Olgun Böbrek Podositlerinin Kimyasal Olarak Tanımlanmış Koşullar Altında İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Rehberli Farklılaşması

Özet

Burada sunulan, insan böbrek podositlerinin yüksek verimli (%>90) ve genetik manipülasyonlardan veya alt popülasyon seçiminden bağımsız olarak indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden türetülmesi için kimyasal olarak tanımlanmış bir protokoldür. Bu protokol 26 gün içinde istenen hücre tipini üretir ve nefrotoksisite testi ve hastalık modellemesi için yararlı olabilir.

Özet

Böbrek hastalığı küresel nüfusun % 10'undan fazlasını etkiler ve federal harcamalarda milyarlarca dolara mal olur. Böbrek hastalığının en şiddetli formları ve nihai son aşama böbrek yetmezliği, genellikle endotel hücreleri ve böbreğin filtrasyon bariyerini oluşturmak için glomerüler bodrum zarı ile birlikte çalışan son derece uzmanlaşmış epitel hücreleri olan glomerüler podositlerin hasar görmesinden kaynaklanır. Böbrek tıbbındaki gelişmeler, birincil dokuların sınırlı mevcudiyeti ve podositler gibi fonksiyonel insan böbrek hücrelerinin türemesi için sağlam yöntemlerin bulunmaması nedeniyle engellenmiştir. Kök hücreler gibi yenilenebilir kaynaklardan podosit türetme yeteneği, insan böbrek gelişimi ve hastalığının mekanizmalarının mevcut olarak anlaşılmasına yardımcı olabileceği gibi terapötik keşif için yeni araçlar sağlayabilir. Bu protokolün amacı, insan kaynaklı pluripotent sap (hiPS) hücrelerinden yüksek verimlilik ve özgüllükle ve kimyasal olarak tanımlanmış koşullar altında olgun, post-mitotik podositler elde etmek için bir yöntem geliştirmekti. Bu yöntemle üretilen hiPS hücre türevi podositler, soyuna özgü belirteçleri (nefrin, podokin ve Wilm Tümörü 1 dahil) ifade eder ve olgun ve fonksiyonel podositlerle ilişkili özel morfolojik özellikleri (birincil ve ikincil ayak süreçleri dahil) sergiler. İlginç bir şekilde, bu özel özellikler, alanda yaygın olarak kullanılan ölümsüzleştirilmiş podosit hücre hattında özellikle yoktur, bu da burada açıklanan protokolün, tipik olarak insan böbrek biyolojisini incelemek için kullanılan mevcut podosit hücre çizgilerinden gelişimsel olarak daha olgun bir fenotipe sahip insan böbrek podositleri ürettiğini göstermektedir.

Giriş

İnsan pluripotent kök hücre kültüründeki gelişmeler, araştırmacılara insan vücudundaki hemen hemen her hücre tipini elde etmek için tasarlanmış yenilenebilir, ölçeklenebilir bir biyolojik malzeme kaynağı sağlayarak rejeneratif tıp, hastalık modelleme ve ilaç taramasında devrim yapmaya^{hazırdır 1}. Bu strateji, özellikle elde edilmesi zor olan özel ve işlevsel hücre türlerini türetmek için yararlıdır. İnsan kaynaklı pluripotent stem (hiPS) hücreleri^2,3,4,5, somatik hücre kökenleri ve kişiselleştirilmiş tıp için temsil ettikleri potansiyel nedeniyle özellikle çekicidir. Bununla birlikte, hiPS hücrelerinden diğer hücre soylarını türetmek için yöntemler geliştirmek, düşük verimliliğe ve spesifik olmayan heterojen hücre popülasyonlarının üretilmesine yol açan kötü tanımlanmış kültür koşullarının sık kullanımı nedeniyle zor olmaya devam etmektedir^6,7.

Burada sunulan, kimyasal olarak tanımlanmış koşullar altında spesifiklik ve yüksek verimlilik ile hiPS hücrelerinden olgun böbrek podositlerinin türetilme yöntemidir. Hücresel mikroçevrim içindeki birden fazla faktörün rolleri göz önünde bulundurularak, hücre kültürü ortamında sunulan çözünür faktörlerin yanı sıra hücre dışı matris bileşenleri veya yapışkan substratlar gibi çözünmeyen faktörlerin optimizasyonunu içeren bir kök hücre farklılaşma stratejisi geliştirilmiştir. Podosit gelişiminde ve fonksiyonunda integrin sinyalinin önemi göz önüne alındığında, hücre yüzeyindeki integrin reseptörlerinin ekspresyolü ilk başta incelenmiştir. β1 integrinleri sadece hiPS hücrelerinde değil, mezoderm ve ara mezoderm hücreleri⁸, 9^,10dahil olmak üzere türevlerinde de yüksek oranda ifade edildi. Sonraki deneyler, β1 integrinlerine bağlanan ligandların (laminin 511 veya laminin 511-E8 parçası dahil) aşağıda açıklanan çözünür endüktif ortamla birlikte kullanıldığında hiPS hücrelerinin yapışmasını ve podositlere farklılaştırılmasını desteklediğini doğruladı.

Hücre soyu taahhüdünün indüksiyonu, ilk olarak Activin A, CHIR99021 ve Y27632 Kaya inhibitörü içeren bir ortamın varlığında iki gün boyunca laminin kaplı yüzeylerde kültürlenen hiPS hücrelerinin erken mezoderm belirteçlerini ifade eden hücrelere farklılaşabileceğini doğrulayarak başlatıldı HAND1, kazkötü ve brachyury^8,11. Mezoderm hücrelerinin kemik morfogenetik protein 7 (BMP-7) ve CHIR99021 ile desteklenmiş bir ortamla 14 gün boyunca tedavisi, nefi ifade eden ara mezoderm hücrelerinin türetilmesini sağladı kron-progenitör hücre belirteçleri Wilm's Tumor 1 (WT1), tek atlanan ilişkili protein 1 (OSR1)^8,11ve eşleştirilmiş kutu gen 2 proteini (PAX2)¹². Olgun böbrek glomerüler podositleri türetmek için, ara mezoderm hücreleri BMP-7, Activin A, vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF),all-trans retinoik asit ve CHIR99021'den oluşan yeni bir ortamla 4-5 gün boyunca tedavi edildi. Akış sitometrisi ve immünostaining, elde edilen hücrelerin% > 90'ının olgun böbrek podosit 8 , 11^,13'ünmoleküler, morfolojik ve fonksiyonel özelliklerini sergilediğini doğrulamak için kullanılmıştır. Bu özellikler birincil ve ikincil ayak süreçlerinin gelişimini içerir; SYNPO, PODXL, MAF, EFNB2⁸ dahil olmak üzere podosit soyuna özgü genlerin ekspresyolü ve podocin, nefrin ve WT1^{14, 15,16}gibi proteinlerin ekspresyolü. Ek olarak, hiPS hücre türevi podositlerin, aşağı akış deneylerinin zamanlamasında ek bir esneklik sağlayan ticari olarak mevcut bir orta^8,11 kullanılarak dört haftaya kadar in vitro olarak kültürde tutulabileceği bulunmuştur. HiPS-podositlerin saflığını belirlemek için kullanılan akış sitometri panelleri hakkında daha fazla bilgi için lütfen önceki yayınımıza bakın¹¹.

Protokol

1. Reaktiflerin hazırlanması

1. 1x hiPS CCM çözeltisi elde etmek için hiPS hücre kültürü bazal ortamında çözülen 5x hiPS hücre kültürü ortamı (CCM) takviyesini seyreltin.
   NOT: Dondurulmuş 5x hiPS CCM takviyesi, bir gecede ideal olarak 4 °C'de yavaş bir çözülme işlemi gerektirir. 1x hiPS CCM'nin aliquots'u -20 °C'de 6 aya kadar saklanabilir.
2. HiPS hücre kültürü için bodrum membran (BM) matrisi 1 kaplamalı plakaların hazırlanması: BM matrisi 1'i 4 °C'de buz üzerinde bir gecede çözün. Çözdükten sonra, üretici tarafından önerilen uygun seyreltme faktörlerine sahip aliquots hazırlayın.
   NOT: Tipik olarak, aliquots, 50 mL konik bir tüpte 25 mL soğuk DMEM / F12'de sonraki seyreltme için hazırlanır ve ardından BM matrisi 1'i tamamen çözmek ve artık kristallerin oluşumunu önlemek için kapsamlı karıştırma.
3. BM matris 1 çözeltisinin 1 mL'lik kısmını 6 kuyu plakasının her kuyusuna aktarın ve parafin filmine sarılmış 1-2 saat boyunca 37 °C'de veya en az 24 saat boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın. BM matrisi 1 kaplamalı plakalar 2 haftaya kadar 4 °C'de saklanabilir.
4. Bodrum membran (BM) matrisi 2 hazırlanması - kaplamalı plakalar: 5 μg / mL'lik son bir konsantrasyon hazırlamak için 9 mL steril damıtılmış suda uygun miktarda BM matrisi 2'yi seyreltin. 12 kuyu plakasının her kuyusuna 700 μL BM matris 2 çözeltisi ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında 2 saat veya gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya bırakın.
5. BMP7, Activin A ve VEGF'nin her biri için 100 μg/mL stok çözümlerini aşağıdaki gibi hazırlayın: BMP7'yi %0,1 (wt/vol) BSA içeren steril damıtılmış suda yeniden inşa edin ve %0,1 (wt/vol) BSA içeren steril PBS'de Activin A ve VEGF'yi ayrı ayrı yeniden inşa edin. Sık donma-çözülme döngülerini önlemek için, her stok çözeltisinden 100 μL aliquots hazırlayın ve 6 aya kadar -20 ° C'de saklayın.
6. 10 mg Y27632'yi 3.079 mL steril damıtılmış suda eriterek 10 mM'lik bir Y27632 stok çözeltisi hazırlayın. Stoktan Aliquot 100 μL ve 6 aya kadar -20 °C'de saklayın.
7. 30 mM stok çözeltisi hazırlamak için 2 mg CHIR99021'i 143,4 μL steril DMSO'da çözün. 5 μL aliquots hazırlayın ve -20 °C'de 1 aya kadar (veya üreticinin tavsiyesine göre) saklayın.
8. 3.33 mL steril DMSO'da 10 mgall-trans retinoik asit çözün. 500 μL aliquot hazırlayın ve -20 °C'de 6 aya kadar saklayın.

2. Kültür medyasının hazırlanması

1. 100 ng/mL Activin A, 3 μM CHIR99021, 10 μM Y27632 ve 1x B27 serumsuz takviyenin glutamin takviyesi ile uygun bir DMEM/12 hacminde nihai konsantrasyonuna karşılık gelen stok çözümlerini yeniden oluşturan mezoderm farklılaşma ortamını hazırlayın.
   NOT: Mezoderm farklılaşma ortamı, farklılaşma adımlarından önce ve deneyin ölçeğine uygun bir hacimde taze olarak hazırlanmalıdır (tipik olarak, iki 12 kuyu plakası için 50 mL ortam yeterlidir).
2. DMEM/F12'de 100 ng/mL BMP7, 3 μM CHIR99021 ve 1x B27 serumsuz takviyeye karşılık gelen stok çözümlerini glutamin takviyesi ile yeniden oluşturan ara mezoderm farklılaşma ortamını hazırlayın.
   NOT: Gerekirse, ortam% 1 (vol/vol) Penisilin-Streptomisiin ile desteklenebilir. Glutamin takviyesi ile DMEM/F12 kullanarak ortamın hacmini ayarlayın. Bu ortam büyük gruplar halinde hazırlanabilir; bununla birlikte, tekrarlanan donma-çözülme döngülerini önlemek için daha küçük aliquotlarda (örneğin, 50 mL konik tüplerde 45 mL) saklanması önerilir. Bu ortam -20 °C'de 3 aya kadar saklanabilir ve kullanımdan önce bir gecede 4 °C'de çözülebilir.
3. Podosit indüksiyon ortamını son konsantrasyon 100 ng/mL BMP7'ye yeniden inşa larak hazırlayın, 100 ng/mL activin A, 50 ng/mL VEGF, 3 μM CHIR99021, 1x B27 serumsuz takviye ve glutamin takviyesi ile DMEM/F12'de 0.1 μM all-trans retinoik asit. Ortamı ışıktan koruyun (örneğin, kabı folyo kağıtla sararak).
   NOT: Bu ortam büyük gruplar halinde hazırlanabilir ve karanlıkta -20 °C'de 3 aya kadar saklanabilir. Dondurulmuş aliquots kullanılmadan önce 4 °C'de bir gecede çözülmelidir.
4. DMEM/F12'ye %10 (vol/vol) ısı inaktive FBS ekleyerek 25 mL tripsin nötralize edici çözelti hazırlayın ve steril koşullarda filtreleyin.
5. Kök hücre türevli podositlerin farklılaşma sonrası bakımı için, üreticinin yönergelerine göre bazal ortama takviye ekleyerek podosit bakım ortamı ile Komple Orta hazırlayın ve iki haftaya kadar 4 °C'de saklayın.

3. HiPS hücre kültürü ortamını kullanarak besleyici içermeyen hiPS hücre kültürü

1. ÖNCEDEN kaplanmış plakalardan BM matrisi 1'in artık çözeltisini epire edin ve kuyuları 1 ila 2 mL ısıtılmış DMEM / F12 ile 3 kez yıkayın.
2. Aspirat hiPS hücrelerinden hiPS CCM harcadı ve hücreleri ısıtılmış DMEM / F12 ile 3 kez durulayın. 1 mL sıcak hücre ayırma çözeltisi ekleyin ve hücrelerin ayrıştırilmesine yardımcı olmak için 37 °C'de 1 dakika kuluçkaya yatırın. Bir doku kültürü mikroskobu altındaki hücrelerin görsel incelemesini gerçekleştirin ve hücre kolonilerinin kenarlarının yuvarlatılmış göründüğünden emin olun, ardından hücre deklasment çözeltisini hücrelerden hızlı bir şekilde epire edin (hücre kolonilerinin gevşek de olsa hala plakaya bağlı olmasını sağlayın). Hücre ayırma çözümünü çıkarmak için hücreleri DMEM/F12 ile bir kez hafifçe durulayın.
3. Hücre müfrezesi çözeltisi ile tedavi edilen hiPS hücrelerine (6 kuyulu bir plakanın her kuyusunda) 3 mL hiPS CCM ekleyin. Bir hücre kaldırıcı kullanarak kolonileri kazıyın ve gevşek yapışmış hücreleri yerinden çıkarmak için hücre süspansiyonu yukarı ve aşağı hafifçe pipet. Tüm hücrelerin toplanır emin olmak için plakayı iyice yıkayın.
   NOT: Hücrelerde fazla makası önlemek için 5 mL pipet kullanılması önerilir.
4. Hücre süspansiyonunun 0,5 mL'lik kısmını, kuyu başına 2 mL hiPS CCM içeren yeni bir BM matrisi 1 kaplamalı 6 kuyu plakasının her kuyusuna aktarın. Hücre kolonilerini kuyulara dağıtmak ve % 5 CO₂ inkübatörde 37 °C'de kuluçkaya yatmak için plakayı şekil sekiz şekilde hareket ettinin. Hücreler geçişe hazır olana veya farklılaşma deneyi için kullanılana kadar ortamı günlük olarak yenileyin (yaklaşık % 70 izdiah).
   NOT: iPSC'lerin rutin geçişi için ideal koloni boyutu, hiPS CCM (ROCK inhibitörü olmadan) kullanılarak besleyici serbest koşullar altında 200-500 μm arasındadır. Hücreler ayrışma enzimleri veya tamponlar ile tedavi sırasında bireyselleştirilirse, hiPS CCM hücre canlılığını artırmak için ROCK inhibitörü (örneğin, 10 μM Y27632) ile desteklenebilir.

4. HiPS hücrelerinin mezoderm hücrelerine farklılaştırılması (gün 0-2)

1. HiPS hücre kültürleri üstel büyüme aşamasındayken (yaklaşık olarak geçtikten sonra kültürden yaklaşık 4 gün sonra ve yaklaşık% 70 izdiah), kolonilerin kenarları içinde ve çevresinde kendiliğinden farklılaşmış hücrelerin varlığını görsel olarak inceleyin. Gerekirse, aseptik olarak farklılaşma alanlarını kazıyın.
2. HiPS hücrelerinden hiPS CCM'yi aspire edin ve hücreleri ılık DMEM/F12 ile 3 kez durulayın. Hücreleri 37 °C'de 10 dakika boyunca 1 mL enzimsiz hücre ayrıştırma tamponu ile kuluçkaya yatırın ve mikroskop altında ayrışma olup olmadığını kontrol edin. Farklı hiPS hücre çizgileri arasındaki doğal farklılıklar nedeniyle, belirli bir hücre hattı için hücre ayrıştırma arabelleği için gerçek inkübasyon süresi belirlenmelidir.
3. Gevşek yapışmış hücreleri yerinden çıkarmak ve hücre süspansiyonu 15 mL konik bir tüpe aktarmak için kuyuyu bir hücre kaldırıcı ile hafifçe kazıyın, ardından hiPS hücrelerini bireyselleştirmek için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleme.
   1. Hücre süspansiyonu 15 mL ses seviyesine sıcak DMEM/F12 ve santrifüj ile oda sıcaklığında 290 x g'da 5 dakika boyunca getirin.
   2. Artık BM matrisi 1 ve ayrışma tampon bileşenlerini çıkarmak için hücreleri sıcak DMEM/F12 ile hafifçe emiş ve başka bir santrifüjleme turu için yeniden biriktirin.
4. Yukarıda açıklandığı gibi, 1 mL mezoderm indüksiyon ortamında süpernatant ve resuspend hücrelerini aspire edin. 1 x 10⁵ hücre/mL konsantrasyon elde etmek için gerekli olan uygun mezoderm farklılaşma ortamının hacmini belirlemek için hemositometre veya coulter sayacı kullanarak toplam hücre sayısını sayın.
5. BM matrisi 2 kaplamalı plakalardan ECM solüsyonu aspire edin ve plakaları ılık DMEM/F12 ile iki kez durulayın. HiPS hücre süspansiyonu birkaç kez pipetleme ile hafifçe karıştırın. Hücre süspansiyonunun 1 mL'lik kısmını BM matrisi 2 kaplamalı 12 kuyu plakalarının her kuyusuna aktarın ve ardından hücreleri daha eşit dağıtmak için plakaları hafifçe sallayın.
6. Plakayı %5 CO₂ inkübatörde 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Ertesi gün mezoderm indüksiyon ortamını yenileyin.
   NOT: 2 gün sonra hiPS hücre türevi mezoderm hücreleri ara mezoderm indüksiyonu için hazır olacaktır.

5. HiPS hücre türevi mezoderm hücrelerinin ara mezoderm haline farklılaşması (gün 2-16)

1. Farklılaşma protokolünün 2. gününde mezoderm indüksiyon ortamını aspire edin ve kuyu başına 1 mL ara mezoderm indüksiyon ortamı ile yenilenin.
2. Metabolik olarak aktif hücreler için doğru bir büyüme faktörleri ve küçük molekül eşiğini korumak için ortamı her gün yenileyin. Önemli miktarda hücre büyümesi ve medya besin maddelerinin hızlı tükenmesi varsa (ortamın sararması ile gösterilir), ara mezoderm farklılaşma ortamının hacmi 12 kuyu plakasının kuyusu başına 1,3 mL'ye yükseltilebilir.
3. Ara mezoderm hücreleri elde etmek için ek 14 gün boyunca kültür hücreleri. 16. güne kadar, bu hücreler daha sonra kullanılmak üzere kriyoprezizasyon yapılabilir.

6. HiPS hücre türevi ara mezoderm hücrelerinin podositlere farklılaştırılması (16 ila 21 gün)

1. Ara mezoderm hücrelerini ılık DMEM/F12 ile durulayın ve ardından 37 °C'de 3 dakika boyunca kuyu başına % 0,05 tripsin-EDTA başına 0,5 mL ile hücrelerin inkübasyonu. Hücrelerin ayrışmaya başladığından emin olmak için görsel inceleme gerçekleştirin.
2. Hücre kaldırıcı kullanarak hücreleri kazıyın ve hücre süspansiyonunu 1.000 μL pipet ucu kullanarak hücre süspansiyonunu birkaç kez kazıyın ve hücrelerin bireyselleştirilmiş (veya küçük kümelerini) elde edin.
   NOT: Bu aşamada, toplanan hücreler protokolün zaman çizelgesi içinde ölümcül olarak farklılaştırılmış bir fenotip elde etmeyebileceğinden hücrelerin tamamen ayrıştığından emin olun.
3. Tripsin aktivitesini durdurmak için trypsin nötralize edici çözelti kuyusu başına yaklaşık 2 mL ekleyin.
4. Hücreleri 50 mL konik bir tüpe aktarın ve DMEM/F12 kullanarak hacmi 50 mL'ye kadar getirin ve ardından hücre süspansiyonu oda sıcaklığında 201 x g'da 5 dakika santrifüjlayın.
5. Podosit indüksiyon ortamındaki süpernatant ve resuspend hücrelerini epire edin. En iyi sonuçları elde etmek için, 12 kuyu plakasının yaklaşık 100.000 hücre/kuyusundan oluşan nihai bir tohumlama yoğunluğu sağlayın. Hücre süspansiyonu BM matrisi 2 kaplamalı plakalara ekleyin ve hücrelerin daha eşit dağıtılmasına yardımcı olmak için plakayı hafifçe sallayın.
6. Hücreleri 37 °C ve% 5 CO 2'de kuluçkaya yatırın ve_21.
   NOT: Elde edilen hiPS hücre türevi podositler, podosit bakım ortamı ile tam ortam kullanılarak 2-4 hafta daha kültürde tutulabilir. Podosit bakım ortamına girdikten sonra, hücreler iki günde bir beslenebilir ve sonraki çalışmalar veya aşağı akış analizleri için kullanılabilir.

Sonuçlar

Bu protokolün amacı, olgun insan podositlerinin kimyasal olarak tanımlanmış koşullar altında hiPS hücrelerinden türetilebileceğini göstermekti. Bu yazıda sunulan veriler, ilk kez test edilen ve mikoplazma içermeyen DU11 hiPS hücre hattı¹⁷kullanılarak oluşturulmuştır. Kromozomal analiz de yapıldı ve hücrelerin karyotipik olarak normal olduğu tespit edildi. Farklılaşmamış DU11 hiPS hücrelerinden başlayarak, Bu raporda özetlenen farklılaşma stratejisi (

Tartışmalar

Bu raporda, hiPS hücrelerinden böbrek glomerüler podositlerin üretimi için bir protokol açıklıyoruz. HiPS hücre türevi podositler olgun böbrek podosit fenotipi ile ilişkili morfolojik ve moleküler özellikler sergiler¹³. Önceki yayınlarda, hiPS hücre türevi podositlerin, perf kullanılabilir bir mikroakışkan organ-on-a-chip cihazında glomerüler mikrovasküler endotel hücreleri ile birlikte kültürlendiğinde böbrek glomerülüsünün yapısını ve seçici filtrasyon işlev...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells
DU11 human iPS cells			The DU11(Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke University iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. This line has been tested for mycoplasma and was last karyotyped in July 2019 by our lab, and found to be karyotypically normal.
Growth Factors and Media Supplements
All-trans retinoic acid (500 mg)	72262	Stem Cell Technologies
B27 serum-free supplement	17504044	Thermo/Life Technologies
CHIR99021	04-0004	Stemgent	May show lot-to-lot variation
Complete Medium Kit with CultureBoost-R	4Z0-500-R	Cell Systems	Podocyte maintenance media
DMEM/F12	12634028	Thermo/Life Technologies
DMEM/F12 with GlutaMAX supplement	10565042	Thermo/Life Technologies	DMEM/F12 with glutamine supplement
Heat-inactivated FBS	10082147	Thermo/Life Technologies
Human activin A	PHC9564	Thermo/Life Technologies
Human BMP7	PHC9544	Thermo/Life Technologies
Human VEGF	PHC9394	Thermo/Life Technologies
mTeSR1 medium	05850	Stem Cell Technologies	hiPS cell culture media (CCM)
Penicillin–streptomycin, liquid (100×)	15140-163	Thermo/Life Technologies
Y27632 ROCK inhibitor	1254	Tocris
Antibodies
Alexa Fluor 488– and Alexa Fluor 594–conjugated secondary antibodies	A32744; A32754; A-11076; A32790	Thermo/Life Technologies
Brachyury(T)	ab20680	Abcam
Nephrin	GP-N2	Progen
OCT4	AF1759	R&D Systems
PAX2	71-6000	Invitrogen
WT1	MAB4234	Millipore
ECM Molecules
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment	N-892012	Iwai North America	Basement membrane (BM) matrix 2
Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial	354277	BD Biosciences	Basement membrane (BM) matrix 1. May show lot-to-lot variation
Enzymes and Other Reagents
Accutase	A1110501	Thermo/Life Technologies	Cell detachment solution
BSA	A9418	Sigma-Aldrich
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	D2438	Sigma-Aldrich	DMSO is toxic. Should be handled in chemical safety hood
Enzyme-free cell dissociation buffer, Hank’s balanced salt	13150016	Thermo/Life Technologies
Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade	97065-058	VWR	Ethanol is flammable and toxic
FBS	431097	Corning
Paraformaldehyde (PFA)	28906	Thermo/Life Technologies	PFA should be handled in a chemical fume hood with proper personal protection equipment, including gloves, lab coat, and safety eye glasses. Avoid inhalation and contact with skin.
Phosphate-buffered saline (PBS)	14190-250	Thermo/Life Technologies
Sterile Distilled Water	15230162	Thermo/Life Technologies
Triton X-100	97062-208	VWR
Trypsin-EDTA, 0.05%	25300-120	Thermo/Life Technologies
Equipment
Aspirating pipettes, individually wrapped	29442-462	Corning
Avanti J-15R Centrifuge	B99516	Beckman Coulter
Conical centrifuge tube, 15 mL	352097	Corning
Conical centrifuge tube, 50 mL	352098	Corning
Cryoboxes	3395465	Thermo/Life Technologies	For storing frozen aliquots
EVOS M7000	AMF7000	Thermo/Life Technologies	Flourescent microscope used to acquire images of fixed and stained iPS cells and their derivatives
Hemocytometer	100503-092	VWR
Heracell VIOS 160i CO2 incubator	51030403	Thermo/Life Technologies	For the routine culture and maintenace of iPS cells and their derivatives
Inverted Zeiss Axio Observer equipped with AxioCam 503 camera	491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera)	Carl Zeiss Microscopy	Used to acquire phase contrast images of live iPS cells and their derivatives at each stage of podocyte differentiation
Kimberly-Clark nitrile gloves	40101-346	VWR
Kimwipes, large	21905-049	VWR
Kimwipes, small	21905-026	VWR
P10 precision barrier pipette tips	P1096-FR	Denville Scientific
P100 barrier pipette tips	P1125	Denville Scientific
P1000 barrier pipette tips	P1126	Denville Scientific
P20 barrier pipette tips	P1121	Denville Scientific
P200 barrier pipette tips	P1122	Denville Scientific
Serological pipette, 10 mL, individually wrapped	356551	Corning
Serological pipette, 25 mL, individually wrapped	356525	Corning
Serological pipette, 5 mL, individually wrapped	356543	Corning
Steriflip, 0.22 μm, PES	SCGP00525	EMD Millipore
Sterile Microcentrifuge Tubes	1138W14	Thomas Scientific	For aliquoting growth factors
Tissue culture–treated 12-well plates	353043	Corning
Tissue culture–treated six-well plates	353046	Corning
VWR white techuni lab coat	10141-342	VWR
Wide-beveled cell lifter	3008	Corning