JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, ilk olarak Marmorstein, Peachey ve meslektaşları tarafından 2000'li yılların başında tanımlanan DC-ERGs olarak bilinen bir tekniği kullanarak farelerde retina pigment epitelinin (RPE) ışık uyarılmış elektriksel tepkilerini kaydetmek için bir yöntem saklı tutuyoruz.

Özet

Retina pigmentepiteli (RPE), fotoreseptörlerin genel sağlığını ve yapısal bütünlüğünü koruyan retina ve korokapiller arasında stratejik olarak bulunan özel bir tek hücre katmanıdır. RPE polarize, apically ve bazal bulunan reseptörleri veya kanalları sergileyen, ve su vektörel taşıma gerçekleştirir, iyonlar, metabolitler, ve çeşitli sitokinler salgılar.

RPE fonksiyonunun in vivo noninvaziv ölçümleri doğrudan birleşen ERG'ler (DC-ERGs) kullanılarak yapılabilir. DC-ERG arkasındaki metodoloji Marmorstein, Peachey ve meslektaşları tarafından özel olarak inşa edilmiş bir stimülasyon kayıt sistemi kullanılarak öncülük edildi ve daha sonra ticari olarak kullanılabilir bir sistem kullanılarak gösterdi. DC-ERG tekniği, fotoreseptör aktivitesi nedeniyle alt retinal alandaki ışık uyarılmış konsantrasyon değişikliklerinden kaynaklanan RPE'nin yavaş elektriksel tepkilerini ölçmek için Hank'in tamponlu tuz çözeltisi (HBSS) ile dolu cam kılcal damarlar kullanır. Dc-ERG kaydının uzun süreli ışık uyaranları ve uzunluğu, onu sürüklenmeye ve gürültüye karşı savunmasız hale getirerek kullanılabilir kayıtların düşük verimine neden olur. Burada, HBSS ve elektrot tutucunun gaz dan kaynaklanan kabarcıkları azaltmak/ortadan kaldırmak için vakum basıncı nı kullanarak gürültüyü azaltırken kayıtların stabilitesini artırmak için hızlı ve güvenilir bir yöntem salıyoruz. Ayrıca, güç hattı eserler bir voltaj regülatörü / güç kremi kullanılarak zayıflatılır. Ticari olarak kullanılabilen bir ERG sistemi için gerekli ışık stimülasyon protokollerini ve DC-ERG bileşenlerinin analizi için komut dosyalarını içeririz: c-dalgası, hızlı salınım, ışık tepe ve kapalı yanıt. Kayıtların kolaylığı ve hızlı analiz iş akışı nedeniyle, bu basitleştirilmiş protokol özellikle RPE fonksiyonunda yaşa bağlı değişikliklerin ölçülmesinde, hastalığın ilerlemesinde ve farmakolojik müdahalenin değerlendirilmesinde yararlıdır.

Giriş

Retina pigment epitel (RPE) gözün arka segmentinde çizgi ve retinahomestaz korumak için kritik fonksiyonlar uygulamak özel hücrelerin bir monolayerolduğunu 1. RPE görseldöngü2 denilen bir süreç içinde foton yakalama görsel pigment rejenerasyon tarafından fotoreseptörleri destekler , dış segment ipuçları döken diurnal fagositoz katılarak3, ve fotoreseptörler ve koryokapiller arasında besin ve metabolik ürünlerin taşınmasında 4,5. RPE fonksiyonundaki anormallikler yaşa bağlı makula dejenerasyonu6,Leber'in konjenital amaurosis7,8 ve En İyi vitelliform makula distrofisi9gibi çok sayıda insan retinası hastalığının altında yatan. Donör göz dokuları genellikle araştırma amaçlı sadece elde etmek zor olduğundan, genetik modifikasyonlar ile hayvan modelleri retina hastalıklarının gelişimini incelemek için alternatif bir yol sağlayabilir10,11. Ayrıca, CRISPR cas9 teknolojisinin ortaya çıkması ve uygulanması artık genomik tanıtımlara (knock-in) veya silmelere (knock-out) önceki gen hedefleme teknolojilerinin sınırlamalarını aşan basit, tek adımlı bir süreçte izin vermektedir12. Yeni fare modelleri13 kullanılabilirliği patlama non-invaziv RPE işlevini değerlendirmek için daha verimli bir kayıt protokolü gerektirir.

RPE'nin ışık uyarılmış elektriksel tepkilerinin ölçümü doğrudan birleştirilmiş elektroretinogram (DC-ERG) tekniği ile sağlanabilir. Fotoreseptör (a-dalga) ve bipolar (b-dalga) hücre yanıtlarını ölçen geleneksel ERG kayıtları ile birlikte kullanıldığında14, DC-ERG retinadejenerasyon15ile RPE değişim nasıl tanımlayabilirsiniz,16,17 veya RPE disfonksiyonu fotoreseptör kaybı öncesinde olup olmadığını. Bu protokol, Marmorstein, Peachey ve ilk DC-ERG tekniği 16 ,18,19,20 geliştirilen meslektaşlarının çalışmalarından uyarlanmış bir yöntem açıklar ve tekrarlanabilirlik ve kullanım kolaylığı üzerine geliştirir.

DC-ERG kaydının, herhangi bir kesintinin veya gürültünün tanıtılmasının verilerin yorumlanmasını zorlaştırabileceği uzun satın alma süresi (9 dk) nedeniyle gerçekleşme zordur. Bu yeni yöntemin avantajı, taban çizgilerinin hayvanın anesteziden erken uyanma olasılığını azaltarak ve kılcal elektrotlarda kabarcık oluşumuna daha az yatkın olma olasılığını azaltarak daha kısa bir süre içinde sabit bir duruma ulaşmasıdır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu protokol, Ulusal Göz Enstitüsü Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan hayvan çalışma protokolünde belirtilen hayvan bakım yönergelerini izler.

1. DC-ERG için ışık stimülasyon protokollerinin ithal edilmesi

NOT: DC-ERG ışık stimülasyon protokollerini ERG sistem yazılımına(Malzeme Tablosu)almak için aşağıdaki yönergeleri izleyin. Protokol 0,5 dk ön uyaran aralığından oluşur, ardından 7 dk için bir ışık (10 cd/m2)ve 1,5 dk uyarıcı sonrası aralıkla sona erdir. 10 cd/m2 ışık yoğunluğu (1 log10 cd/m2)WT farelerde DC-ERG'nin tüm bileşenleri için maksimal tepkinin yaklaşık yarısını çağrıştırdığından seçildi18,21. Bu elektriksel yanıtların kökenleri iyi karakterize ve izole edilebilir ve daha fazla in vitro RPE modelleri (örneğin, iPSC-RPE) incelenebilir gibi c-dalga ve hızlı salınım özellikle ilgi vardır. Diğer ışık yoğunluklarının uygulanması ek bilgi ayıklayabilir, örneğin, kapalı tepki parlak ışık uyaranlarında polaritenin tersine dönmesine uğrar ve bu geri dönüşün gerçekleştiği yoğunlukta farklılıklar gösterebilir. Kullanıcı kendi takdirine bağlı olarak ışık yoğunluğu ayarlarını değiştirmekte serbesttir.

  1. ERG sistem yazılımını açın.
  2. Veritabanı Merkezi'netıklayın.
  3. Yeni'yi tıklatın (yeni bir veritabanı dosya adı sağlayın). Kaydet'etıklayın. Açılır pencere görüntülenir: "Veritabanı oluşturuldu, yeni veritabanı dosyasına bağlanmak istiyor musunuz." Evet'etıklayın. Geçerli veritabanı adı artık yeni dosya adını yansıtmalıdır.
  4. Veritabanı Denetim Merkezi Penceresinde Niçin Aktar'ı tıklatın.
  5. Ek Dosya 1: LightProtocols - TRANSFER'i seçin. EXP. Aç'atıklayın.
  6. İlerleme çubuğu tamamlandıktan sonra Kapat 'a (Veritabanı Denetim Merkezi) tıklayın.
  7. Yeşil Başlat düğmesine tıklayın.
  8. Hasta Seç Penceresinde Yeni'ye tıklayın. Fare modelini açıklayan yeni bir hasta aile adı oluşturun, doğum tarihini girin (DOB, mm/dd/yyyy), cinsiyet (M/F) düğmesini uygun açıklamaya takla. Deneysel ayrıntıları kaydetmek için Kapat'a tıklayın.
  9. Protokoller'etıklayın. Karanlık uyarlanmış ERG ve DC-ERG protokolleri artık görünür olmalıdır.
  10. Son olarak, Uzun Flash.col dosyasını aşağıdaki klasöre yerleştirin C:\ERG Kullanıcı Dosyaları\Uzun Flash.col.

2. Kılcal elektrot hazırlama

  1. 1,5 mm'lik cam kılcal damarları seramik karo(Malzeme Tablosu)kullanarak ikiye bölün ve camın fiziksel karşı güç sağlamak ve camını stabilize etmek için bir masa kullanarak temiz bir şekilde kırın.
    NOT: Blunt kesme gerektiği gibi biter.
  2. Bir Bunsen brülör kullanarak(Malzeme Tablosu)Forceps ile alev üzerinde tutarken ısı kılcal küçük bir viraj yapmak için izin verir.

3. Kapiller elektrotların doldurulması

  1. Vakum kurutucuyu laboratuvar vakum hattına bir satır içi filtre(Malzeme Tablosu)ile bağlayın.
  2. Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi'nden (HBSS) (Malzeme Tablosu) 30 mL'lik kısmını açık 50 mL konik bir boruya dökün ve vakum odasına (kapak çıkarılmış şekilde) yerleştirin.
  3. Bilgisayarı ve kayıt ekipmanını açarken vakumu açın ve HBSS'yi gazdan arındırın.
  4. 5\u201210 dk sonra vakum kapatın ve eklenmiş bir 25 G iğne ile 12 mL şırınga doldurmak için gazsız HBSS kullanın. Kabarcıklar tanıtmak için ekstra önlem alarak elektrot sahiplerinin tabanları doldurmak için kullanın.
    1. Bunu yapmak için, dişli vida kapağını çıkarın ve şırınga iğnesini silikon kauçuk contanın içinden geçirerek tutucunun arka duvarına (gümüş/gümüş klorür peleti) ulaşın.
      NOT: Gümüş/gümüş klorür peletleri, daha fazla yüzey alanı sağladığından gümüş tel kullanan tutuculara göre avantajlıdır ve bu da düşük gürültülü sabit bir taban çizgisi sağlar. Ancak, gümüş / gümüş klorür pelet iyi bir bağlantı elde etmek için hava kabarcıkları ücretsiz bir sıvı arayüzü gerektirir. Bu nedenle, bu işlem sırasında hava kabarcıkları tanıtmak için büyük özen.
    2. Şırınga iğnesini yavaşça geri çekerken tüm mikroelektrotı doldurmak için HBSS'yi yavaş yavaş enjekte edin. Dişli kapağı yeniden takın, ancak sıkmayın. HbSS ile kap içindeki boş alanı doldurmak için şırınga iğnesini yeniden yerleştirin. Daha sonra çözeltinin diğer ucundan kaçmasını önlemek için yatay tutarken cam kılcal damarı doldurun.
    3. Bükülmüş ucundan cam kılcal tutun ve yavaş yavaş gevşetilmiş kapak üzerinden ters ucunu takın ve sonra yerine vida kapağı sıkın.
      NOT: HBSS ile dolu cam elektrotlar farenin gözünün yağlamasını korur ve standart altın döngü elektrotlarının kullanımı ile oluşacak kornea dehidratasyonunu önler.
  5. Kabarcıkların dışarı akmasını sağlamak için elektrot tutucuları yukarı doğru eğilmiş kılcal elektrotlarla yerleştirin. Degas için 5\u201210 dk için vakum çalıştırın. Cam ve plastik yüzeylerden kaçan gaz HBSS'yi elektrot tutucularından dışarı itecektir.
  6. Durun ve sonra yavaşça vakum bırakın. Elektrot tutucuları ve cam kılcal damarları daha önce açıklandığı gibi yeniden doldurun.
    NOT: Kabarcıklar silikon kauçuk conta üzerinde veya yakınında toplamak eğilimindedir ve aynı zamanda dişli kapağın oluklar gizleyebilirsiniz, bu nedenle özel dikkat bu alanlarda kabarcıksız tutmak için ödenmelidir.
  7. Mikroelektrot tutucuyu özel yapım T-klips/Manyetik bilyalı eklem standına(Şekil 1A, inset) takın ve sabitleştirin. Mikroelektrot tutucu için özel stand yapmak için, bir tarafta siyah poliasettal klipsleri kaldırarak bir T-klips (5/16"-11/32" OD Tüp) #8(Malzeme Tablosu)değiştirin. Manyetik top eklemlerinin silindir tabanının yüksekliği ayarlamak için yarıya indirilmiş olmasını sağlar(Malzeme Tablosu). Modifiye Edilmiş T klipslerini M3 boyutlu somunlarla manyetik top montaj vidalarına sabitle.
  8. Mikroelektrot tutucuyu modifiye edilmiş T-klipsin içine yerleştirin ve pamuk uçlu bir temizleme çubuğunun(Malzeme Tablosu)kırılmasından yapılmış yaklaşık 1 inçkonik ahşap sapı bir açıyla kaydırarak sıkıca yerinde tutun. Özelleştirilmiş elektrot tutucu standını 180° eksende 360° döndürme sağlayan sahnenin metal plakasına güvenli bir şekilde konumlandırmak için nadir toprak mıknatıslı silindir tabanını kullanın.

4. Test elektrotları

  1. HBSS'yi küçük bir kap içine dökün (örn. 50 mL konik tüpün kapağı).
  2. Elektrotları önceden dengelemek ve iğne toprak elektrotunu (kuyruk/arka bacak) ve Ag/AgCl sinterlenmiş pelet referans elektrotunu (ağız) devreyi tamamlamak için aynı HBSS'ye yerleştirmek için HBSS içeren kapağın içine hbss dolgulu kılcal mikroelektrotları yavaşça indirin(Şekil 1A).
    NOT: Loş kırmızı ışık altında sonraki tüm adımları gerçekleştirin. Fareyi ve kılcal elektrotları konumlandırmak için kırmızı ışıklı el feneri kullanın. Kayıt başlamadan önce tüm ışık kaynaklarını tamamen kapatmayı unutmayın.
  3. Test edilecek fareyi tanımlamak için uygun bir tanımlayıcı (aile adı) seçin ve aşağıdaki sıraya göre kaydı tamamlayarak gerçekleştirilecek DC-ERG protokolünü seçin.
    1. Protokoller'etıklayın. DC-ERG'yiseçin. Çalıştır'atıklayın. Bir iletişim kutusu açılır: "Mevcut hasta XXX [DOB: XX /XX/XX) Bu test yapılması için doğru mu?" Evet'etıklayın. Daha sonra "Adım 1/6"ya geçin.
  4. Faraday kafesinin kapılarını kapatın.
  5. Empedans'a tıklayarak empedans modunu görüntüleyin ve ağız referansı, kuyruk zemini ve kayıt elektrotlarının değerlerinin kabul edilebilir olduğunu doğrulayın (Bkz. Şekil 1B).
  6. Adım 4/6 "Uzun Flaş No Light" seçmek için Adım (ileri ok) tıklayarak taban çizgisi kararlılığını (gürültü ve sürüklenme) test edin.
    NOT: Elektrotlar HBSS banyosuna yerleştirildiğinde gözlenen sürüklenme miktarı, stabilize edildikten sonra 80 s'de genellikle 500 μV'den daha azdır ve elektrotlar fareye bağlandığında gözlenen sürüklenmeye eşdeğerdir. Bu nedenle HBSS banyosundaki elektrotların elektriksel olarak okunması elektrotların durumunun önemli bir göstergesidir. Tepeden tırnama olarak ölçülen gürültü genellikle ~ 10\u201215% HBSS banyo daha fare daha büyüktür. Bu muhtemelen nefes hareket eserlerinin eklenmesi nedeniyle.
  7. Önizleme'yetıklayarak izlemeleri görüntülemeye başlayın. İzler, tepeden tırnağa genlik <200 μV ile düşük gürültülü olmalıdır. Yavaş yavaş taban çizgisine doğru solan hafif bir sürüklenme (<500 μV/80 s) kabul edilebilir (Şekil 1C).

5. Fare ve elektrot konumlandırma

  1. Fareleri karanlık adaptasyon için iyi havalandırılmış, ışık geçirmez bir kutuda bir gecede saklayın.
  2. Ketamin intraperitoneal enjeksiyon (80 mg /kg) ve ksilazin (8 mg/kg) ile hayvanları anestezik.
  3. Korneayı anestezik etmek için %0.5 proparacaine HCl damlası, gözbebeklerini dilate etmek için %2.5 fenilefrin HCl ve %0.5 tropikamid uygulayın.
  4. Kayıt sırasında cam kılcal elektrik elektrotları rahatsız önlemek için yanlışlıkla seğirme önlemek için makasla fare bıyıkları kırpın.
    NOT: ERG sistemi içindeki DC-ERG uyarıcı protokolü, Step (ileri ok) veya Step (geri ok) tıklayarak seçilebilecek birkaç yerleşik uyarıcı yordamı vardır. DC-ERG kaydını hazırlamak ve gerçekleştirmek için yazılımdaki yalnızca 1, 4 ve 5 adımları gereklidir.
  5. ERG sistem yazılımında doğru hastanın seçildiğini doğrulayın. Yeşil Protokoller düğmesine tıklayın. Protokol Açıklaması altında DC-ERG'yi seçin. Ardından Çalıştır'atıklayın. Evet'etıklayarak bunun doğru test olduğunu doğrulayın.
  6. Empedanstaki değişiklikleri gözlemlerken fareve elektrotları konumlandırmaya yardımcı olmak için kubbenin içindeki kırmızı ışığı açmak için Adım 1/6 belirlenmiş Kırmızı Işık uyarıcısını kullanın.
  7. Fareyi ısıtmalı bir kayıt masasına yerleştirin ve forceps kullanarak arka bacağın derisini dikkatlice çadırkurun. İğne elektrodu bir elinizle sıkıca tutun ve yerine sabitlemek için arka baceğe deri altına yerleştirin.
  8. Referans Ag/AgCl elektrotunu(Malzeme Tablosu)ağzın içine yerleştirin, böylece sinterlenmiş pelet arka yanak boyunca durun ve dişlerin arkasında yerinde tutulur.
    NOT: Altın tel elektrotlar ağız referans elektrodu olarak kullanılmamalıdır, çünkü farklı empedans özelliklerine sahiptirler ve tepeden tepeye gürültüyü arttırırlar.
  9. Farenin gözüne kılcal elektrotlar yerleştirmeden önce, cam kılcal damarlar dikey elektrot tutucu tutun, tanıtıldı olabilir herhangi bir kabarcıklar kaldırmak için işaret parmağı ile elektrot tutucu flick. Ucunu şırıngaya bağlı 25 G iğne kullanarak HBSS ile doldurun ve ucunda sıkışmış hava kabarcığı olmadığından emin olun. Elektrot tutucu duruşunu, HBSS dolgulu kılcal damarların açık ucunukorayla hassas bir şekilde temas edebilecek şekilde yerleştirin.
  10. Yağlayıcı göz jeli dağıtıcısını ters tutarak hava kabarcıklarının ortaya konmasını önlemek için özel önlem alın ve ilk damlaları atın. İletkenliği korumak ve kayıt sırasında kurutmayı önlemek için her göze bir damla yağlayıcı göz jeli yerleştirin.

6. DC-ERG kaydı

  1. Adım 4/6 "Uzun Flash No Li" seçmek için Adım (ileri ok) tıklayın.
  2. Empedancetıklayın. Sol ve sağ gözlerin dirençlerini incelemek için Empedans Kontrol ekranını kullanın. Her gözdeki kayıt elektrotlarının empedans değerlerinin benzer olması beklenmektedir (~39 kΩ). Hem zemin hem de referans elektrotlar için empedans değerlerinin 10 kΩ'den az olması beklenmektedir).
  3. Sol ve sağ gözün izlerini görüntülemek için Önizleme'yi tıklatın. Kararlı bir taban çizgisinin elde edilebisini bekleyin (<10 dk). İzleme önizlemesini çıkmak için Durdur'a tıklayın.
    NOT: Kayıttaki sürüklenme yönündean ani değişiklikler veya anormal gürültü zamanla düzelmez ve dikkat gerektiren kılcal elektrotun tanımlanmasını gerektirir. En olası nedeni elektrot ucuna tanıtılan bir kabarcık olduğunu. Ucu HBSS ile doldurun. Taban çizgisini kontrol etmek için Önizleme'yi yeniden tıklatın.
  4. Adım 5/6 "Uzun Flash 10 cd 7 dk" seçmek için Adım (ileri ok) tıklayın.
  5. Kaydı başlatmak için Çalıştır'ı tıklatın (Şekil 1D).

7. Veri ihracatı

  1. Dışa aktabilmek için fare kaydını açıklayan "Hasta" (Aile Adı) seçeneğini belirleyin.
  2. Eski Testler'etıklayın.
  3. Protokol Açıklaması altında DC-ERG'yiseçin. Daha önce edinilen verileri yüklemek için yeşil Yük düğmesini tıklatın.
  4. Adım 5/6 "Uzun Flash 10 cd 7 dk" ilerlemek için Adım (ileri ok) tıklayın.
  5. İhracat'atıklayın.
  6. Dosya adını sağlayın (örn. dosya adı.csv). Geçerli bir dosya adı bir harfle başlamalı ve ardından harfler, sayılar veya alt çizerler olmalıdır. Özel karakterler veya tireler kullanmayın. Veri analizi programı (DCERG_Analysis.exe) tablo girişlerini değişken adları gereksinimlerini karşılamasını gerektirir.
  7. Veri Tablosu'nunyanına bir onay işareti yerleştirin. Ayırıcının yanında Sekme'yiseçin. Seçeneklerin yanına onay işaretlerini yerleştirin(Başlıklar, Dikey), Tümleri (Adımlar, Chans, Sonuçlar), Veri Sütunları (İçerikler, Sonuçlar, Süpürler) ve Biçim (Dosya) içerir.
  8. Daha sonra Dışa Aktarma (Şekil 1E)üzerine tıklayın. Bu, *.csv dosyasını C:\Multifocal klasörüne kaydeder.

8. Veri analizi

  1. Uygun çalışma zamanı yükleyicisini indirin ve kurun (Malzeme Tablosu)
  2. DCERG_Analysis.exe yükleyicisini indirin ve kurun.
    NOT: Bu, DC-ERG bileşenlerinin çözümlemesi gerçekleştirecek komut dosyası yükler ve Başlat Menüsü klasöründe programı çalıştırmak için bir kısayol oluşturur.
  3. Başlat Menüsü > Programlar klasöründe oluşturulan kısayolu tıklatın.
  4. Çözümleme için dışa aktarılan veri dosyasını veya dosyalarını (*.csv) seçin. Birden fazla dosya seçmek için fareye ctrl + sol tıklayın kullanın.
    NOT: Çalıştırılabilir dosya iki tür çizim oluşturur: 1) ham veri ölçülen sürüklenme gösteren en iyi uyum satırı ile çizilir; 2) sürüklenme düzeltilmiş yanıt hareketli bir ortalama (~ 5 s bir açıklık ile) ile düzeltildikten sonra çizilir. Bu çizimden DC-ERG bileşenlerinin genlikleri ve zirveye doğru zaman ları tanımlanır: c dalgası, hızlı salınım, ışık tepe noktası ve kapalı yanıt. Veriler daha sonra her sayfanın farklı bir fare kaydına karşılık geldiği excel'e tablo biçiminde dışa aktarılır. Bu sayfaları iki özet sayfası takip eder: (i) derlenmiş DC-ERG genlikleri (mV); (ii) dc-ERG zaman-to-peaks (ışık başlangıçlı, t = 0 dk) derlenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Şekil 2 miR-204 ko/ko cre/+ (koşullu KO) ve yabani tip (WT) farelerden alınan örnek bir veri kümesidir. MiR-204 ko/ko cre/+ retinapigment epitelinde mikroRNA 204'ün koşullu nakavtı olan farelerdir. Bu fareler floxed miR-204 fareler (NEIGEF tarafından üretilen)22 VMD2-CRE fareler23ile geçerek oluşturulur. MiR-204, sıkı kavşak bütünlüğünü koruyan epitel fonksiyon için kritik proteinlerin ekspresyonunu (örneğin, claudins), ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Kritik Adımlar

İyi bir DC-ERG kaydı, gaz giderme ve sıcaklık değişikliklerine karşı son derece hassas oldukları için, artefakt ve istenmeyen sürüklenme yaratan kabarcıklardan arınmış kararlı elektrotlar gerektirir. Fare kaydıyla ilerlemeden önce elektrotlar HBSS banyo çözeltisine yerleştirildiğinde kararlı bir taban çizgisine ulaşılması esastır. Küçük kabarcıklar kılcal elektrot tabanında veya silikon conta etrafında toplamak eğilimindedir...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma NEI intramural fonlar tarafından desteklenmiştir. Yazarlar içtenlikle onun bilimsel rehberlik, teknik tavsiye ve RPE fizyolojisi ve hastalığı uzmanlığı için Dr Sheldon Miller kabul. Yazarlar Megan Kopera ve fare kolonileri yönetmek için hayvan bakım personeli teşekkür ve Dr Tarun Bansal, Raymond Zhou, ve Yuan Wang teknik destek için.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Ag/AgCl (mouth) ElectrodeWPI IncEP1Mouth reference electrode for mouse
Ceramic TileSutter InstrumentCTSUsed to cut the glass capillary tube to an appropriate size
Cotton Tipped Cleaning StickPuritan Medical Products867-WC No GlueTo be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly
Electroretinogram (ERG) SystemDiagnosys LLCE3 SystemVisual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials
Bunsen BurnerArgos TechnologiesBW20002460Or equivlaent to shape glass under flame
Glass Capillary Tube (1.5 mm)Sutter InstrumentsBF150-75For filling with HBSS and making contact to the cornea
Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS)Thermo Fisher Scientific Inc14175-095Commercially available. Maintain at RT
In-Line FilterWhatman6722-5001To protect vacuum pump from aerosols
Low Noise Cable for Microelectrode HoldersWPI Inc5372Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies
Magnetic Ball JointWPI Inc500871For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage
MatLabMathworksMatLab: For editing the analysis software
MatLab Curvefit ToolboxMathworksToolbox for MatLab (only required for editing the analysis software)
MatLab CompilerMathworksToolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software)
MatLab Runtime version 9.5MathworksR2018b (9.5)Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html
Microelectrode Holders (45 degrees)WPI IncMEH345-15For holding the capillaries
Needle (25 ga)Covidien8881250313For filling the capillary tubes with HBSS
Needle (ground) ElectrodeRhythmlink13mm - one elctrodeSubdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire)
Regulator/Power ConditionerFurmanP-1800Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line
Syringe (12 mL)Monoject1181200777For filling the capillary tubes with HBSS
T-clipCole-Parmer06852-20For electrode holder assembly
Vacuum DesiccatorBel-Art420120000Clear polycarbonate bottom & cover
Pharmacological treatment
Lubricant eye gelAlcon0078-0429-47Helps lubricate corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes
Phenylephrine Hydrochloride 2.5%Akorn17478-201-15Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)
Proparacaine Hydrochloride 0.5%Akorn17478-263-12Local anesthetic for ophthalmic instillation
Tropicamide 0.5%Akorn17478-101-12Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)
XylazineAnaSedsc-362949RxAnalgesic and muscle relaxant
Zetamine (Ketamine HCl)VetOne501072Anesthetic for intramuscular injections

Referanslar

  1. Steinberg, R. H. Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina. Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).
  2. Sahu, B., Maeda, A. RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models. Methods in Molecular Biology. 1753, 89-102 (2018).
  3. Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Experimental Eye Resarch. 126, 51-60 (2014).
  4. Wimmers, S., Karl, M. O., Strauss, O. Ion channels in the RPE. Progress in Retinal Eye Research. 26 (3), 263-301 (2007).
  5. Gundersen, D., Orlowski, J., Rodriguez-Boulan, E. Apical polarity of Na,K-ATPase in retinal pigment epithelium is linked to a reversal of the ankyrin-fodrin submembrane cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 112 (5), 863-872 (1991).
  6. Fletcher, E. L., et al. Studying age-related macular degeneration using animal models. Optometry and Vision Science. 91 (8), 878-886 (2014).
  7. Gu, S. M., et al. Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy. Nature Genetics. 17 (2), 194-197 (1997).
  8. Marlhens, F., et al. Mutations in RPE65 cause Leber's congenital amaurosis. Nature Genetics. 17 (2), 139-141 (1997).
  9. Marmorstein, A. D., et al. the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
  10. Chang, B. Mouse models for studies of retinal degeneration and diseases. Methods in Molecular Biology. 935, 27-39 (2013).
  11. Collin, G. B., et al. Mouse Models of Inherited Retinal Degeneration with Photoreceptor Cell Loss. Cells. 9 (4), (2020).
  12. Shrock, E., Güell, M. CRISPR in Animals and Animal Models. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 152, 95-114 (2017).
  13. Smalley, E. CRISPR mouse model boom, rat model renaissance. Nature Biotechnology. 34 (9), 893-894 (2016).
  14. Benchorin, G., Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Vollrath, D. Assessment of Murine Retinal Function by Electroretinography. Bio Protocol. 7 (7), (2017).
  15. Zhang, C., et al. Regulation of phagolysosomal activity by miR-204 critically influences structure and function of retinal pigment epithelium/retina. Human Molecular Genetics. 28 (20), 3355-3368 (2019).
  16. Samuels, I. S., et al. Light-evoked responses of the retinal pigment epithelium: changes accompanying photoreceptor loss in the mouse. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 391-402 (2010).
  17. Wu, J., Marmorstein, A. D., Peachey, N. S. Functional abnormalities in the retinal pigment epithelium of CFTR mutant mice. Experimental Eye Research. 83 (2), 424-428 (2006).
  18. Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).
  19. Peachey, N. S., Stanton, J. B., Marmorstein, A. D. Noninvasive recording and response characteristics of the rat dc-electroretinogram. Visual Neuroscience. 19 (6), 693-701 (2002).
  20. Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
  21. Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). Journal of General Physiology. 127 (5), 577-589 (2006).
  22. Zhang, C., et al. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. Annual Meeting for the Association for Research in Vision and Ophthalmology. , 3568(2017).
  23. Iacovelli, J., et al. Generation of Cre transgenic mice with postnatal RPE-specific ocular expression. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1378-1383 (2011).
  24. Wang, F. E., et al. MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology. FASEB Journal. 24 (5), 1552-1571 (2010).
  25. He, L., Marioutina, M., Dunaief, J. L., Marneros, A. G. Age- and gene-dosage-dependent cre-induced abnormalities in the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184 (6), 1660-1667 (2014).
  26. Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. Journal of Neurophysiology. 70 (4), 1669-1680 (1993).
  27. Blaug, S., Quinn, R., Quong, J., Jalickee, S., Miller, S. S. Retinal pigment epithelial function: a role for CFTR. Documenta Ophthalmologica. 106 (1), 43-50 (2003).
  28. Gallemore, R. P., Griff, E. R., Steinberg, R. H. Evidence in support of a photoreceptoral origin for the "light-peak substance". Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (4), 566-571 (1988).
  29. Shahi, P. K., et al. Abnormal Electroretinogram after Kir7.1 Channel Suppression Suggests Role in Retinal Electrophysiology. Science Reports. 7 (1), 10651(2017).
  30. Li, Y., et al. Mouse model of human RPE65 P25L hypomorph resembles wild type under normal light rearing but is fully resistant to acute light damage. Human Molecular Genetics. 24 (15), 4417-4428 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

KimyaSay 161DC ERGretinapigment epitelelektroretinogramfare modelic dalgah zl sal n mk tepekapal yan t

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır