JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokolde, RNA-Seq'e dayalı olarak pürin nükleosidazın (PN, EC:3.2.2.1) gen madenciliği ve dizi analizi için bir yöntem tanımlanmıştır. PN'nin benzersiz ikincil ve üçüncül yapılarını göstermek için ProtProm analizi uygulandı. Ayrıca, PN geni, RNA-Seq sonuçlarının güvenilirliğini doğrulamak için transkriptomdan klonlandı.

Özet

Tırtıl mantarı (Ophiocordyceps sinensis), en değerli mantar Geleneksel Çin tıbbından (TCM) biridir ve adenosin gibi bol miktarda aktif bileşen içerir. Adenozin, çeşitli anti-tümör ve immünomodülatör aktivitelere sahip biyolojik olarak etkili bir bileşen olarak kabul edilir. Adenozin biyosentezinde pürin nükleosidaz (PN) mekanizmasını daha fazla aydınlatmak için, PN'yi kodlayan bir gen başarıyla çıkarıldı ve tırtıl mantarının RNA-Seq veritabanına dayalı olarak daha fazla analiz edildi. PN'nin tam uzunluktaki cDNA'sı, 284 amino asidi kodlayan 855 bp idi. BLAST analizi, NCBI'de nükleosit hidrolaz ile %85.06 ile en yüksek homolojiyi gösterdi. ProtProm analizi, bağıl moleküler ağırlığın 30.69 kDa ve izoelektrik noktanın 11.55 olduğunu gösterdi. PN'nin ikincil yapısı Predict Protein tarafından tahmin edildi; Sonuçlar, alfa sarmal yapısının %28.17, iplik yapısının %11.97 ve halka yapısının %59.86 olduğunu gösterdi. Ayrıca, PN geni transkriptomdan daha fazla klonlandı ve doğrulama için agaroz jel elektroforezi ile tespit edildi. Bu çalışma, mantar TCM'sinde adenozin biyosentezinin genetik regülasyonu için daha yeterli bilimsel temel ve yeni fikirler sunmaktadır.

Giriş

Mantar: Geleneksel Çin tıbbı (TCM) bol miktarda tür kaynağına sahiptir 1,2. Tırtıl mantarı (Ophiocordyceps sinensis) iyi bilinen bir mantar TCM'sidir ve yenilikçi ilaçların kaynağı olarak kabul edilir 3,4. Tırtıl mantarı, Hirsutella sinensis'in tırtıl gövdesi üzerinde parazit olduğu güneybatı Çin'deki Tibet platosunda bulunan bir solucan ve mantar karışımıdır5. Şu anda, H. sinensis, moleküler ve morfolojik biyoloji kanıtlarınagöre tırtıl mantarının tek anamorfu olarak rapor edilmektedir 6,7 ve yabani tırtıl mantarına kıyasla daha az ilişkili toksisiteye ve benzer klinik etkinliğesahiptir 8. H. sinensis'in nükleozitler, polisakkaritler ve ergosteroller gibi biyolojik olarak etkili çeşitli bileşenlere sahip olduğu ve karaciğer hasarını onarmak gibi kapsamlı farmakolojik etkilere sahip olduğu ortaya çıkmıştır 9,10,11. Adenozin, tırtıl mantarından izole edilen tipik bir aktif bileşendir ve bir tür pürin alkaloididir12. Adenozinin çeşitli biyolojik aktiviteleri vardır: anti-tümör, antibakteriyel ve immünomodülatör aktiviteler13,14. Ne yazık ki, adenozinin biyosentetik mekanizması ve ilgili anahtar genler hala belirsizdir15,16.

Adenozin esas olarak anti-tümör etkisini tümör mikroçevresindeki immünosupresif etkiler yoluyla gösterir17. Adenozinin, yaralanma sonrası doku onarımını başlatmak ve dokuları aşırı inflamasyona karşı korumak için kritik olan immünosüpresif fonksiyonlar gösterdiği bildirilmiştir18,19. Ayrıca, adenozin aracılı bağışıklığın baskılanmasının, kanser immünosürveyansını ciddi şekilde bozabileceği ve tümör büyümesini teşvik edebileceği gösterilmiştir20. Bu nedenle, anti-tümördeki geniş uygulaması için adenozin biyosentez mekanizmasını incelemek acildir.

İfade edilen genlerin ve ekspresyon seviyelerinin tam bir görünümünün, transkriptom21'in yeni nesil dizilimi ile sistematik olarak yürütülebileceği bildirildi. Ayrıca, aktif bileşenlerin biyosentetik yolunda yer alan genleri tahmin etmek ve farklı biyosentetik yolların etkileşimini daha fazla araştırmak için transkriptom dizilimi ve analizi uygulandı22. Pürin nükleosidaz (PN, EC 3.2.2.1), pürin nükleositlerinin glikozit bağlarını şekerlere ve bazlara23 hidrolize edebilen, pürin nükleositleri için substrat özgüllüğüne sahip bir nükleosidaz sınıfıdır. Tipik olarak adenozin biyosentezinde önemli roller oynar. Fungal TCM'deki adenozinin biyosentetik yolunun tahmin edildiği bildirilmiştir; qPCR ve gen ekspresyonu, artmış adenozin birikiminin PN geninin aşağı regülasyonunun bir sonucu olduğunu gösterdi, bu da PN geninin adenozin biyosentezinde önemli bir rol oynayabileceğini gösterdi15. Bu nedenle, adenozin biyosentezindeki PN mekanizması acilen açıklığa kavuşturulmalıdır. Bununla birlikte, PN'nin dizi bilgisi ve protein yapısı ile mantar TCM'nin adenosin biyosentezinde yer alan diğer anahtar genler daha fazla çalışılmamıştır.

Bu çalışmada, tırtıl mantarının RNA-Seq verilerinden yeni bir PN geni dizisi çıkarıldı ve gen klonlaması ile doğrulandı. Ayrıca, PN'nin moleküler özellikleri ve protein yapısı kapsamlı bir şekilde analiz edildi, bu da adenozin biyosentezinin gen regülasyonu için yeni yönler ve fikirler sağlayabilir.

Protokol

NOT: Laboratuvarımızda tırtıl mantarının (H. sinensis) bir anamorf türü biriktirilmiştir. Escherichia coli (Escherichia coli) DH5, Pekin Çin Tıbbı Üniversitesi, Shenzhen Hastanesi tarafından korunmuştur.

1. RNA-Seq için hazırlık

  1. Misel hasadı
    1. H. sinensis'in fermantasyonu için fermantasyon ortamı hazırlayın: toz mısır unu (% 1), ipekböceği pupası (% 1.5), maya özü (% 0.5), tripton (% 1), glikoz (% 1.5), kepek (% 1.5), dekstrin (% 0.5), KH2PO4 (% 0.02) veMgS04 (% 0.01).
    2. Ölçek büyütme kültürü için% 10 fermantasyon ortamı ile aşılama hazırlayın (100 mL ortam başına 10 mL ortam ekleyin). 10 gün boyunca 150 rpm'de döner bir çalkalayıcı üzerinde 16 °C koşulunda daldırılmış fermantasyon gerçekleştirin.
    3. 10 gün boyunca tırtıl mantarının anamorfunun misellerini eşeysiz olarak çoğaltın ve hasat edin. Fermente ortamı santrifüjleyin ve santrifüjlemeden sonra süpernatanı atın. 3 kez 100 mL ultra saf su ekleyerek miseliyi askıya alın ve süpernatanı santrifüjleme ile çıkarın. Temizlenmiş miselleri sıvı nitrojen kullanarak bir toz haline getirin.
  2. RNA-Dizilimi
    1. Tırtıl mantarının anamorfunun toplam RNA'sını üreticinin protokollerine (Malzeme Tablosu) göre çıkarın ve numuneyi RNaz içermeyen DNaz I (Malzeme Tablosu) ile daha fazla işlemden geçirin.
    2. mRNA'yı toplam RNA PolyATtract mRNA İzolasyon Sistemlerinden izole edin ve üreticinin protokollerine göre oligo(dT) içeren boncuklar kullanarak poli(A) mRNA'yı izole edin (Malzeme Tablosu).
    3. Üreticinin protokollerine göre rastgele heksamer primerleri ile birinci iplikli cDNA'yı sentezlemek için kısa parçaları şablon olarak alın (Malzeme Tablosu). İkinci iplikli cDNA'nın sentezini üreticinin protokollerine göre gerçekleştirin.
    4. Ardından, üreticinin protokollerine göre Ultra RNA Kitaplığı Hazırlık Kitini kullanarak sıralama kitaplıklarını oluşturun (Malzeme Tablosu).
    5. Kısa parçaları üreticinin protokollerine (Malzeme Tablosu) göre PCR ekstraksiyon kiti ile saflaştırın ve sırasıyla EB tamponu ile çözün.
    6. Kısa parçaları (300 bp eşiği) agaroz jel elektroforezinin sonucuna göre sıralama adaptörleri ile bağlayın.
    7. Daha sonra, uygun parçalardan seçilen şablonları kullanarak PCR ile amplifikasyon gerçekleştirin.
    8. Kitaplığı, üreticinin protokollerine göre eşleştirilmiş uç dizileme ile Illumina HiSeq 4000 ile sıralayın. Temiz veri elde etmek için ham dizi verilerinden kirli ham okumaları filtreleyin. Her iki uçta da genişletilemeyen en az N'ye sahip Unigenes'i elde etmek için denovo derlemesini benimseyin.
    9. Unigene dizilerini blastx ile nr, Swiss-Prot, KEGG ve COG (e-değeri 0.00001<) gibi protein veritabanlarına hizalayın. Verilen Unigenes ile en yüksek dizi benzerliğine sahip proteinleri, protein fonksiyonel açıklamalarıyla birlikte alın. RNA-Seq sonuçlarını özetleyin (Materyal Tablosu).
      NOT: Yukarıdaki adımlarda ticari kitler kullanılmış ve tüm işlemler üreticinin protokolüne göre yapılmıştır.

2. Pürin nükleosidazın gen madenciliği

  1. RNA-Seq sonuçlarının dosyalarını bilgisayara indirin. RNA-Seq sonuçlarından birleştirilmiş Unigenes'in açıklama sonuç dosyalarını bulun.
    NOT: Her iki uçta da uzatılamayan en az N'ye sahip diziler elde etmek için iskelelerin boşluk doldurması için tekrar eşleştirilmiş uç okumaları kullanıldı. Bu tür diziler Unigenes olarak tanımlandı. Unigene ek açıklaması, Unigene'in ifadesi ve işlevsel açıklaması hakkında bilgi sağlar.
  2. Ek Açıklama Dosyaları yolunu açın ve arama çubuğuna map 00230 yazın; daha sonra pürin metabolizmasını (map00230) ek açıklama dosyalarının KEGG sınıflandırmasında arayın.
  3. Açıklamalı haritada EC:3.2.2.1 (PN) kırmızı00230'u işaretleyin ve PN'ye açıklamalı birleştirilmiş Unigene'ler olduğunu belirtin.
    NOT: EC numarası 3.2.2.1'e tıklandıktan sonra PN'ye açıklamalı ve açıklamalı harita00230'da gösterilen üç Unigene (Unigene1077, Unigene14697 ve Unigene17827) vardı.
  4. EC numarası 3.2.2.1'e tıklayın ve açıklamalı Unigenes bilgilerini gösterin.
  5. LTFViewer yazılımını açın ve Unigene.fa dosyasını bir Ctrl-O kısayolu ile içe aktarın ve birleştirilmiş Unigenes'in sıra bilgilerini gösterin.
  6. Ctrl-F kısayolunu kullanarak Unigene10777, Unigene14697 ve Unigene17827'nin sıra bilgilerini arayın.
  7. Ctrl-C ve Ctrl-V kısayollarını kullanarak Unigene10777, Unigene14697 ve Unigene17827'nin sıra bilgilerini indirin.
  8. Unigene10777 ve Unigene17827'yi aşırı kısa açık okuma çerçevesi (ORF) dizileriyle ortadan kaldırın.
    NOT: Temel sıra bilgileri LTFViewer yazılımında görüntülenmiştir.
  9. Daha fazla çalışma için uygun ORF uzunluğuna sahip Unigene14697'yi (boyut 1,705 bp, boşluk 0 %0) seçin.

3. Biyoinformatik analiz

  1. PN geninin ORF'sini ORFfinder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/) ile analiz edin.
    1. Sırayı kutuya yapıştırın. Parametreleri aşağıdaki gibi seçin, minimum ORF uzunluğu (nt): 75, genetik Kod: 1. standart, kullanılacak ORF başlangıç kodonu: yalnızca ATG. ORF bilgilerini almak için Gönder düğmesine tıklayın.
  2. Teorik moleküler kütleyi ve izoelektrik noktayı hesaplamak için ProtParam aracını (http://us.expasy.org/tools/protparam.html) kullanın.
    1. Amino asit dizisini (tek harfli kodda) kutuya yapıştırın ve sonuçları elde etmek için Parametreleri Hesapla düğmesine tıklayın.
  3. Sinyal peptitlerini tahmin etmek için SignalP5.0 Sunucusunu (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) uygulayın.
    1. Protein dizilerini FASTA formatında girin. Parametreleri aşağıdaki gibi seçin, organizma grubu: Ökarya, çıktı formatı: Uzun çıktı. Sonuçları almak için Gönder düğmesine tıklayın.
  4. Protein dizilerinin homolojisini analiz etmek için BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) uygulayın.
    1. Protein Blast düğmesine tıklayın ve diziyi kutuya girin. Parametreleri aşağıdaki gibi seçin, veritabanı: Yedekli olmayan protein dizileri (nr), algoritma: blastp (protein-protein BLAST). Sonuçları elde etmek için Blast düğmesine tıklayın.
  5. Farklı mantarlardan PN'nin asit dizilerini hizalamak için Clustal X programını (http://www.clustal.org/) uygulayın.
    1. Bir dosya yükleyin veya dizileri kutuya yapıştırın. Parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın, çıktı formatı: Karakter sayılarıyla ClustalW. Sonuçları almak için Gönder düğmesine tıklayın. Clustal X yalnızca FASTA biçimindeki dosyaları tanıyabilir ve dosyaların yolu yalnızca İngilizce adları içerebilir.
  6. Filogenetik ağacı yürütmek için MEGA 4.0 (https://www.megasoftware.net/mega4/) kullanın.
    1. Yazılımı açın ve dizileri yüklemek için Dosya düğmesine tıklayın. Veri türünü Protein Dizileri olarak seçiniz, bir sonraki adıma geçmek için OK butonuna tıklayınız. Ardından, Filogeni düğmesine tıklayın ve Bootstrap Test Filogenisi'ni seçin ve ardından Komşu Birleştirme Ağacı'na tıklayın. Varsayılan parametreleri seçin ve sonuçları almak için Hesapla düğmesine tıklayın.
  7. PN'nin katalitik alanını tanımlamak için InterProScan'i (http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/) uygulayın.
    1. Sırayı kutuya girin. Varsayılan parametreleri seçin ve sonuçları almak için Ara düğmesine tıklayın.
  8. Protein ikincil yapısını tahmin etmek için Predict Protein'i (http://www.predictprotein.org/) çevrimiçi olarak uygulayın.
    1. Kutuya bir amino asit dizisi (bir harfli kod) girin ve ardından sonuçları elde etmek için predictProtein düğmesine tıklayın.
  9. PN24'ün üç boyutlu yapısını değerlendirmek için Çevrimiçi araçlar SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/) uygulayın.
    1. Modellemeyi Başlat düğmesine tıklayın ve hedef diziyi kutuya yapıştırın. Proje Başlığı ve E-posta bilgilerini doldurun ve sonuçları almak için Şablon Ara düğmesine tıklayın.

4. Gen klonlaması ve rekombinant plazmid yapımı

  1. Ters astarı bir NotI bölgesi içeren ve ön astarı bir EcoRI bölgesine sahip olan tasarım astarları.
  2. Ön astarı şu şekilde gösterin: AGAGAATTCATGACCATGCCAGATTCT (5'–3') ve ters astarı şu şekilde: ATAGCGGCCGCCTAACGCGTGCCGTTAGA (5'–3') by Primer Express.
  3. PN geninin klonlanması için tırtıl mantarının cDNA'sının yanı sıra primerleri de hazırlayın. PCR'yi şu şekilde gerçekleştirin: 95 ° C'de 5 dakika ön denatürasyon, 94 ° C'de 45 saniye denatürasyon, 55 ° C'de 60 saniye renatürasyon, 72 ° C'de 90 saniye uzatma, 35 döngü boyunca tekrarlayın ve 72 ° C'de 10 dakika uzatma.
  4. PCR fragmanlarını elde edin ve doğrulama için agaroz jel elektroforezi ile tespit edin. PCR parçalarını pMD18-T ile bağlayın. PMD18-T'nin ligasyon sistemini aşağıdaki gibi yürütün: 1 μL PMD18-T, 4 μL Çözelti1 ve 5 μL Hedef gen. Koşulları aşağıdaki gibi ayarlayın: 16 saat boyunca 16 ° C'de tutma, 65 ° C'de 15 dakika inaktivasyon.
  5. Rekombinant plazmitleri kullanım kılavuzuna25'e göre yetkili E. coli JM109 hücrelerine aktarın.
  6. Rekombinant pMD18-T / PN plazmitlerini ve vektör ppic9K'yı EcoRI ile sindirin ve I Değil. T4 DNA ligaz ile sindirildikten sonra fragmanları bağlayın.
  7. Daha fazla heterolog ekspresyon için rekombinant plazmid ppic9K/PN'yi oluşturun.

Sonuçlar

PN geninin ORF dizisi 855 bp uzunluğundaydı, bu da hesaplanan moleküler kütlesi 30.69 kDa ve tahmini izoelektrik noktası 11.55 olan 284 amino asidi kodladı, bu da PN'nin alkali bir protein olduğunu gösteriyor. SignalP4.0 Sunucusunun uygulanması, sinyal peptidini tanımlamak için gerçekleştirildi ve sonuçlar, PN'nin sinyal peptidi olmadığını gösterdi. Ayrıca, BLASTP araştırmasının sonuçları, tırtıl mantarından kaynaklanan PN'nin, Purpureocillium li...

Tartışmalar

İnsan sağlığı, tümör, kardiyovasküler ve serebrovasküler hastalıklar gibi bir dizi önemli tıbbi sorunla karşı karşıyadır26,27. TCM, zengin tür kaynakları ve aktif bileşenlerin çeşitli yapısı ve işlevleri nedeniyle yenilikçi tıbbın araştırma ve geliştirme kaynağı olarak kabul edilmiştir28,29. Tırtıl mantarı, Lepidoptera larvaları üzer...

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması bildirmemiştir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31871244, 81973733, 81803652), Guangdong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (2019A1515011555, 2018A0303100007), Shenzhen Sağlık ve Aile Planlaması Komisyonu Vakfı (SZBC2018016), Shenzhen Şehri Longgang Bölgesi Ekonomik ve Teknolojik Kalkınma Özel Fonu (LGKCYLWS2020064, LGKCYLWS2019000361) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
RNase-free DNase ITaKaRa2270B
PolyATtract mRNA Isolation SystemsPromegaIII
Random hexamer-primersThermo ScientificSO142
NEBNext1 Ultra RNA Library Prep KitNEBE7530S
PCR extraction kitQiaQuick
AgaroseTransGen BiotechGS201-01
High-throughput sequencerIlluminaHiSeq™ 4,000
LTF ViewerLTFV5.2
ORF programNCBI
ProtParam toolSIB Swiss Institute of Bioinformatics
SignalP ServerDTU Health Tech5.0
BLASTNCBI
Clustal X programUCD Dublin
MEGACenter for Evolutionary Medicine and Informatics4.0
InterProScanEuropean Molecular Biology Laboratory
Predict ProteinTechnical University of Munich
WISS-MODELSwiss Institute of Bioinformatics
Primer ExpressApplied Biosystems3.0
EcoRINEBR0101V
NotINEBER0591
pMD18-T VectorTaKaRa6011
agaroseSigma-AldrichGS201-01
Trans2K® Plus II DNA MarkerSigma-AldrichBM121-01
6×DNA Loading BufferSigma-AldrichGH101-01
GelStainSigma-AldrichGS101-02
50 x TAESigma-AldrichT1060
Gel imaginganalysis systemSyngeneG:BOX F3
E. coli JM109Promega
T4 DNA ligaseEarthOxBE004A-02
pPIC9KGenlociGP0983

Referanslar

  1. Dong, C. J. The traditional Chinese medicine fungus Cordyceps and its biotechnological production. Research Journal of Biotechnology. 8, 1-2 (2013).
  2. Xia, E. H., et al. The caterpillar fungus, Ophiocordyceps sinensis, genome provides insights into highland adaptation of fungal pathogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 1806 (2017).
  3. Koganti, P., et al. Cordyceps sinensis increases hypoxia tolerance by inducing heme oxygenase-1 and metallothionein via Nrf2 activation in human lung epithelial cells. BioMed Research International. 2013, 569206 (2013).
  4. Shen, C. Y., Jiang, J. G., Li, Y., Wang, D. W., Wei, Z. Anti-ageing active ingredients from herbs and nutraceuticals used in traditional Chinese medicine: pharmacological mechanisms and implications for drug discovery. British Journal of Pharmacology. 174, (2017).
  5. Jiang, Y., Yao, Y. J. Names related to Cordyceps sinensis anamorph. Mycotaxon. 84, 245-254 (2002).
  6. Chen, Y. Q., Wang, N., Qu, L. H., Li, T. H., Zhang, W. M. Determination of the anamorph of Cordyceps sinensis inferred from the analysis of the ribosomal DNA internal transcribed spacers and 5.8S rDNA. Biochemical Systematics and Ecology. 29, 597-607 (2001).
  7. Liu, Z. Y., et al. Molecular evidence for the anamorph-teleomorph connection in Cordyceps sinensis. Mycological Research. 105, 827-832 (2001).
  8. Yu, S. J., Zhang, Y., Fan, M. Z. Analysis of volatile compounds of mycelia of Hirsutella sinensis, the anamorph of Ophiocordyceps sinensis. Applied Mechanics and Materials. 140, 253-257 (2012).
  9. Singh, M., et al. Cordyceps sinensis increases hypoxia tolerance by inducing heme oxygenase-1 and metallothionein via Nrf2 activation in human lung epithelial cells. BioMed Research International. 2013, 569206 (2013).
  10. Cha, S. H., et al. Production of mycelia and exo-biopolymer from molasses by Cordyceps sinensis 16 in submerged culture. Bioresource Technology. 98, 165-168 (2007).
  11. Lin, S., et al. Enhancement of cordyceps polysaccharide production via biosynthetic pathway analysis in Hirsutella sinensis. International Journal of Biological Macromolecules. 92, 872-880 (2016).
  12. Xia, E. H., et al. The caterpillar fungus, Ophiocordyceps sinensis, genome provides insights into highland adaptation of fungal pathogenicity. Scientific Reports. 7, 1806 (2017).
  13. Cha, S. H., et al. Production of mycelia and exo-biopolymer from molasses by Cordyceps sinensis 16 in submerged culture. Bioresource Technology. 98, 165-168 (2007).
  14. Antonioli, L., Blandizzi, C., Pacher, P., Hasko, G. Immunity, inflammation and cancer: a leading role for adenosine. Nature Reviews. Cancer. 13, 842-857 (2013).
  15. Lin, S., Zou, Z., Zhou, C., Zhang, H., Cai, Z. Transcriptome analysis reveals the molecular mechanisms underlying adenosine biosynthesis in anamorph Strain of caterpillar fungus. BioMed Research International. 2019, 1864168 (2019).
  16. Lin, S., et al. Biosynthetic pathway analysis for improving the cordycepin and cordycepic aid production in Hirsutella sinensis. Applied Biochemistry and Biotechnology. 179, 633-649 (2016).
  17. Allard, B., Beavis, P. A., Darcy, P. K., Stagg, J. Immunosuppressive activities of adenosine in cancer. Current Opinion in Pharmacology. 29, 7-16 (2016).
  18. Fredholm, B. B. Adenosine, an endogenous distress signal, modulates tissue damage and repair. Cell Death and Differentiation. 14, 1315-1323 (2007).
  19. Ohta, A., Sitkovsky, M. Role of G-protein-coupled adenosine receptors in downregulation of inflammation and protection from tissue damage. Nature. 414, 916-920 (2001).
  20. Allard, B., Turcotte, M., Stagg, J. CD73-generated adenosine: orchestrating the tumor-stroma interplay to promote cancer growth. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2012, 485156 (2012).
  21. Zhang, Y., Wang, X., Nan, P., Li, J., Jin, L. De novo transcriptome sequencing of genome analysis provides insights into Solidago canadensis invasive capability via photosynthesis. Journal of Plant Interactions. 14, 572-579 (2019).
  22. Liu, Z. Q., et al. Transcriptome sequencing and analysis of the entomopathogenic fungus Hirsutella sinensis isolated from Ophiocordyceps sinensis. BMC Genomics. 16, 106 (2015).
  23. Ogawa, J., et al. Purification, characterization, and gene cloning of purine nucleosidase from Ochrobactrum anthropi. Applied and Environmental Microbiology. 67, 1783-1787 (2001).
  24. Konstantin, A., et al. The swiss-model workspace: a web-based environment for protein structure homology modelling. Bioinformatics. 16, 195-201 (2006).
  25. Chung, C., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 2172-2175 (1989).
  26. Lin, S., et al. Association between aldose reductase gene C(-106)T polymorphism and diabetic retinopathy: A systematic review and Meta-Analysis. Ophthalmic Research. 63, 1-10 (2020).
  27. Peng, Y., et al. Inguinal subcutaneous white adipose tissue (ISWAT) transplantation model of murine islets. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), (2020).
  28. Zhang, T. T., Jiang, J. G. Active ingredients of traditional Chinese medicine in the treatment of diabetes and diabetic complications. Expert Opinion on Investigational Drugs. 21, 1625-1642 (2012).
  29. Lin, S., Zhou, C., Zhang, H., Cai, Z. Expression, purification and characterization of 5'-nucleotidase from caterpillar fungus by efficient genome-mining. Protein Expression and Purification. 168, 105566 (2020).
  30. Kinjo, N., Mu, Z. Morphological and phylogenetic studies on Cordyceps sinensis distributed in southwestern China. Mycoence. 42, 567-574 (2001).
  31. Xiao, J. H., Ying, Q., Xiong, Q. Nucleosides, a valuable chemical marker for quality control in traditional Chinese medicine Cordyceps. Recent Patents on Biotechnology. 7, 2 (2013).
  32. Tu, P., Yong, J., Guo, X. Discovery, research and development for innovative drug of traditional Chinese medicine under new situations. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 40, 3423-3428 (2015).
  33. Zheng, P., et al. Genome sequence of the insect pathogenic fungus Cordyceps militaris, a valued traditional Chinese medicine. Genome Biology. 12, 116 (2011).
  34. Covarrubias, R., et al. Role of the CD39/CD73 purinergic pathway in modulating arterial thrombosis in mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36, 1809-1820 (2016).
  35. Ogawa, Y., Murayama, N., Yanoshita, R. Molecular cloning and characterization of ecto-5'-nucleotidase from the venoms of Gloydius blomhoffi. Toxicon. 54, 408-412 (2009).
  36. Lin, S., et al. Mining and characterization of two novel chitinases from Hirsutella sinensis using an efficient transcriptome-mining approach. Protein Expresion and Purification. 133, 81-89 (2017).
  37. Ueda, M., Hirano, Y., Fukuhara, H. Gene cloning, expression, and X-ray crystallographic analysis of a β-mannanase from Eisenia fetida. Enzyme and Microbial Technology. 117, 15-22 (2018).
  38. Rebets, Y., Kormanec, J., Luzhetskyy, A., Bernaerts, K., Anné, J. Cloning and expression of metagenomic DNA in Streptomyces lividans and subsequent fermentation for optimized production. Methods in Molecular Biology. 1539, 99 (2017).
  39. Wang, S. S., Ning, Y. J., Wang, S. N., Zhang, J., Chen, Q. J. Purification, characterization, and cloning of an extracellular laccase with potent dye decolorizing ability from white rot fungus Cerrena unicolor GSM-01. International Journal of Biological Macromolecules. 95, 920-927 (2016).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Gen Madencili iDizi AnaliziP rin N kleosidazRNA SeqOphiocordyceps SinensisGeleneksel in T bbAdenozinAnti t m r Aktivitelerimm nomod lat r AktivitelerTam Boy CDNAAmino AsitlerBLAST AnaliziN kleosit HidrolazProtProm AnaliziMolek l A rlzoelektrik Noktakincil Yap

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır