İnsan Böbrek Dokusunda Bölgesel TranskriptomikLeri Ortaya Çıkarmak İçin Lazer Mikrodispeksiyon Uygulaması

Özet

Glomerulus, proksimal tübül, kalın yükselen uzuv, toplama kanalı ve interstiyum dahil olmak üzere insan böbreğinin alt segmentlerinin lazer mikroseksiyonu için bir protokol açıklıyoruz. RNA daha sonra elde edilen bölmelerden izole edilir ve her alt segmentteki transkriptomik imzadaki değişiklikleri belirlemek için RNA dizilimi gerçekleştirilir.

Özet

İnsan böbrek dokusunun gen ekspresyon analizi homeostaz ve hastalık patofizyolojisini anlamak için önemli bir araçtır. Bu teknolojinin çözünürlüğünün ve derinliğinin arttırılması ve doku içindeki hücre seviyesine kadar genişletilmesi gerekir. Tek nükleer ve tek hücreli RNA diziliminin kullanımı yaygınlaşmış olsa da doku ayrışmasından elde edilen hücrelerin ifade imzaları mekansal bağlamı korumamaktadır. Belirli floresan belirteçlere dayanan lazer mikrodiseksiyon (LMD), bilinen lokalizasyon ile belirli yapıların ve hücre gruplarının izolasyonuna izin verecek ve böylece böbrek dokusunda mekansal bağlantılı transkriptomik imzaların elde edilmesini sağlayacaktır. hızlı floresan bazlı bir leke tarafından yönlendirilen bir LMD metodolojisini, insan böbreği içindeki beş ayrı bölmeyi izole etmek ve değerli insan böbrek dokusu örneklerinden sonraki RNA dizilimini yapmak için optimize ettik. Ayrıca, toplanan numunelerin yeterliliğinin değerlendirilmesini sağlamak için kalite kontrol parametreleri sunuyoruz. Bu yazıda özetlenen iş akışı, alt segmental transkriptomik imzaları yüksek güvenle izole etmek için bu yaklaşımın fizibilitesini göstermektedir. Burada sunulan metodolojik yaklaşım, ilgili antikor belirteçlerinin ikame edilmesi ile diğer doku tiplerine de uygulanabilir.

Giriş

Doku örneklerinin incelenmesindeki teknolojik gelişmeler, çeşitli organlardaki sağlık ve hastalık durumunun anlaşılmasını geliştirlemiştir. Bu tür gelişmeler, patolojinin sınırlı bölgelerde veya belirli hücre tiplerinde başlayabileceğinin altını çizmiştir, ancak tüm organ üzerinde önemli etkileri vardır. Bu nedenle, kişiselleştirilmiş tıbbın mevcut çağında, biyolojiyi sadece küresel olarak değil, hem hücre hem de bölgesel düzeyde anlamak önemlidir¹. Bu, özellikle patolojik stresi farklı olarak başlatan ve / veya yanıt veren çeşitli özel hücre ve yapılardan oluşan böbrekte geçerlidir. Çeşitli insan böbrek hastalığı türlerinin patogenezi hala iyi anlaşılamamıştır. İnsan böbreğindeki interstiyumun belirli tübüler segmentlerinde, yapılarında veya alanlarında gen ifadesindeki değişiklikleri incelemek için bir metodoloji oluşturmak, hastalığın patogenezini bilgilendirebilecek bölgeye özgü değişiklikleri ortaya çıkarma yeteneğini artıracaktır.

İnsan böbrek biyopsisi örnekleri sınırlı ve değerli bir kaynaktır. Bu nedenle, böbrek dokusundaki transkriptomiyi sorgulayan teknolojiler dokuyu ekononize etmek için optimize edilmelidir. Hücre ve bölgesel düzeyde transkriptomikleri incelemek için mevcut yöntemler arasında tek hücreli RNA dizilimi (scRNaseq), tek nükleer RNaseq (snRNaseq), in situ mekansal hibridizasyon ve lazer mikrodiseksiyon (LMD) sayilebilir. İkincisi, aşağı akış RNA dizilimi ve analizi 2 ,^3,4,5için doku bölümlerindeki bölgelerin veya ilgi çekici yapıların hassas izolasyonu için çok uygundur. LMD, diseksiyon sırasında floresan bazlı görüntüleme kullanılarak doğrulanmış belirteçlere dayalı belirli hücre tiplerinin veya yapılarının tanımlanmasına dayanarak benimsenebilir.

Lazer mikroseksiyon destekli bölgesel transkriptominin benzersiz özellikleri şunlardır: 1) hücrelerin histolojik olarak değil ifade ile tanımlandığı tek hücre teknolojilerini tamamlayan hücre ve yapıların mekansal bağlamının korunması; 2) bir antikor işaretçisi ifade imzalarını tanımladığı için teknoloji diğer görüntüleme teknolojilerini bilgilendirir ve bilgilendirir; 3) hastalıkta belirteçler değiştiğinde bile yapıları tanımlama yeteneği; 4) yaklaşık 20.000 gende düşük eksprese transkriptlerin tespiti; ve 5) olağanüstü doku ekonomisi. Teknoloji, yeterli RNA alımı için gerekli olan bir çekirdeğin 100 μm kalınlığından daha az olan bir böbrek biyopsisi için ölçeklenebilir ve büyük depolarda veya akademik merkezlerde yaygın olarak bulunan arşivlenmiş donmuş dokunun kullanılmasını sağlar⁶.

Devam eden çalışmada, insan böbrek dokusu ile kullanılmak üzere yeni bir hızlı floresan boyama protokolü ile optimize edilmiş bölgesel ve toplu transkriptomik teknolojiyi ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Bu yaklaşım klasik LMD keşifleri üzerinde geliştirir, çünkü toplama tubulointerstitial ifadenin aksine interstiyum ve nefron alt segmentleri için ayrı ifade verileri sağlar. Titizlik ve tekrarlanabilirlik sağlamak için uygulanan kalite güvence ve kontrol önlemleri dahildir. Protokol, hücrelerin ve ilgi alanlarının görselleştirilmesini sağlar ve bu da aşağı akış RNA dizilimine izin vermek için bu yalıtılmış alanlardan RNA'nın tatmin edici bir şekilde alınmasına neden olur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Çalışma Indiana Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından kullanılmak üzere onaylandı.

NOT: Bu protokolü, Optimal Kesme Sıcaklığı (OCT) bileşiminde korunmuş ve -80 °C'de depolanan böbrek nefrektomi dokusuyla (hem X hem de Y boyutlarında 2 cm'ye kadar) kullanın. Tüm çalışmaları RNA kontaminasyonini sınırlayan bir şekilde gerçekleştirin, temiz tek kullanımlık eldivenler ve yüz maskesi kullanın. Tüm yüzeylerin temizliğini sağlayın. Bu protokolün optimize edildiği ekipman, darbeli UV lazer içeren bir lazer mikrodiseksiyon sistemidir.

1. Kriyoseksiyon

1. Kriyoseksiyondan hemen önce 30 dakika boyunca 1,2 μm LMD PPS-membran (poli (p-fenilen sülfit) slaytlarını UV ışığına (doku kültürü laminer akış davlumbazında) maruz bırakın. Optimum doku yapışağı için slaytları oda sıcaklığında saklayın.
2. Kriyostatı -20 °C'ye soğutun. Çalışma yüzeylerini temizleyin ve yeni bir kesme bıçağı takın.
3. Slaytları taze kesilmiş dokuyla saklamak için kriyostat odasının içine küçük bir slayt kutusu (RNase yüzey dekontaminasyon çözeltisi ile temizlenir) yerleştirin.
4. OCT'deki numuneyi bir doku tutucuya yapıştırın ve oda sıcaklığına ulaşmak ve OCT bloğu ile tutucu arasındaki yapışma kuvvetini güçlendirmek için birkaç dakika boyunca dengelenmesine izin verin. Bir ısı çıkarıcı kullanarak işleme yardımcı olmak.
5. Numuneyi 12 μm kalınlıkta kesin ve slayt adaptörünü kullanarak özel LMD slaydına yapıştırın. Her slaytta slayt başına bir nefrektomi bölümü veya slayt başına en fazla iki böbrek biyopsisi bölümü vardır. Slayt kutusunun içinde fazla nemin birikmesini önlemek için slaytları -80 °C'de kurutucu bir kartuşla ve sıkıca kapalı bir plastik torbanın içinde saklayın.
6. Her slaydı örnek kimliği, tarih ve slayt numarasıyla etiketleyin.
7. İlk kriyoseksiyon tarihinden itibaren 10 gün içinde örnekleri içeren slaytları kullanın.

2. Lazer mikro disseksiyon

1. Boyamadan hemen önce, antikor karışımını (Ab-Mix) RNase içermeyen PBS'de% 10 BSA'da aşağıdakileri ekleyerek hazırlayın: 4 μL FITC-Phalloidin, 1,5 μL DAPI, 2 μL Tamm-Horsfall Protein (THP) antikor doğrudan Alexa Fluor 546, 3,3 μL RNase Inhibitörü ve PBS'de % 10 BSA'nın 89,2 μL'si (100 μL hacme ulaşmak için).
   NOT: THP antikorunun yerine alternatif antikorlar kullanılabilir. Örneğin, doğrudan Alexa Fluor 568'e konjuge edilen 2 μL megalin/LRP2 antikoru proksimal tübül etiketlemek için kullanılabilir. Ab-Mix LRP2 veya THP antikoru içerir (sırasıyla proksimal tübülleri veya kalın yükselen uzuvları görselleştirmek için). Diğer antikorlar kullanıcı ihtiyaçlarına göre doğrulanabilir.
2. Kaydırağı buz gibi (-20 °C) %100 asetonda 1 dakika yıkayın ve nem odasına taşıyın.
3. Slastanın üst kısmını RNase içermeyen PBS ile 30 sn boyunca yıkayın.
4. Slaydın üst kısmını RNase içermeyen PBS'de %10 BSA ile 30 sn boyunca yıkayın.
5. Ab-Mix'i 5 dakika uygulayın.
6. Slaydın üst kısmını RNase içermeyen PBS'de %10 BSA ile 30 sn boyunca yıkayın.
7. Kaydırağı 5 dakika boyunca havayla kurulayın ve lazer mikroseksiyon kesme platformuna yükleyin.
8. RNA izolasyon kitinden 50 μL Ekstraksiyon Tamponu içeren PCR çalışması için uygun toplama tüplerini (otomatik olarak kapatılmış 0,5 mL mikrosantrifüj tüpler) takın.
9. LMD ile devam edin. Her LMD oturumunu en fazla 2 saat içinde tamamlayın.
   1. Operatörler arası değişkenliğin yanı sıra arşivleme amaçları, gerçekleştirilen protokolün eğitimi ve kalite değerlendirmesi için diseksiyonu doğrulamak için mikroskop kamerayı kullanarak LMD öncesi ve sonrası immünofluoresans görüntülerini toplayın. 0,5 – 1 ng RNA elde etmek için en az 500.000 μm² alan gereklidir. Bu genellikle tüm alt ilgi segmentleri için yeterli miktarda malzeme elde etmek için 8 x12 μm kalınlıkta bölümlerin kullanılmasını gerektirir.
   2. Boyama, morfoloji ve konum olarak ilgi çekici bölgeleri belirleyin ve 40'tan büyük lazer gücü kullanarak bunları çıkarın.
      NOT: İşte diseksiyon kriterleri. Proksimal tübül FITC-Phalloidin ve LRP2 etiketlemesi ile tanımlanır. Kalın yükselen uzuv THP etiketleme ile tanımlanır. Toplama kanalı nükleer morfoloji (DAPI) ve diğer lekelerin olmaması ile tanımlanır. Glomerulus FITC-Phalloidin ve morfoloji ile tanımlanır. Intersitium lekeli tübüller arasındaki alan olarak tanımlanır.
10. LMD slaydına iki adet 12 μm bölüm yapıştırarak ve tüm bölümleri ayıklama arabelleğine keserek toplu kesitsel ifade imzası elde edin.
11. LMD işlemi tamamlandıktan sonra, toplama mikrosantrifüj tüplerini kapatın ve içeriğin kapaktan tüpün altına taşındığından emin olmak için kuvvetlice kaydırın
12. Tüpleri 30 s için 3.000 x g'da santrifüj edin.
13. Tüpleri 42 °C su banyosunda 30 dakika kuluçkaya yatırın.
14. Tüpleri 2 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüj edin.
15. Süpernatant'ı yeni bir 0,5 mL tüpe aktarın ve -80 °C'de saklayın.

3. RNA izolasyonu

NOT: Bu RNA yalıtım protokolü için, ticari bir RNA yalıtım kitinden bir protokol uyarladık. Üreticinin protokolü, proje için belirlenen kalite kontrol gereksinimlerini karşılayacak şekilde değiştirilmiştir.

1. Her RNA arıtma sütununa (PC) 250 μL Şartlandırılmış Tampon (CB) ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
2. Tüm bilgisayarları 16.000 x g'da 1 dakika boyunca santrifüj edin.
3. Doku örnekleri ile tüplere %70 etanol (Kit'te bulunur) 50 μL ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleme yaparak numuneleri iyice karıştırın. Girdap yapmayın. Santrifüj yapmayın.
4. Karışımı 100 x g'da 2 dakika boyunca şartlandırılmış pc'lere ve santrifüje aktarın (RNA'yı bağlamak için), 16.000 x g'da 30 s santrifüjleme ile hızla takip edin (akışı kaldırmak için). Herhangi bir alt segment için doku örnekleri içeren 1'den fazla tüp varsa bu adımı tekrarlayın.
5. Pc'lere 100 μL Yıkama Tamponu 1 (WB1) ekleyin ve 8.000 x g'da1 dakika santrifüj ekleyin.
6. Her numune başına 40 μL DNase hazırlayın (35 μL RDD arabelleğe 5 μL DNase ekleyin). Daha sonra doğrudan PC'nin zarı üzerine 40 μL karışım ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.
7. PC'nin zarına 40 μL WB1 ekleyin ve 8.000 x g'da15 s için santrifüj ekleyin.
8. PC'nin zarına 100 μL Yıkama Tamponu 2 (WB2) ekleyin ve 8.000 x g'da1 dakika santrifüj ekleyin.
9. PC'nin zarına 100 μL WB2 ekleyin, 16.000 x g'da2 dakika santrifüj , hemen ardından 16.000 x g'da1 dakika santrifüjleme.
10. Bilgisayarı yeni bir 0,5 mL tüpe aktarın.
11. Membrana 12 μL Elution Buffer (EB) ekleyin ve oda sıcaklığında 7 dakika kuluçkaya yatırın. Böylece, havuza alınan tüm diseksiyonlu doku örneklerinin son hacmi alt segment başına 12 μL'dir.
12. Numuneleri 1.000 x g'da 1 dakika ve ardından 16.000 x g'da 2 dakika santrifüj.
13. Biyoanalyzer analizi için 2 μL'yi taze bir tüpe aktarın (donma-çözülme olaylarını önlemek için).
14. Tüm tüpleri daha fazla işleme hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.

4. RNA dizilimi

1. Ticari bir Biyoanalyzer ve küçük miktarlarda RNA ölçmeye adanmış bir çip kullanarak kalite için sıralamaya yönelik her numuneyi değerlendirin.
2. Kütüphane hazırlığı ve dizilemesi öncesinde aşağıdaki kalite kontrol (QC) parametreleri gereklidir: Toplu olarak 4 ng'den ve her alt segment için 0,5 – 1 ng'den büyük RNA miktarı; 200 nükleotitten (DV200) uzun transkriptlerin yüzdesinin LMD örnekleri için %25'ten büyük olması gerekir (optimal > %75).
3. Küçük miktarlarda bozulmuş RNA için tasarlanmış ticari bir cDNA kütüphane hazırlama kiti ile kütüphane hazırlığı gerçekleştirin. Ekte listelenen ticari kit için, minimum DV200% 25 ve parçalanma gerektirmeyen Seçenek 2'yi kullanmanızı öneririz. Bazı sıralama teknolojileri% 30⁷gibi daha yüksek minimum DV200 eşikleri gerektirebilir.
4. cDNA bağdaştırıcıları ve dizinleri ekleyin.
5. Manyetik boncuk teknolojisini kullanarak RNAseq kitaplıklarını arındırın.
6. RNAseq kitaplık amplifikasyon adımından önce ticari bir rRNA kaldırma kiti kullanarak ribozomal cDNA'yı tükenmesi.
7. 2 ng/μL cDNA kütüphane konsantrasyonundaki manyetik boncuk teknolojisini kullanarak son RNAseq kütüphanesini arındırın.
8. Toplu olarak 30 milyon okuma/örnek ve alt segmental bölümler için 100 milyon okuma/örnek ile ticari bir sıralama sisteminde 75 bp eşleştirilmiş uç RNA dizilimini gerçekleştirin.
9. Toplu iş efektinin kontrolüne izin vermek için her sıralama çalıştırmasıyla bir Referans RNA (25 μg) kullanın. Referans RNA'mızın ilk konsantrasyonu 1 μg/μL iken, sıralamada kullanılan son konsantrasyon 25 ng/μL'dir.
10. Sıralama, interjenik ve mitokondriyal okumaların kalitesini değerlendirmek ve bir gene atfedilen okumaları belirlemek için FastQC uygulamasını kullanarak veri analizi yapın.
11. Hizalama için Bütünleştirici Genomik Görüntüleyici (IGV) ve transkript ifade ölçümleri için edgeR/rbamtools kullanın.
12. 100.000'den az okuma ile örnekleri kaldırın. Quantile, kullanıcı tanımlı bir eşikte düşük ifade edilen genleri filtreledikten sonra veri kümesindeki ham okumaları normalleştirir.
13. İfadeyi, ilgili alt segmentin diğer tüm alt segmentlerin ortalamasına bir oranı olarak ölçün ve log2 dönüşümü yapın. Aynı genin bağıl ekspresy edilmesi alt segmentler ve örnekler arasında karşılaştırılabilir; bununla birlikte, genler ve RNA türleri arasındaki potansiyel bozulma farklılıkları nedeniyle iki farklı gen arasındaki bağıl ifadeyi karşılaştırmak ideal değildir.
14. Referans RNA örnekleri partiler arasında karşılaştırılırken, her nefron alt segmentine özgü bir dizi üretici için gen ekspresyonını karşılaştırmak için bir zenginleştirme analizi gerçekleştirin. R değeri > 0.9 olan ortalama ifadenin 1 standart sapması içindeki bir toplu iş efekti kabul edilebilir olarak kabul edilir. Daha yüksek bir toplu iş efekti puanı için ek normalleştirme gereklidir. Kabul edilen toplu iş efektinden sapan herhangi bir çalıştırma işaretlenebilir. Q30, her sıralama çalıştırması için >%90'dan büyük olmalıdır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Örnekleri

Böbrek nefron segmentlerini ve interstisyel alanları izole etmek için hızlı floresan boyama protokolünü kullanarak dokuz referans nefrektomiden (Indiana Üniversitesi'nde elde edilen 3 örnek ve Böbrek Hassas Tıp Projesi ile elde edilen 6 örnek) verileri sunuyoruz. Bu süreçte kullanılan bölümler vefat eden böbrek donörlerinden veya etkilenmemiş tümör neforektomilerinden elde edildi. Bu örneklerde bitişik bölümlerden alınan H&E lekesinde gör...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

LMD tabanlı transkriptomik, gen ekspresyonını doku içindeki belirli alanlara tutturan yararlı bir teknolojidir. Bu teknolojinin temeli ve böbrekteki potansiyel uygulaması daha önce tanımlanmıştır⁸. Bununla birlikte, özellikle aşağı akış RNA dizilimi için yüksek doğruluk diseksiyonunu amaçlayan floresan bazlı diseksiyonun optimizasyonu, modernizasyonu ve düzene sokulması daha az yaygındır. Bu metodoloji doku içinde mekansal olarak topraklandığı için, doku yapıların...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Sigma-Aldrich	270725-1L
AMPure Beads	Beckman Coulter	A63880
Bioanalyzer	Agilent	2100
BSA	VWR	0332-100G
DAPI	ThermoFisher	62248
Desiccant Cartridge	Bel-Art	F42046-0000
DNAse	Qiagen	79254	RDD buffer is included in the pakage
Laser Microdissection Microscope	Leica	LMD6500
Megalin/LRP2 Antibody	Abcam	ab76969	Directly conjugated to Alexa Fluor 568
Microcentrifuge tubes	ThermoFisher	AB-0350
Microscope camera	Leica	DFC700T
PBS (RNAse Free)	VWR	K812-500ML
Phalloidin (Oregon Green 488)	ThermoFisher	O7466
PicoPure RNA Isolation Kit	Applied Biosystems	KIT0204
PPS-membrane slides	Leica	11505268
qPCR Human Reference Total RNA 25 µg	Takara Clontech	636690
RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip	Agilent	5067-1513
RNAse Away	ThermoFisher	7000
RNAse Inhibitor	ThermoFisher	AM2696
Sequencer (HiSeq or NovaSeq)	Illumina	NA
SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2	Takara Clontech	634411
Tamm-Horsfall Protein Antibody	R&D Systems	AF5144	Directly conjugated to Alexa Fluor 546
Tissue-Tek® O.C.T. Compound	Sakura	4583