JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (iPSCs) in vitro NMJs oluşturmak için bir protokol sağlar. Bu yöntem, olgun morfolojisi ve fonksiyonu ile NMJs neden olabilir 1 ay içinde tek bir kuyuda. Ortaya çıkan NMJ'ler potansiyel olarak ilgili hastalıkları modellemek, patolojik mekanizmaları incelemek veya tedavi için ilaç bileşiklerini taramak için kullanılabilir.

Özet

Nöromüsküler kavşak (NMJ) mekanik hareket için iskelet kası motor nöron eylem potansiyelleri iletir özel bir sinaps olduğunu. NMJ yapısının mimarisi nöron fonksiyonlarını etkiler, kas ve karşılıklı etkileşim. Önceki çalışmalar da karmaşık indüksiyon süreci ve uzun kültür dönemi ile NMJ in vitro oluşturmak için motor nöronlar ve miyotüpler karmaçeşitli birçok strateji bildirdin ama olgun NMJ morfolojisi ve fonksiyonu özetlemek için mücadele var. Bizim in vitro NMJ indüksiyon sistemi tek bir kültür çanak insan iPSC ayırt tarafından inşa edilmiştir. İndüksiyon için miyojenik ve nörojenik indüksiyon ortamını değiştirerek, ortaya çıkan NMJ bir aylık kültürde motor nöronlar, iskelet kası ve Schwann hücreleri de dahil olmak üzere pre-ve post-sinaptik bileşenler içeriyordu. NMJ fonksiyonel tsay da miyotüpler daralma Ca tarafından tetiklenebilir gösterdi++ sonra curare tarafından inhibe, bir asetilkolin reseptörü (AChR) inhibitörü, hangi uyarıcı sinyal NMJ ile iletilir. Bu basit ve sağlam yaklaşım, NMJ'nin karmaşık yapısını işlevsel bağlantı ile başarıyla elde etti. Bu in vitro insan NMJ, entegre yapıları ve fonksiyonu ile, patolojik mekanizmalar ve bileşik tarama çalışma için umut verici bir potansiyele sahiptir.

Giriş

Nöromüsküler kavşak (NMJ) motor nöronlardan iskelet kasları gönüllü kas hareketini kontrol etmek için sinyalleri iletir özel bir sinaps olduğunu1,2. Bu sinaps öncesi ve sonrası sinaptik parçalardan oluşur. Pre-sinaptik kısmında, motor nöron asetilkolin bültenleri (ACh) ekskopisoz tarafından sinaptik veziküllerden. ACh sinaptik yarık çapraz ve kas kasılması için bir eylem potansiyeli tetiklemek için post-sinaptik parçası aChR bağlamak için sinaptik veziküller serbest bırakılır3,4. Bu hassas yapıdaki herhangi bir arıza spinal müsküler atrofi (SMA), konjenital miyastenik sendromlar (CMS), miyasteni gravis (MG)5,,6,,7, vb dahil olmak üzere NMJ hastalıklarına neden olabilir. Bu hastalıklar hastaların yaşam kalitesini büyük ölçüde zedeler ve ne yazık ki patolojik mekanizmanın anlaşılmaması nedeniyle etkili bir tedavi yaklaşımı na sahip değildir. Bu çalışmada, doğru hastalık modellemeve terapötik bileşiklerin taranması için insan iPSC'lerinden in vitro insan NMJ'si üretmeyi amaçladık.

Daha önceki çalışmalar, ortak kültür stratejileri ile in vitro NMJ üretme olasılığını göstermiştir. Motor nöronlar ve iskelet miyotüpleri sırasıyla oluşturulur. İki hücre tipi insan veya fare birincil doku kültürlerinden üretilebilir veya kök hücrelerden indüklenebilir8,9,10,11 ve daha sonra NMJ oluşumu için eş kültürlü. Diğer uygulamalar mikroakışkan 3D cihazlar içine co-kültürlü NMJ birleştirme ve ölçülebilir fonksiyonel tahliller için optogenetik birimleri kullanmak içerir12,13. Ancak, bu stratejiler uzun bir kültür dönemi sürer ve NMJ birincil bileşenleri elde etmek için mücadele gerektirir, motor nöron ya da iskelet miyotube aynı anda. NMJ'nin bir diğer önemli bileşeni olan Schwann hücresi bu kültür sistemlerinde oluşturulamaz. NMJ çalışmaları için güvenilir ve sağlam bir model sunabilir olarak myotube, motor nöron ve Schwann hücre içeren gelişmiş kültür sistemi arzu edilir.

Miyojenik Farklılaşma 1 (MYOD1) miyogenez için iyi bilinen bir miyojenik regülatördür14. MYOD1'i miyotubelara yönlendirmek için uygulanan etkin miyojenik farklılaşma yöntemi bir önceki çalışmada15'teoluşturulmuştu. Bu nedenle, iPSCs15MYOD1 overexpressing tarafından miyotüpler indüklenen , ve miyojenik farklılaşma yüksek verimlilik gösterilmiştir. İlginçtir, nöron hücreleri gün sonra spontan miyotüpler ile birlikte ortaya çıktı 10. Miyojenik kültürde nöron hücrelerinin görünümü bize tek bir çanak in vitro NMJ üretmek için strateji geliştirmek için yol açmıştır. Burada aynı kültür çanak miyojenik ve motor nöron indüksiyon için insan iPSCs MYOD1 overexpressing tarafından NMJs oluşturmak için bir strateji sağlar. Motor nöronlar çeşitli nörotrofik faktörler (GDNF, BDNF, NT3, vb) ile kendiliğinden indüklenir 8, ve, bu arada, Schwann hücreleri de indüklenebilir16,17. Miyotüpler arasındaki etkileşimler sayesinde, motor nöronlar ve Schwann hücreleri, olgun NMJ oluşur18. Bu yöntem, patolojik mekanizmalar ve terapötik bileşik tarama potansiyel çalışma sağlayan, verimli fonksiyonel NMJ üretebilir.

Protokol

1. Hücre dışı matriks (ECM) kaplamalı plakaların hazırlanması

  1. Seyreltik ECM (Bkz. Malzeme Tablosu)buz soğuğu 1x PBS ile %2'lik son konsantrasyona kadar.
    1. 50 mL plastik bir tüpe 1x PBS'den 49 mL'ye 1 mL ECM ekleyin. Birkaç kez yukarı ve aşağı pipetting tarafından iyice karıştırın.
  2. 6 kuyulu bir plakanın her kuyuya 1 kapak yerleştirin. Her kuyuya %2 ECM 1,5 mL ekleyin.
  3. Kuyu plakasını %2 ECM ile 37 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın.
  4. Kuyu plakasından ECM aspire edin ve kullanmadan önce plakayı 4 °C'de saklayın.

2. IPSC'lerin NMJ'ye Farklılaşması

  1. Bölüm 1'de5 hazırlanan 6 kuyulu plaka üzerinde her de iPSC'lerin 4 x 10 5'ini tohumlayın. Kapak kaymaüzerinde önceden depolanmış hücreler tohum emin olun.
    NOT: Bu çalışmada, 201B7MYOD iPS hücre hattı, Dr Sakurai's Lab bir hediye,15kullanılmıştır.
    1. 6 cm kültür çanağı üzerindeki iPSC'lerden ortayı çıkarın ve iPSC'leri 1x PBS ile bir kez yıkayın.
    2. Çanağa 1 mL hücre ayırma çözeltisi ekleyin ve 37 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.
    3. 3 mL primat embriyonik kök (ES) hücre ortamını tabağa ve pipete 3 kez hafifçe ekleyin.
    4. Müstakil iPSC'ler içeren supernatant'ı 50 mL plastik bir tüpe ve 160 x g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüje toplayın.
    5. Supernatant'ı dikkatlice aspire edin, 10 μM Y27632 ile 3 mL primat ES hücre ortasındaki iPSC'leri yeniden askıya alın ve hemositometre kullanarak hücre numarasını sayın.
    6. Primat ES hücre ortası ve 10 μM Y27632 ile iPSC'leri 2 x 105 hücre/mL konsantrasyonuna seyreltin. Bölüm 1'de açıklanan kuyuya önceden yatırılan kapak fişine 2 mL iPSC ekleyin.
  2. iPSC'lerin NMJ'ye indüksiyonu
    1. 1. günde, 24 saat iPSC'leri 6 kuyulu plakaya tohumladıktan sonra, kültür ortamını çıkarın ve her kuyuya 1 μg/mL doksisiklin içeren 2 mL taze primat ES hücre li orta ile değiştirin.
    2. 1 μg/mL doksisiklin (son konsantrasyon) içeren 2 mL miyojenik farklılaşma ortamı (MDM)(Tablo 1)ile ortayı değiştirin. Ortamı 2 günden 10.güne kadar her gün yenileyin.
    3. 11. günden itibaren, orta yı 2 mL NMJ orta(Tablo 1)ile her kuyuya çevirin. 30 gün sonraya kadar her 3\u20124 gün orta yenileyin.
  3. 30. günde faz ters mikroskopi ile farklılaştırılmış NMJ'yi gözlemleyin. NMJ aşağıdaki analiz için kullanılabilir.

3. İmmünofluoresans (IF) boyama

  1. 30. günde, 6 kuyulu tabaktan kültür ortamını aspire edin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca her kuyuya 2 mL %4 paraformaldehit ekleyerek NMJ kültürünü düzeltin.
  2. Her kuyuya 2 mL 1x PBS ekleyerek numuneleri 3 kez yıkayın (her yıkama için 3 dk).
  3. 10 dakika boyunca % 0.1 Triton/PBS ile numuneleri permeabilize edin.
  4. Adımı 3.2'yi tekrarlayın.
  5. Numuneleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca %0,5 BSA ile engelleyin.
  6. Adımı 3.2'yi tekrarlayın.
  7. Numuneleri bir gecede 4 °C'de birincil antikorlarla kuluçkaya yatırın. Antikorların seyreltilmesi aşağıdaki gibidir: Adacık 1 (1 μg/mL), miyozin ağır zincir (MYH) (1/300), nörofilamentler (NF) (1 μg/mL), S-100 (1/300), sinaptik vezikül proteini 2 (SV2) (1 g/mL), Tuj1 (1/1000).
  8. Adımı 3.2'yi tekrarlayın.
  9. Numuneleri oda sıcaklığında ikincil antikorlarla 1 saat kuluçkaya yatırın. Kullanılan ikincil antikorların konsantrasyonu aşağıdaki gibidir: anti-fare IgG 488 konjuge (0.1 μg/mL), anti-tavşan IgG 488 konjuge (0.1 μg/mL).
  10. Adımı 3.2'yi tekrarlayın.
  11. Numuneleri AChR boyama için aBTX-647 (0,5 g/mL) ve çekirdek boyama için DAPI (1 μg/mL) ile kuluçkaya yatırın.
  12. Adımı 3.2'yi tekrarlayın.
  13. 6-iyi plaka forseps bir çift ile coverslip pick up ve bir mikroskop slayt% 50 gliserol / PBS çözeltisi monte.

4. Taramalı elektron mikroskobu (SEM)

  1. 0,1 M potasyum fosfat tamponunda hazırlanan %4 paraformaldehit ve %1 glutaraldehit ile 1 saat oda sıcaklığında NMJ kültürünü düzeltin.
  2. Örnekleri oda sıcaklığında 0,1 M potasyum fosfat tamponuna batırarak (her yıkama için 10 dk) 3 kez yıkayın.
  3. Etanol konsantrasyonları artan örnekleri dehydrate (%50, 70%, 90%, 95% ve 100% iki kez). 10 dakika boyunca etanol her konsantrasyonda örnekleri batırın.
  4. Numuneleri kritik bir nokta kurutucu (-30 °C, 0,1 Torr) ile kurutun.
  5. Pt (platin) iyon kaplamalı numuneleri katleyin (3 dk için 30 mA; Pt kalınlığı yaklaşık 20 nm' dir).
  6. 5 kV'da SEM örneklerini gözlemleyin.

5. İletim elektron mikroskobu (TEM)

  1. NMJ kültür plaka doku hasat için bir hücre kazıyıcı kullanın. Bir jilet ve jel sarılı parça oluşturmak için jelleşme tarafından tutkal ile küçük bir pelet (3 mm3)içine doku şekli. Jel sarılı parçayı bir gecede 4 °C'de 0,1 M potasyum fosfat tamponunda hazırlanan %2 paraformaldehit ve %2 glutaraldehit ile sabitle.
  2. Örnekleri oda sıcaklığında 0,1 M potasyum fosfat tamponuna (her yıkama için 15 dk) batırarak 3 kez yıkayın.
  3. Çift distile H2O oda sıcaklığında 1 saat için hazırlanan% 1 osmiyum tetroksit ile örnekler postfix.
    DİkKAT: Bu adım kimyasal bir başlık içinde yapılmalıdır.
  4. Adımı 5.2'yi tekrarlayın.
  5. Etanol konsantrasyonları artan örnekleri dehydrate (%50, 70%, 90%, 95% ve 100% iki kez). 10 dakika boyunca etanol her konsantrasyonda örnekleri batırın.
  6. % 100 etanol aspire. Epoksi reçine hacmi artan hacim oranları ile% 100 etanol karışımları (1:3, 1:1 ve 3:1) için örnekleri sızma. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca 10 rpm'de her karışımı hafifçe karıştırın.
  7. Epoksi-etanol karışımını saf epoksi reçine ile değiştirin ve oda sıcaklığında 4 saat boyunca 10 rpm'de hafifçe çalkalayın.
  8. 4 saat sonra, taze epoksi reçine ile epoksi reçine yenileyin ve oda sıcaklığında geceleme 10 rpm hafifçe ajite.
  9. Numuneleri taze epoksi reçine ile gömme kapsüllerine yerleştirin ve numuneleri bir gecede 65 °C'de bir fırında tedavi edin.
  10. Ultramikrotomi
    1. Doğru yönlendirme için numune bloklarını bir diseksiyon mikroskobu altında kaba bir şekilde kırpın.
    2. Pürüzsüz yüzeyler elde etmek için ultramikrotom üzerinde cam bir bıçakla iri kesilmiş blokları ince bir şekilde kırpın.
    3. Bir elmas bıçak ile iyi kesilmiş bloklardan 70 nm ultraince bölümler hazırlayın. 200 örgü karbon formvar kaplı bakır ızgaralı ultra ince bölümleri alın.
    4. Çift distile H2O'da hazırlanan doymuş uranyal asetat içeren ultra ince kesitleri 30 dakika boyunca lekelendirin ve ızgaraları 3 kez çift distile H2O (her yıkama için 10 dk) ile yıkayın.
    5. Ayrıca, ultraince bölümleri Reynold'un kurşun sitrat19 (%2,5) ile kontrast 5 dakika boyunca ve haşlanmış H2O ile yıkanan önceden oda sıcaklığına 3 kez (her yıkama için 10 dk) önceden soğutulmuş. Bölümlerde CO2 yağışını önlemek için boyama alanının etrafına birkaç sodyum hidroksit pelet koyun.
  11. TEM'in ultra ince bölümlerini 70 kV'da gözlemleyin.

6. Kas kasılması ve curare tedavisi

  1. Myotube daralmasını tetiklemek için, 2.3 adımda kültür ortamına 25 mM CaCl2 ekleyin. Miyotubeların hareketi 1\u20122 dk.da görülebilir.
  2. 6 kuyulu plakayı ters bir mikroskopun sahnesine yerleştirin. Canlı hücre mikroskobu ile miyotube kontraksiyonunun bir filmini kaydedin.
  3. Myotube kontraksiyonu durdurmak için kültür ortamına curare ekleyin (300 ng/mL). Sonra filmi adım 6.2 olarak kaydedin.
  4. Hareket vektör analiz yazılımı ile film dosyasını açın ve filmi analiz etmek için Hareket Analizi düğmesini tıklatın.
    NOT: Miyotubes daralması zaman hareketi grafiği olarak gösterilir. Filmler miyotubeların hareket hızını göstermek için renk kodludur. Renk kodlu ışıltılı sinyaller, kırmızı rengin en hızlı hareket hızını gösterdiği miyotubeların hareketlerini ve mavi rengin en yavaş hareket hızını gösterir.

Sonuçlar

Farklılaşma stratejimizi kullanarak kültür, 30. NMJ bileşenleri tek bir kuyuda indüklenmiş ve iyi gelişmiş, morfolojileri ve NMJ'deki konumları IF mikroskobu ile gösterilmiştir(Şekil 1). Şekil 1A'daki akış şeması NMJ farklılaşma ilerlemesinin zaman seyrini özetler. Nörofilamentlerin (NF), sinaptik veziküllerin (SV2) ve AChR(Şekil 1B,C)boyanışı nöronları gösterir. NF ve SV2'nin tek boyama görüntüleri Ek Şekil 1'degösterilmiştir. Alfa-bungarotoksin boyama AChR gösterir (Şekil 1C). Birleştirilmiş görüntü NMJ bir motor nöron ve AChR göreli konumlarını gösterir (Şekil 1D,E). IF boyama ikinci seti Tuj1 ve Adacık 1 tarafından motor nöron gösterir(Şekil 1G,H) ve miyozin ağır zincir tarafından post-sinaptik miyotüpler(Şekil 1I). Schwann hücreleri de NMJ kültüründe S-100 antikor ile etiketlenmiştir(Ek Şekil 2).

NMJ bileşenlerinin kimliklerini daha fazla doğrulamak için ayrıntılı morfolojik analiz için SEM'i kullandık. Genişletilmiş akson terminalleri, aksonlar ve kas lifleri ile Olgun NMJ morfolojisi Şekil 2Agösterilmiştir ,B. TEM, sinaptik veziküllü pre-sinaptik akson terminali ve sinaptik yarık ile ayrılan post-sinaptik kısmı da içeren NMJ bileşenlerinin olgun ultrayapısını ortaya çıkarmak için yapılmıştır (Şekil 2C\u2012E). Kavşak kıvrımları, nöron ve kas liflerinin birleştiği yer olan sarı kesik çizgi ile gösterilir (Şekil 2C). Sinaptik veziküller içeren olgun akson terminalleri Şekil 2D,E (sarı oklar) olarak gösterilmiştir. Morfolojik sonuçlar NMJ bileşenlerinin iyi indüklenmiş ve olgunlaşmış olduğunu göstermektedir.

In vitro NMJ'nin işlevini değerlendirmek için motor nöronu CaCl2 ile uyararak miyotube kontraksiyonlarını tetikledik. Sonuçlar Ca2 + kas kasılmaları tetikleyebilir gösterdi. Kasılmalar curare ile kesilebilir. NMJ curare tedavisi ile kaybolan belirgin hareket sinyalleri gösterdi (Şekil 3). Bu etki, motor nöron sinyallerinin kas kasılmasını tetiklemek için NMJ aracılığıyla iletildiğidoğrular. IF mikroskopi, SEM ve TEM verileri birlikte ele alındığında, yukarıda açıklanan protokol ile oluşturulan in vitro NMJ'de NMJ bileşenlerinin mekansal dağılımı, morfolojisi ve olgunluğunu göstermiştir. Hareket analizi in vitro NMJ işlevini doğruladı, hangi terapötik stratejiler geliştirmek için potansiyel uygulama anlamına gelir.

figure-results-2922
Şekil 1: NMJ indüksiyonu ve NMJ kültürünün IF görüntüleri için akış grafiği. (A) NMJ farklılaşma ilerlemesi için bir akış grafiği. (B\u2012F) NMJ bileşenlerinin, nörofilamentlerin (NF), sinaptik veziküllerin (SV2) ve AChR'nin saptanması. D panelindeki beyaz oklar NMJ'yi gösterir. (G\u2012K) NMJ'nin pre-ve post-sinaptik bileşenleri. Tuj1 ve Islet1 motor nöron gösterir, ve miyozin ağır zincir (MYH) miyotube gösterir. a-BTX, alfa-bungarotoksin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3753
Şekil 2: Olgun NMJ SEM ve TEM görüntüleri. (A) NMJ bileşenlerinin mekansal dağılımı kas lifi (Mf) yüzeyinde demirlemiş akson terminalini gösterir. (B) NMJ'nin daha yüksek büyütmesi akson terminallerini gösterir. (C) Pre-sinaptik akson terminali (kırmızı ok başları) ve sinaptik veziküller (Sv), sinaptik yarık (Sc) ve post-sinaptik parçalar (kırmızı oklar) ile olgunlaşmış bir NMJ ultrayapısı. Kavşak kıvrımları (jf) sarı kesikli çizgi ile gösterilir. Balta, balta. (D, E) Yüksek büyütme görüntüleri akson terminallerinde sinaptik vezikülleri gösterir (sarı oklar). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4738
Şekil 3: In vitro NMJ myotubes daralma analizi. Miyotubes kontraksiyonu 25 mM CaCl2 solüsyonu (yeşil hat) ile tetiklendi. Kasılmalar curare (sarı çizgi) ile tedavi edildikten sonra inhibe edildi. Ayrıca Ek Film 1 ve Ek Film 2bakın . Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Film 1: Ca++tarafından tetiklenen miyotubes daralma . Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Film 2: Curare tedavisinden sonra miyotubeların çok daha zayıf kasılma gösterilmiştir. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: NMJ kültüründe nörofilamentlerin (NF, beyaz oklar) tek boyama görüntüleri. NMJ kültüründe sinaptik veziküllerin (SV2, beyaz oklar) tek boyama görüntüleri. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 2: NMJ kültüründe S-100 antikor ile etiketlenmiş Schwann hücreleri. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Miyojenik farklılaşma ortamı (MDM)MEM-alfa500mL
100mM 2-ME1117°L
Doksisiklin1μg/mL
Kurtuluş56mL (%10'a kadar)
Kalem/Strep2.5mL
Toplam560mL
100mM 2-mercaptoetanol2-mercaptoethanol7°L
d.d. su993μL
Toplam1000°L
NMJ ortaNörobazal orta (NB)500mL
B271x (50x stok)
BDNF10ng/mL
GDNF10ng/mL
N21x (100x stok)
NT310ng/mL
Kalem/Strep2.5mL

Tablo 1: Orta formülü.

Tartışmalar

Önceki çalışmalarda uzun vadeli kültür,8, 10 ,12,,1313,20gerektiren sofistike yöntemler ile in vitro NMJ oluşumu için yöntemler bildirdin. Bu başarılar in vitro NMJ ilerlemesi yol açar. Ancak, karmaşık metodolojiler NMJ çalışmalarının erişimini engelledi. Protokolümüz, tek bir kuyuda NMJ'leri verimli ve sağlam bir şekilde oluşturmak için ortak kültürden kaçınır. NMJ üç hücre tipleri bizim indüksiyon sistemi gözlendi, miyotüpler de dahil olmak üzere, motor nöronlar ve Schwann hücreleri18. Buna ek olarak, olgun morfoloji ve fonksiyon doğrulandı.

Önceki çalışmamıza dayanarak, ilk hücre yoğunluğu NMJ oluşumu için kritik bir faktördür ve farklı hücre yoğunlukları kültür18NMJs çeşitli sayıda neden. Düşük hücre yoğunluğu (< 1 x 104/cm2)nansinin düşük sayıda indüklenen, NMJ oluşumu için olumsuz. Daha yüksek bir hücre yoğunluğu (> 1 x 105/cm2)hazırlamak çok daha fazla zaman ve kaynak gerektirse de protokolümüzü kullanarak hücre yoğunluğunun 1,5 x 104/cm2 ile 5 x 104/cm2 arasında olmasını öneriyoruz. Bu protokol tarafından oluşturulan NMJ fizyolojik koşulları taklit yakın birden fazla hücre tipleri ile heterojen bir dokudur. Miyotüpler eşit bir kültür çanak dağıtmak için bulunmuştur ama motor nöronlar rasgele görünür, hangi fenomen bir kültürde NMJs düzensiz dağılımı ile sonuçlanır. Bu NMJ homojen kültür sistemleri gerektiren analiz yerine nitel çalışmalar için uygundur. Biz de diğer hücre hatları, eq., H9 (ES hücre hattı)18 ve A11 (iPS hücre hattı, veri gösterilmez) bu protokol tarafından NMJ oluşturmak için kullanılır. NMJ morfoloji ve fonksiyon başarıyla oluşturulabilir. Kültür durumu, yine de, farklı hücre hatları için optimize edilmesi gerekir.

Kimyasal olarak tetiklenen miyotüplerin daralması ve curare bağımlı inhibisyonu, in vitro NMJ'mizin fonksiyonel olduğunu ve pratik tahliller için potansiyel olarak uygulanabileceğini doğruladı. Spontan kas kasılmaları kültür 3\u20124 hafta rastgele gözlendi, ancak iki ay18kadar uzun kültür süresi uzatılarak önlenebilir .

Farklı olgunlaşma aşamalarında in vitro NMJ üretmek için çeşitli stratejiler yayınlanmıştır, ancak sistemimizde oluşturulan in vitro NMJ önemli olgunluk gösterdi, biz kültür sırasında AChR epsilon alt birimlerine gama geçiş gözlemleyebilirsiniz gibi18. Olgunluk in vitro NMJ21ile hastalık modelleme için önemli bir husustur. Sonuç olarak, entegre yapısal bileşenler, olgunluk ve fonksiyon ile bir in vitro NMJ terapötik gelişim için potansiyel kullanım.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Dr. Sakurai'ye 201B7MYOD'yinazilikle sağladığı için teşekkür ederiz. Elektron mikroskobu çalışması Keiko Okamoto-Furuta ve Haruyasu Kohda (Elektron Mikroskobik Çalışma Bölümü, Anatomik Çalışmalar Merkezi, Kyoto Üniversitesi Tıp Fakültesi) tarafından desteklenmiştir. Monoklonal antikor HHMI / Columbia Üniversitesi tarafından geliştirilen, Kalkınma Çalışmaları Hybridoma Bankası elde, Ulusal Enstitüsü Çocuk Sağlığı ve NiH İnsan gelişimi tarafından oluşturulan, ve Biyoloji Bölümü, Iowa Üniversitesi'nde muhafaza. Ayrıca shiori Oshima, Kazuhiro Nakagawa ve Eriko Matsui'ye hareket vektör analizi için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Japonya BilimKAKENHI, hibe numaraları 16H05352 ve 20H03642 (MKS için) için Japonya Derneği finansmanı ile desteklenmiştir; iPS Hücre Araştırma Fonu (CYL ve MKS için); Mochida Memorial Tıp ve Farmasötik Araştırma Vakfı (MKS'ye); Takeda Bilim Vakfı (MKS için); ve Japonya Tıbbi Araştırma ve Geliştirme Ajansı (17935400'den CYL ve MKS'ye ve 17935423'ten MKS'ye) yardım eden hastalığa özgü iPS hücrelerini kullanan İnatçı Hastalıklar Araştırma Programı'ndan bir hibe.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Medium, growth factors and reagentsItemBrandCat. Number
2-mercaptoethanolNacalai tesque21418-42
B27, GibcoGibco12587-001
BDNFR & D Systems248-BD
Cell detachment solution, AccumaxSTEMCELL Technologies#07921
Critical point dryerHitachiES-2030
DoxycyclineTakara631311
ECM, Matrigel (growth factor reduced)Corning356230
GDNFR & D Systems212-GD
Gelation, IP gelGeno StaffPG20-1
Ions coaterJEOLJEC3000FC
iPSC medium, mTeSRSTEMCELL Technologies85850
KnockOut SR (KSR)Gibco10828-028
live cell microscopyNikonEclipse Ti microscope
MEM-alphaGibco12571-071
Motion vector analysis softwareSonySI8000
N2, GibcoGibco17502-048
Neurobasal mediumGibco21103-049
NT3R & D Systems267-N3
Primate ES cell mediumReproCellRCHEMD001
SEMHitachiS-4700
TEMHitachiH7650
Y27632Wako Chemicals GmbH253-00513
AntibodiesBrandCat. NumberDilutions
Molecular ProbesB35450.5 ug/ml
Islet 1DSHB40.2D61/100
Myosin heavy chain (MYH)MilliporeSigmaA4.10251/300
Neurofilaments (NF)MilliporeSigmaMAB52541/500
S-100Abcamab148491/300
Synaptic vesicle protein 2 (SV2)DSHBSV21/50
Tuj1CovanceMMS435P1/1000

Referanslar

  1. Hong, I. H. K., Etherington, S. J. Neuromuscular Junction. eLS. , John Wiley & Sons, Ltd. (2001).
  2. Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).
  3. Jones, R. A., et al. Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
  4. Slater, C. R. The Structure of Human Neuromuscular Junctions: Some Unanswered Molecular Questions. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2183(2017).
  5. Comley, L. H., Nijssen, J., Frost-Nylen, J., Hedlund, E. Cross-disease comparison of amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy reveals conservation of selective vulnerability but differential neuromuscular junction pathology. Journal of Comparative Neurology. 524 (7), 1424-1442 (2016).
  6. Shigemoto, K., et al. Muscle weakness and neuromuscular junctions in aging and disease. Geriatrics & Gerontology International. 10, 137-147 (2010).
  7. Abicht, A., Müller, J., Lochmüller, H. Congenital Myasthenic Syndromes. GeneReviews. , (2016).
  8. Faravelli, I., et al. Motor neuron derivation from human embryonic and induced pluripotent stem cells: experimental approaches and clinical perspectives. Stem Cell Research & Therapy. 5 (4), 87-100 (2014).
  9. Demestre, M., et al. Formation and characterisation of neuromuscular junctions between hiPSC derived motoneurons and myotubes. Stem Cell Research. 15 (2), 328-336 (2015).
  10. Yoshida, M., et al. Modeling the early phenotype at the neuromuscular junction of spinal muscular atrophy using patient-derived iPSCs. Stem Cell Reports. 4 (4), 561-568 (2015).
  11. Vilmont, V., Cadot, B., Ouanounou, G., Gomes, E. R. A system for studying mechanisms of neuromuscular junction development and maintenance. Development. 143 (13), 2464-2477 (2016).
  12. Uzel, S. G. M., et al. Microfluidic device for the formation of optically excitable, three-dimensional, compartmentalized motor units. Science Advances. 2 (8), 1501429(2016).
  13. Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
  14. Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).
  15. Tanaka, A., et al. Efficient and reproducible myogenic differentiation from human iPS cells: prospects for modeling Miyoshi Myopathy in vitro. PLoS One. 8 (4), 61540(2013).
  16. Furlan, A., Adameyko, I. Schwann cell precursor: a neural crest cell in disguise. Developmental Biology. 444, 25-35 (2018).
  17. Jessen, K. R., Mirsky, R. Schwann Cell Precursors; Multipotent Glial Cells in Embryonic Nerves. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12 (69), (2019).
  18. Lin, C. Y., et al. iPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), (2019).
  19. Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).
  20. Steinbeck, J. A., et al. Functional Connectivity under Optogenetic Control Allows Modeling of Human Neuromuscular Disease. Cell Stem Cell. 18 (1), 134-143 (2016).
  21. Bucchia, M., Merwin, S. J., Re, D. B., Kariya, S. Limitations and Challenges in Modeling Diseases Involving Spinal Motor Neuron Degeneration in vitro. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 61(2018).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli imbiyolojisiSay 166iPSC lerin vitro n rom sk ler kav akmotor n ronSchwann h cresimiyotube kontraksiyonucurare

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır