin aksine^,8. Oranmetrik çıktı, ifade düzeyleri, algılama hassasiyetleri ve fotobeyaztma⁸arasındaki farkları dengelediği için değerlidir. Hücrelerin hücre altı bölmeleri (sitosol, mitokondri, çekirdek) veya farklı organizmalar (bakteri yanı sıra memeli hücreleri) roGFP^{değiştirerek}hedef olabilir 7^,9,10.

roGFP tahlilleri, özellikle gerçek zamanlı görselleştirme deneyleri için floresan görüntüleme teknikleri kullanılarak gerçekleştirilmektedir. RoGFO'ların akış sitometrik analizleri, önceden belirlenmiş zaman noktalarına sahip deneyler için de mümkündür. Bu makalede, adenoviral transdüksiyon yoluyla roGFP (sitosol hedefli) aşırı ifade memeli hücrelerinde redoks durumunun ratiometrik bir değerlendirme yapmak için floresan mikroskopi ve akış sitometri sitometri kullanımı hem de açıklanmaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

NOT: Bu protokol %70-80 eşzamanlı MDA-MB-231 hücreleri için optimize edildi. Diğer hücre hatları için, hücre sayısı ve enfeksiyon çokluğu (MOI) yeniden optimize edilmelidir.

1. Hücrelerin hazırlanması (gün 1)

1. MDA-MB-231 hücre hattını 75 cm² şişede, 10 mL'lik Dulbecco modifiye Kartal ortamı (DMEM) ile %10 fetal büyükbaş serum (FBS) ile %5 CO₂ nemli bir atmosferde 37 °C'de muhafaza edin.
   NOT: Tüm protokol boyunca tüm ek ve tedavi kuluçkaları için %10 FBS, 37 °C ve %5 CO₂ nemlendirilmiş atmosfer ile desteklenen DMEM kullanılmaktadır.
2. Deney için MDA-MB-231 hücrelerini hazırlayın.
   1. Şişeiçindeki ortamı aspire edin, 2 mL 2 mL ile hücreleri 2 dk için %0,25 tripsin-EDTA çözeltisi ile ayırın ve 6 mL tam orta (DMEM% 10 FBS) ile tripsin aktivitesini inaktive edin. Hücreleri 150 x g'de 5 dk. Süpernatant'ı aspire edin ve 5 mL tam ortamda hücreleri askıya alın.
   2. Eşit hacimli hücre süspansiyonu ve %0,4 trypan mavisini karıştırın. Bu karışımın 10 μL alın ve otomatik hücre sayacı ile hücreleri saymak.
      NOT: Hücre sayımı için bir Coulter sayacı veya hemositometre de kullanılabilir.
   3. Akış sitometri analizleri için hücreleri 6 kuyuplakasına tohumlayın ve 1 mL'lik 150.000 hücreyi kuyu başına orta tohumlayın. Hücre eki için 16 saat bekleyin.
   4. Hücreleri floresan görüntüleme için 4 kuyuluk slaytIçine tohum ve tohum 25,000 hücreleri 0.5 mL orta başına kuyu başına. Hücre eki için 16 saat bekleyin.
      NOT: Tohum kontrol kuyuları tedavi kuyularına ek olarak. Hücre numarasını belirlemek için kontrol kuyularından birini kullanın (isteğe bağlı: hücrelerin bağlanma süresi iki katına kadar kısaysa, hücre numarasının tohumlama yoğunluğuyla aynı olduğu varsayılabilir) ve diğeri de virüssüz kontrol (0 MOI) için.

2. Adenoviral roGFP transdüksiyonu (gün 2 ve 3)

DİkKAT: Adenovirüsler hastalıklara neden olabilir. Hücreleri transducing ederken, filtrelenmiş ipuçları kullanın ve dekontamine ipuçları, Pasteur pipetler, ve mikrosantrifüj tüpleri ile 10% çamaşır suyu.

NOT: Bu protokol sitosol spesifik roGFP ile gösterilmiştir, ancak diğer hücresel bölmeler (örneğin, mitokondri veya mitokondriyal intermembran uzay) aynı protokol ile hedeflenebilir.

1. MDA-MB-231 hücre hattı için her MOI değeri için gerekli adenovirüs (mL) hacmini hesaplayarak EN yüksek transdüksiyon verimliliğini elde etmek için MOI için bir doz-yanıt eğrisi oluşturma(Tablo 1):
   
   NOT: ML başına plak şekillendirme ünitesi (PFU) olarak ifade edilen adenoviral stoğun her bir partisinin fonksiyonel titreti şirket tarafından sağlanmaktadır. Transdüksiyon için optimum MOI hücre tipleri arasında farklılık gösterir. Çoğu memeli hücresi için optimum MOI aralığı 10 ile 300 arasındadır. Hücresel yanıta göre, MOI değerleri yeniden hesaplanmalıdır (örneğin, hücrelerde sitotoksik yanıt varsa MOI aralığı azaltılmalıdır veya hücreler düşük transdüksiyon verilicisi varsa aralık artırılmalıdır).
2. Güvenilir pipetleme için hücre kültürü ortamı (%10 FBS ile DMEM) ile 6 x 10¹⁰ PFU/mL adenoviral roGFP çözeltisinin 1:100 seyreltilmesini yapın.
3. Pipet ve 0.0125 mL (12.5 μL), 0.025 mL (25 μL), 0.05 mL (50 μL) adenoviral roGFP seyreltme eklemek amacıyla 50, 100 ve 200 MOI sırasıyla 50, 100 ve 200 MOI ile 100 MOI ile 150.000 hücreleri transduce için 6 kuyu nun her kuyusu ( sitome analizi için).
4. Pipet ve 4 odalı slayt kuyularında 0.0042 mL (4.2 μL) adenoviral roGFP seyreltme ekleyin floresan görüntüleme için 100 MOI ile 25.000 hücre transduce(Tablo 1).
   NOT: Adenoviral roGFP yapısı ve hücreleri arasında en yüksek etkileşimi sağlamak için kuyularda en az miktarda ortam kullanılmalıdır. Yüksek serum düzeyleri bazı hücre tiplerinde transdüksiyon verimliliğini olumsuz etkileyebileceğinden, kültür ortamının serum içeriğinin farklı hücre hatları için azalması gerekebilir.
5. Hücre bakım koşulları altında 16-24 saat boyunca hücreleri kuluçkaya yatırın. Ertesi gün (gün 3), hücre kültür ortamına (DMEM % 10 FBS ile) değiştirilerek hücre kurtarmasına izin verin 24 saat. hücreler morfolojik değişiklikler olsa bile roGFP ifade edebilir.
   NOT: 3. günde hücreler roGFP'yi ifade etmeye başlamalıdır; bu nedenle transdüksiyon verimliliği floresan mikroskobu (ex. 488/em. 525 filtreleri) kullanılarak izlenebilir. Tutarlı tahkikat sonuçları elde etmek için faz kontrast mikroskobu altındaki morfolojik değişikliklerin farkında olun ve belgeleyin ve transdüksiyon verimliliğini değerlendirirken morfolojiyi gözlemleyin.
6. Adım 2.3'te hazırlanan 50, 100 ve 200 MOI numunesini ve bunların akış sitometri analizinden elde edilen transdüksiyon verimliliği sonuçlarını (adım 3.1 ve 4.1) kullanarak bir doz yanıt eğrisi oluşturun. Morfolojik değişikliklerin (adım 2.5) ve MOI'nin doz-yanıt eğrisinin belgelenmesi yle optimal transdüksiyon verimliliğini değerlendirin.
   NOT: Hücre popülasyonunun %98'inden fazlası 100 MOI ve 200 MOI ekspres roGFP'de (temsili sonuçlara bakınız) rağmen, 200 MOI grubu MDA-MB-231 hücrelerinin hücre morfolojisinde önemli değişiklikler göstermiştir. Sonuç olarak, MDA-MB-231 hücreleri için en etkili MOI 100 MOI olarak belirlendi.
7. Optimal MOI (burada, 100 MOI) MDA-MB-231 hücre hattı için seçildikten sonra, test malzemeleri (10 μM H₂O₂ ve aracı %0,1 deiyonize su) ile deneme yapın.
   1. Hücreleri bölüm 1'e göre hazırlayın ve tohumlayın. Adım 2.1'de hesaplanan 100 MOI için adenoviral transdüksiyon hacmini kullanarak, 100 MOI adenoviral hücrelerin eteksüldüksiyonu için 2.2−2.4 adımlarını tekrarlayın. Daha sonra 2.5.

3. CyS/CySS bakiyesinin elde edilmesi

1. Akış sitometrisi (gün 4)
   1. 4. günde, 2.7.1 adımdan 10 μM H₂O₂ ile 1 saat boyunca hücreleri kuluçkaya yatırın.
      NOT: Bu protokolde test maddesi olarak 10 μM H₂O_2, araç arıtma olarak %0.1 deiyonize su kullanılmıştır. Diğer oksitleyici ajanlar burada pozitif kontroller olarak kullanılabilir.
   2. 6 kuyu plakasından aspire ortamı, %0,25 tripsin-EDTA çözeltisi ile 750 μL değiştirin ve hücrelerin ayrılması için 2 dakika bekleyin. 2 mL tam orta (DMEM % 10 FBS) ile tripsinin inaktive ve 15 mL konik tüpler halinde hacim toplamak.
   3. Tüpleri 150 x g'de 4ºC'de 5 dk santrifüj edin. Süpernatant atın ve fosfat tamponlu salin (PBS) 500 μL hücreleri askıya.
   4. Adımı 3.1.3'ün tekrarla
   5. 40 μm mesh kullanarak hücre süspansiyonlarını akış sitometrisi uyumlu tüplere süzün. Tüpleri buzda ve ışıktan uzak tutun ve veri analizi için adım 4.1'i izleyin.
2. Mikroskobik görüntüleme (4. gün)
   1. 4. günde, 10 μM H₂O₂ile hücreleri tedavi edin, hemen (zaman noktası 0) ve 1 saat tedaviden sonra görüntüleri elde edin ve veri analizi için adım 4.2 izleyin.

4. Veri analizi

1. Akış sitometri nicelleştirme
   1. Hücre boyutunu ve hücrelerin karmaşıklığını değerlendirmek için x ekseninde ve yan dağılımda (SSC) ileri dağılım (FCS) (FCS) (CSC) ve örnek edinme yazılımı ile 3 farklı analiz için akış sitometriyöntemini ayarlayın (SSC ölü ve canlı hücrelerin kabaca tanımlanması için kullanılabilir); Table of Materials ör. 488 nm/em. 525 nm (floresan izotiyoyanat [FITC]) x ekseninde bandpass filtresi ve CyS-roGFP değerlendirmek için y ekseninde SSC; ör. 405 nm/em. 525 nm (Brilliant Violet 510 [BV510]) x ekseninde bandpass filtresi ve CySS-roGFP değerlendirmek için y ekseninde SSC.
   2. Örnek alma yazılımı yla 0 MOI denetimi edinin ve hücreleri görselleştirin. Kalan numuneler için bu adımı tekrarlayın (50, 100, 200 MOI grubu ve daha sonra 10 μM H₂O₂ tedavi edilen hücreler ve araç tedavi hücreleri). Dosyaları veri analizine kaydedin.
   3. Veri analizi yazılımını açın (bkz. Malzemeler Tablosu)ve 0 MOI örnek dosyayı açın. İlgi alan hücre popülasyonunun değerlendirilmesi (Kapı 1). Ex. 488 nm/em için arka plan floresansını en aza indirmek için aşağıdaki gating'leri ayarlayın. 525 nm (Kapı 2) ve ex. 405 nm/em. 525 nm (Gate 3) bantgeçiş filtreleri ile enfekte olmayan (0 MOI) kontrol hücreleri.
   4. Doz-yanıt eğrisini değerlendirmek için veri analizi yazılımı içinde 50, 100 ve 200 MOI örnek dosyaaçın. Her örnek için Gates 2 ve 3 ile ortalama floresan yoğunluklarını analiz edin. Test örnekleri (10 μM H₂O₂ tedavi hücreleri ve araç tedavi hücreleri) için bu adımı tekrarlayın.
   5. Aşağıdaki denklemile roGFP'nin oksitlenmiş ve azaltılmış formları arasındaki ortalama floresan yoğunluk oranını hesaplayın.

2. Görüntü değerlendirmesi
   1. CyS-roGFP ve CySS-roGFP için floresan filtreler içeren bir mikroskop kullanın (örn. 488 nm/em. 525 nm ve ör. 405 nm/em. 525 nm filtreleri.
   2. Oda slayt her kuyuda, daha büyük alanları görselleştirmek için 4x hedefi kullanarak, görüntüleri elde etmek için 4 rasgele alanları seçin.
      NOT: Görüntü görüntüler için 20x objektif de kullanılabilir.
   3. ImageJ yazılımı¹¹ile görüntüyü açın. Analiz Uygula | Her görüntü için komutları ölçün ve verileri ölçmek için adım 4.1.5'teki denklemi kullanın.
      NOT: Görüntülerin nicelikseloranı oranmetriktir; bu nedenle, protokol arka plan çıkarma içermez. Ancak, görüntüleri karşılaştırabilmek için her görüntü için parlaklık, kontrast ve doygunluk aynı olmalıdır. İstatistiksel anlamlılık varyans (ANOVA) ve Tukey sonrası hoc testinin tek yönlü analizi ile değerlendirildi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

CyS/CySS'nin redoks durumu transdükse roGFPs ile kolayca tetkik edilir. Floresan prob, azaltılmış ve oksitlenmiş formlar arasındaki oranı ölçer (uyarma dalga boyları sırasıyla 488 nm ve 405 nm). Floresan verileri hem akış sitometrisi hem de mikroskopi ile elde edilebilir.

Çok sayıda hücre sürekli ve uygun akış sitometri sitometri kullanılarak elde edilebilir. Analiz 3 ana adımdan oluşur: 1) FSC alan filtresi ile ilgi hücre popülasyonu seçin (Şeki...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bir organizmadaki tiyol/disülfür dengesi hücrelerin redoks durumunu yansıtır. Yaşayan organizmalar glutatyon var, sistein, protein tiyolleri, ve düşük molekül ağırlıklı tiyoller, hepsi oksidasyon düzeyi etkilenir ve hücrelerin redoks durumunu yankı⁴. Mühendislik roGFPs kendi CyS^artıkları7 ile tiol / disülfür dengesinin non-yıkıcı nicel izin verir. roGFP'nin oranmetrik özelliği memeli hücreleri için güvenilir redoks ölçümleri sağlar. roGFP t...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco by Life Sciences	25200-056	Cell culture
4-well chamber slide	Thermo Scientific	154526	Cell seeding material for fluorescent imaging
5 ml tubes with cell strainer cap	Falcon	352235	Single cell suspension tube for flow cytometry analysis
6-well plate	Corning	353046	Cell seeding material for flow cytometry analysis
15 ml conical tubes	MidSci	C15B	Cell culture
75 cm2 ventilated cap tissue culture flasks	Corning	4306414	Cell culture
Adenoviral cytosol specific roGFP	ViraQuest	VQAd roGFP	roGFP construct kindly provided by Dr. Schumaker
Class II, Type A2 Safety Hood Cabinet	Thermo Scientific	1300 Series A2	Cell culture
Countess automated cell counter	Invitrogen	C10227	Cell counting
Countess cell counter chamber slides	Invitrogen	C10283	Cell counting
DMEM	Gibco by Life Sciences	11995-065	Cell culture
FBS	Atlanta Biologicals	S11150	Cell culture
Filtered pipette tips, sterile, 20 µl	Fisherbrand	02-717-161	Cell culture
Filtered pipette tips, sterile, 1000 µl	Fisherbrand	02-717-166	Cell culture
Flow Cytometer	BD Biosciences	LSRFortessa	Instrument equipped with FITC and BV510 bandpass filters for flow cytometry analyses
Fluorescent Microscope	Advanced Microscopy Group (AMG)	Evos FL	Fluorescent imaging
Hydrogen Peroxide 30%	Fisher Scientific	H325-100	Positive control
Light Cube, Custom	Life Sciences	CUB0037	Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 405 nm)
Light Cube, GFP	Thermo Scientific	AMEP4651	Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 488 nm)
MDA-MB-231	American Tissue Culture Collection	HTB-26	Human epithelial breast cancer cell line
Microcentrifuge tubes, 2 ml	Grenier Bio-One	623201	Cell culture
PBS	Gibco by Life Sciences	10010-023	Cell culture
Pipet controller	Drummond	Hood Mate Model 360	Cell culture
Serologycal pipet, 1 ml	Fisherbrand	13-678-11B	Cell culture
Serologycal pipet, 5 ml	Fisherbrand	13-678-11D	Cell culture
Serologycal pipet, 10 ml	Fisherbrand	13-678-11E	Cell culture
Tissue Culture Incubator	Thermo Scientific	HERACell 150i	CO2 incubator for cell culture
Trypan blue stain 0.4%	Invitrogen	T10282	Cell counting