Kenopus Embriyonik Hücrelerden Mukosiyaliyer Epitel Organoidler: Nesil, Kültür ve Yüksek Çözünürlüklü Canlı Görüntüleme

Özet

Xenopus laevis embriyolarından izole edilmiş derin ektoderm hücrelerinden mukozisel epitel organoidleri geliştirmek için basit bir protokol uyguluyoruz. Çok güçlü atalar epitel goblet hücre öncüllerini yeniler ler ve organoidlerin yüzeyinde hücre geçişlerinin başlatılmasıve ilerlemesinicanlı olarak izlemesağlarlar.

Özet

Mukoza epitel, mukus üretimi ve silia aracılı açıklık hareketi ile yabancı parçacıkları nisbeten kaldırarak ilk savunma hattını sağlar. Mukozial epiteldeki klinik olarak alakalı birçok kusur, vücudun derinliklerinde meydana geldiği için çıkarılır. Burada, Xenopus laevis embriyolarından mikrocerrahi olarak izole edilen çok güçlü atalardan üretilen mukozier epitel için çekilebilir bir 3D model sokulmuş. Mukozaepiteler organoidler derin ektoderm hücrelerinden yeni üretilen epitel ile kaplıdır ve daha sonra farklı desenli çok katlı hücreler ile dekore edilmiştir, salgı hücreleri, ve mukus üreten goblet hücreleri içinde yerli epidermis ayırt edilemez 24 saat. Organoidlerin apikal yüzeyinde ortaya çıkan mezenkimalden epitele dinamik hücre geçişlerinin tam dizileri yüksek çözünürlüklü canlı görüntüleme ile izlenebilir. Bu in vitro kültürlü, kendi kendini organize mucociliary epitel organoidler nesil yüksek verimlilik ile mucociliary epitel biyolojisi çalışmada farklı avantajlar sunuyoruz, tanımlanmış kültür koşulları, sayı ve boyut üzerinde kontrol, ve farklılaştırılmış epitel rejenerasyon sırasında canlı görüntüleme için doğrudan erişim.

Giriş

Yaralanma, enfeksiyon ve mukoza epitel hastalığı genellikle kronik obstrüktif akciğer hastalığı, astım, kistik fibrozis, bronşektazi ve primer siliyer diskinezi^1,2,3,4gibi pulmoner bozukluklarda bulunan mukus üretimi ve temizliği ile ilişkilidir. Organoid teknolojide yeni bir ilerleme, örneğin, bazal hücre türetilmiş akciğer organoid trakeosfer denilen bu mucociliary epitel rejenerasyon recapitulates tedavi potansiyeli ile umut verici bir model olarak ortaya çıkar^1,5,6. Ancak, kısmen tanımlanmış kültür koşullarının eksikliği ve organoid üretimlerde düşük verimlilik nedeniyle kullanımı şu anda sınırlıdır. Insan hava yolu ve kurbağa epidermisinde mukosiyabil epitel doku morfolojisi, hücresel bileşim ve işlevi^{7,8,9,10,11,12}olarak oldukça benzerdir. Her iki organizmada da mukoza epiteli mukus ve antimikrobiyal maddeler salgılayarak birinci basamak savunma sağlar ve cilianın senkronize eylemi ile zararlı parçacıkları ve patojenleri temizler.

Burada, Xenopus laevis embriyolarının çok güçlü atalarını kullanarak mücociliary epitel organoidler oluşturmak için basit bir protokol açıklar^13,14. Daha önce,¹⁴ ekzojen büyüme faktörleri ve ekstrasellüler matriks yokluğunda, mikrocerrahi erken gastrula evre ektoderm gelen derin hücreler izole kendiliğinden agregalar halinde biraraya, yüzeyinde epitel rejenere, ve mukozi epitel içine olgun içinde çok sayıdave diğer aksesuar hücreleri 24 saat içinde kenetlenme. Hızlı gelişime ek olarak, bu protokol, bozulmamış embriyolar ve ektoderm (ayrıca hayvan kapağı olarak da bilinir)^15,16,17. Üretilen organoidlerin sayısı ve büyüklüğü Xenopus embriyolarından başlangıç malzemeleri kontrol edilerek yüksek verimlilikle ölçeklenebilir. Yüzen kültürde organoidler kolayca sıralanabilir ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme, mekanik test, ilaç tedavisi ve genetik karakterizasyon¹⁴dahil olmak üzere daha fazla analiz için istenilen aşamada transfer edilebilir. Embriyonik hücre agregalarının yüzeyinde epitelin bu spontan, doku mekaniği güdümlü rejenerasyonu mukoziyal epitel organoidleri ile sonuçlanır ve mucociliary epitelin biyolojisini incelemek için üç boyutlu (3D) yeni bir model sağlar.

Protokol

Hayvan kullanımı ve deneysel protokoller, Temel Bilimler Enstitüsü (IBS 18-01) ve Kore İleri Bilim ve Teknoloji Enstitüsü (KA2017-22) kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesi (IACUC) tarafından onaylandı.

1. Embriyolar

1. Standart bir prosedür kullanarak X. laevis embriyoları edinin: elle uyarılmış dişi kurbağayumurta toplamak ve in vitro fertilizasyon gerçekleştirmek^18,19.
2. De-jöle 1/3x modifiye Barth's tuzlu (MBS; aşağıdaki 1X MBS için tarifi görmek) pH 8¹⁹yaklaşık 5 dakika % 2 sistein nazik ajitasyon ile döllenmiş embriyolar .
3. Canlı görüntüleme için isteğe bağlı adım: floresan belirli proteinleri etiketlemek ve organoid dinamiklerini gözlemlemek için, bölüm 5'e geçin.
4. (İsteğe bağlı) Organoidler içindeki yüzeysel ektoderm hücrelerinin kontaminasyonunu izlemek için embriyoların apikal yüzeyini 9^14. 1 mg/mL NHS-Rhodamine'de 1/3x MBS (pH 9.0) ile 30 dk hafif nutasyon ile inkübat. 15 dakika boyunca 1/3x MBS ile dolu bir Petri kabına aktararak embriyoları üç kez yıkayın.
5. Evre 10'un ilk belirtileri tespit edilene kadar embriyoyu tercih edilen sıcaklıkta (14-26 °C) 1/3x MBS olarak kültürlendirin (yani, vegetal görünümde blastopore etrafında koyu pigmentli hücrelerin görünümü).

2. Mikrocerrahi alet, çözüm ve kültür damarlarının hazırlanması

1. Mikrocerrahi²⁰için cerrahi sınıf forseps ve saç aletleri (saç döngüsü ve saç bıçağı) bir çift de dahil olmak üzere gerekli araçları hazırlayın.
2. Embriyolar için aşağıdaki kültür ortamını hazırlayın: 1X MBS NaCl (88 mM), KCl (1 mM), NaHCO₃ (2,4 mM), MgSO₄ (0,82 mM), Ca(NO₃)₂ (0,33 mM), CaCl₂ (0,41 mM) ve HEPES (10 mM) ile yapılır. 10 M NaOH ile pH'ı 7,4'e ayarlayın.
   NOT: İsteğe bağlı: pH belirtmek için fenol kırmızısı damlaları ekleyin.
3. Embriyonik dokular ve organoidler için aşağıdaki kültür ortamını hazırlayın: Danilchik's for Amy (DFA)²¹ taze %1 antibiyotik ve antimikotik solüsyon ile desteklenmiştir. NaCl (53 mM), Na₂CO₃ (5 mM), potasyum glukonat (4,5 mM), sodyum glukonat (32 mM), CaCl₂ (1 mM) ve MgSO₄ (1 mM) ile DFA hazırlayın. Taneli Bicine ile pH'ı 8,3'e ayarlayın. Filtre DFA (0.2 μm şişe üstü filtre), aliquot ve -20 °C'de saklayın.
4. Yukarıdaki tarifi kullanarak ve CaCl₂ ve MgSO₄atlayarak ektoderm derin hücreleri ayırmak için kalsiyum ve magnezyum içermeyen DFA hazırlayın. Aliquot ve mağaza-20 °C.
5. Embriyonik hücre agregasyonu için yapışkan olmayan PCR tüpleri hazırlayın.
   1. İzole embriyonik hücrelerin spontan agregasyonunu sağlamak için, 4 °C'de veya oda sıcaklığında 2 saat boyunca 200 μL BSA (100 mL distile suda 1 g BSA) ile yuvarlak dipli PCR tüpleri kaplayarak yapışkan olmayan PCR tüpleri hazırlayın. Her tüp bir organoid monte etmek için kullanılacaktır.
   2. Herhangi bir artık BSA kaldırmak için DFA ile BSA kaplı PCR tüpleri üç kez durulayın.
   3. PCR tüplerini 200 μL DFA ile doldurun.

3. Derin ektoderm hücrelerinin izolasyonu

1. Bir stereoskop altında saç aletleri kullanarak erken evre 10 ulaşmak gibi embriyoseçin ve toplamak.
2. Tek kullanımlık transfer pipeti kullanarak, seçilen embriyoları DFA dolu petri kabına aktarın.
3. Embriyonun hayvan tarafını bozmadan bitkisel taraftan keskin forceps kullanarak embriyoların vitellin membranını çıkarın.
   NOT: Embriyoların havaya maruz kalmaması için dikkatli olun. Çözeltiye hava kabarcıklarının getirilmesi veya embriyoların yüzeye getirilmesi embriyonun patlamasına neden olur.
4. Hayvan kapağını izole etmek için, embriyonun hayvan tarafını yukarı doğru konumlandırın.
5. Hayvan kapağının ne kadar eksizyonu olduğunu görsel olarak tahmin edin ve bir saç bıçağıyla hayvan kapağının kenarı boyunca ilk kesiği yapın. Bir kesim yapmak için saç bıçağı dışarı doğru çekin.
6. Hayvan kapağını çıkarmak için küçük kesikler zinciri oluşturmak için adım 3.5'i tekrarlayın.
7. Mezoderm öncülerinin eklenmesini önlemek için hayvan kapağının kalın katmanlı kenarını bir saç bıçağı kullanarak kırpın.
   NOT: İzole hayvan kapaklarının iyileşmesini ve toplanmasını önlemek için 10 dakika içinde bir sonraki adıma geçin. Tipik olarak, birden fazla organoidleri bir araya getirmek için bir seferde 5-10 hayvan kapakları izole.
8. Derin ektoderm hücrelerini hayvan başlığından ayırmak için, eksinti hayvan kapaklarını kalsiyum ve magnezyumsuz DFA ile tek kullanımlık transfer pipetiyle dolu bir Petri kabına aktarın. Transfer sırasında herhangi bir hava kabarcıkları tanıtmak için dikkatli olun.
9. Sonraki adımlar için yeterli alan tutmak için, saç araçları kullanarak, hayvan kapakları kadar hayvan tarafı karşı karşıya konumlandırmak ve diğer explants cömert bir mesafe korumak.
10. 5-10 dakika bekleyin ve sonra bir stereoskop altında ekspekte izlemek. Bir kez gevşetilmiş derin hücreler koyu pigmentli yüzeysel tabaka nın kenarından bulundu, uzak stereoskop altında bir saç bıçağı kullanarak açık renkli derin ektoderm hücrelerinden yüzeysel tabaka kaldırma başlar.
11. Dikkatle ayırmak (peel-off) bir saç bıçağı ile yüzeysel tabaka, kenarından başlayarak.
12. Bir sonraki adımda toplama ortamına aktarılan kalsiyum ve magnezyumsuz DFA miktarını sınırlamak için minimum aspirasyona (10\u201215 μL) sahip derin ektoderm hücrelerini toplayın.
    NOT: Ayrılmış yüzeysel hücreler kalan derin ektoderm hücrelerinin kontamine önlemek için medyadan kaldırılabilir.

4. Mukoziyal epitel organoidlerin üretimi

1. Toplanan derin ektoderm hücrelerini 200 μL DFA içeren yapışkan olmayan bir PCR tüpüne aktarın. PcR tüpündeki aktarılan hücreleri dağıtmak için medyayı (2\u20123 kez) hafifçe pipetlendirin.
   NOT: Toplama sonrası saat (hpa) olarak belirlenen zamanlama bu adımda başlar. Ortaya çıkan organoidlerin boyutu bir PCR tüpüne eklenen derin ektoderm hücrelerinin sayısı ile kontrol edilir. Organoidin istenilen boyutuna bağlı olarak, bir veya daha fazla hayvan kapağından derin ektoderm hücreleri kullanılabilir.
2. PCR tüpünü kapatın. PcR tüpleri altta spontan toplama neden olmak için dik tutun.
3. Toplama işlemini stereoskop altında izleyin. Hücreler genellikle bir saat içinde PCR tüpaltında toplamak ve 2-3 saat içinde küresel agregalar halinde biraraya, boyutuna bağlı olarak.
4. Mucociliary epitel organoidlerin gelişimi sırasında canlı görüntüleme veya uyuşturucu testi yapmak için, toplama sırasında agregalara zarar vermemek için genişlemiş uçlu (steril makas ile kesilmiş) ile donatılmış 200 μL pipet kullanarak 2 hpa'da agregatoplamak.
5. Agregaların kültürdeki mukozi epitel organına dönüşmesine izin vermek için, PCR tüpünden 5 hpa'da küresel agregalar toplayın ve bunları DFA dolu Petri kabına aktarın.
6. Erimelerini önlemek için agregaları diğerlerinden uzak konumlandırın. Herhangi bir ek faktör olmaksızın oda sıcaklığında kültürün 24 saat içinde, olgun mukozi epitel organoidler farklılaşmış epitel yüzeyini kaplayan cilia dayak eylem ile dönen olduğu görülebilir

5. (İsteğe bağlı) Gelişmekte olan organoidlerin yüksek çözünürlüklü canlı görüntüleme

1. Mikroenjeksiyon için mRNA hazırlayın.
   1. Organoid oluşumunun ilk aşamasında oluşan epitelizasyonu görselleştirmek için, epitelyal spesifik zonula oklüdenprotein-1 (ZO-1) için mRNA hazırlamak ve pCS2-ZO1-RFP ve pCS2-mem-GFP plasmids (Lance Davidson bir hediye) yükselterek hücre zarlarını anahat için.
   2. Plazmid DNA'sını ayıklayın ve doğrusallaştırın ve sonra kapaklı mRNA'yı SP6/T7 in vitro transkripsiyon kiti kullanarak yazıya aktarın.
   3. Aliquot transkripsiyonu mRNA ve -80 °C'de saklayın.
2. MRNA'yı döllenmiş bir embriyoya mikro enjekte edin
   1. Döllenmiş embriyoları 1x MBS'de %3 Ficoll'a yerleştirin.
   2. 3-4 μL mRNA'yı mikro yükleyici ucu kullanarak çekilen cam iğneye (iç çapı 10\u201230 m olan uzun ve ince konik iğne ucu) yükleyin.
   3. İğneyi bir mikroenjektöre takın ve mikroenjeksiyon için sabit bir mRNA hacmi sağlamak için zamanı ve basıncı ayarlayın.
   4. MRNA'yı hayvan direğinin apikal yüzeyinin hemen altına enjekte edin. Korteksin genişlemesinden kaynaklanan belirgin bir soluk renkli dairesel yama mikroenjeksiyon sırasında görülebilir.
   5. Enjekte edilen embriyoları 1/3X MBS'ye aktarın ve 9.5 evresine aktarın.
   6. Floresan etiketli embriyoları floresan stereoskop (GFP (488/510) ve RFP (532/588) için uyarma/emisyon ayarları) altında toplayın.
   7. Adım 1.3 ile devam edin.
3. Organoidi (bölüm 3 ve 4) istenilen gelişim aşamasına kadar birleştirin ve kültüredin.
4. Canlı görüntüleme yapın.
   1. Silikon gres kullanarak özel öğütülmüş akrilik hazneye bir kapak bardağı yapıştırarak cam alttan bir görüntüleme odası hazırlayın.
      NOT: Kültür ortamının sızmasını önlemek için odayı sıkıca kapatın.
   2. Görüntüleme odasını DFA ile doldurun.
   3. Bir altıgen iletim elektron mikroskobu (TEM) ızgarasını (75 mesh) bir kaptan forceps kullanarak seçin ve ızgaranın kenarına az miktarda yağ uygulayın.
      NOT: Kafesin boyutu agreganın çapından daha küçük olmalıdır, böylece agrega ızgarada yer almalıdır.
   4. TEM ızgarasını görüntüleme odasının altına sabitlemek için hafifçe bastırın.
   5. Agregaları görüntüleme odasına aktarın ve ızgara içinde yerleştirin.
      NOT: Agregaları yağın yanına konumlandırmaktan kaçının. Deney boyunca, agregalar fiziksel sıkıştırmayı önlemek için odanın dibine temas etmeden TEM ızgarası üzerinde oturmalıdır.
   6. Görüntüleme odasını DFA ile doldurun ve bir kapak camı ve gresle kapatın.
      NOT: Oda görüntüleme sırasında herhangi bir türbülans veya hareketi önlemek için hava kabarcıkları ile hava geçirmez olmalıdır.
   7. Mukoziyal epitel organoid oluşumunun ilerlemesini takip etmek için, konfokal mikroskop kullanarak agregaların (2 hpa'dan) hızlandırılmış z-yığın görüntülerini toplayın.
      NOT: Dinamik hücre davranışlarını takip etmek için 20X hedefi kullanarak genellikle her 15 dakikada ~120 μm kalınlığında z-yığınları toplarız, ancak bu özellikler deneylerin amacı için optimize edilmelidir.

6. (İsteğe bağlı) Fiksasyon ve immünboyama ile organoidler gelişen görüntüleme

1. Organoidleri fiksatif bir solüsyonla dolu cam bir şişeye aktararak istenilen gelişim aşamasında düzeltin.
   NOT: Tam fiksasyon sağlamak için örneklerin >20 katı olan fiksatif çözelti hacmi ekleyin. Aksi belirtilmedikçe, aşağıdaki işlemleri bir nutator üzerinde gerçekleştirin. Genel olarak, organoidler PBS'de %4 paraformaldehit (PFA) ile sabittir. Ancak, farklı fiksatifler belirli proteinleri tespit etmek için gerekli olabilir. Örneğin, F-aktin ve asetiltli tubulin saptanması için PBS'de %0.25 glutaraldehit ile %4 PFA kullandık. Intelectin (ITLN) ve ZO-1'i saptamak için organoidler buz gibi dent çözeltisi (4:1 metanol:dimetil sülfoksit) ile -20 °C'de bir gecede sabitlenir. Dent'in sabit organoidleri yıkanmadan önce seri olarak susuz kılmalıdır (adım 6.3). Antikor kuluçka ve yıkama süresi belirli ihtiyaçlar için optimize edilebilir.
2. Organoidleri oda sıcaklığında (RT) veya 4 °C'de 15 dakika boyunca sabitlayın.
3. RT'de 15 dakika boyunca PBST (PBS %0,1 Triton X-100 ile PBS) ile 3 kez yıkayın.
4. PBST'de (PBSGT) %10 keçi serumu ile spesifik olmayan bağlanmayı 1 saat RT'de bloke edin.
5. 4 °C'de bir gecede PBSGT'de primer antikor (1:200) ile inkübat.
6. RT'de 15 dakika boyunca PBST ile 3 kez yıkayın.
7. 4 °C'de bir gecede PBSGT'de sekonder antikor (1:200) ile inkübat.
8. RT'de 15 dakika boyunca PBST ile 3 kez yıkayın.
9. Sabit ve immünosülorganoidleri bir görüntüleme odasına aktarın ve konfokal görüntüleme ile devam edin.

Sonuçlar

Bu standart protokol erken gastrula evre X izole çok güçlü atalarından bir mücociliary epitel organoid oluşturur. Toplanan derin ektoderm hücreleri yapışkan olmayan bir PCR tüpbir agrega oluşturmak ve yüzey epitelizasyon ve goblet hücre farklılaşması geçmesi için kendi kendine monte. Agregaların yeni epitelize yüzeyi iç hücrelerin (örn. çok katlı ve diğer aksesuar hücreleri) in vivo'da bulunan yerli epitelyuma benzer bir substrat sağlar ve mukoziliyer epitel organoidler oluşturmak için gelişir (Şekil 1A,B). 24 saat içinde agregasyon dan sonra, kendi kendine organize mucociliary epitel organoidler bir kurbağa yavrusu epidermisinayırt edilemez olgun bir epidermis rejenere. Organoidler tam diferansiye epitel (keratin), mukus salgılayan kadeh hücreleri (ITLN), çok sayıdasıvılaşmış hücreler (asetiltif tubulin) ve küçük salgı hücreleri (yer fıstığı agglutinin, PNA)(Şekil 1C)oluşturmaktadır.

İmmünboyama ile farklı hücre tiplerinin gelişimini doğrulamanın yanı sıra, organoid gelişim dinamikleri canlı görüntüleme ile takip edilebilir(Şekil 2A). Organoid oluşumunun erken evresinde ortaya çıkan epitelizasyonu(Şekil 1B)incelemek için embriyoları floresan olarak etiketlenmiş sıkı kavşak proteinlerini (ZO-1-RFP) ve membran lokalize proteinleri (mem-GFP) ifade ederek etiketledik. Çift etiketleme ile ZO-1-pozitif sıkı kavşak oluşumunun sıralı basamakları işaretlenebilir ve epitelizasyon sırasında nicel olarak analiz edilebilir(Şekil 2). Örneğin, epitelizasyonun farklı aşamalarındaki hücreler için(Şekil 2B, yeşil renkli) (0 dk)'da, hücre-hücre adezyonunun bazı bölgeleri ZO-1'in(Şekil 2B, yeşil oklar) delinmiş puncta'sını oluşturur. Buna karşılık, diğer alanlarda tam olarak monte var, bitişik ZO-1 ifade(Şekil 2B, sarı oklar). Zamanla, puncta birleşebilir ve bitişik sıkı kavşaklar(Şekil 2B, yeşil oklar) oluşturmak ve bitişik sıkı kavşaklar hücre bölünmesi sırasında bile morfolojilerini korumak(Şekil 2B, sarı oklar) oluşturmak için bağlanır. Sıkı kavşaklar olgunlaştıkça, hücreler organoidlerin apikal düzlemleri boyunca yüzeye dinamik olarak girip çıkarlar (Şekil 2C,D). Ayrıca, hücreleri farklılaştırma organoidlerinin yüzeyinde(Şekil 2B, renk kodlu hücreler) spatiotemporal olarak izleyerek, tek tek puncta'dan bitişik sıkı kavşaklara, hücre hücre sınırlarına ve organoidler içindeki hücre popülasyonlarının alt kümelerine kadar çok ölçekli analiz ler mümkündür.

Şekil 1: Mukoziyal epitel organoidlerin üretimi.
(A) X. laevis embriyolarından derin ektoderm agregalarını bir araya getirmek için protokolü gösteren bir şema. (B) Çok güçlü derin ektoderm hücrelerinden (kesitsel görünüm) kaynaklanan mukoziyal epitel organoid oluşumu modeli için bir şema. Yüzey konumlandırılmış hücreler epitel hücrelerine geçer ve kadeh hücrelerine ayrılırlar. Farklılaştırıcı siliated hücreler, salgı hücreleri, ve iyonositler radyal yüzeye intercalate ve olgun bir epidermis rejenere. (C) ITLN (mukus üreten kadeh hücreleri), asetiltultu tubulin (siliatlı hücreler), PNA (küçük salgı hücreleri) ve 24 hpa (üst panel) ve kurbağayavrusu epidermis (alt panel) organoidlerde keratin (epitel hücreleri) için mukoza epitel immünosu immünosu maksimum z-projeksiyonu. Ölçek çubuğu = 30 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Gelişmekte olan organoidlerin canlı görüntülemesi.
(A) Canlı organoidler için görüntüleme odası şeması (ölçeklendirilmeyecek). (B) Zo-1-RFP ve mem-GFP'yi 2,5 hpa'dan ifade eden derin ektoderm hücre agregalarından toplanan konfokal yığınların hızlandırılmış dizileri. Ölçek çubuğu = 20 μm. Hücreler zaman içinde izlemek için sözde renklidir. Yeşil renkli hücre, biri kademeli olarak gelişen ZO-1 pozitif yapışma (yeşil oklar) ve zamanla bitişik ZO-1 pozitif yapışma (sarı oklar) da dahil olmak üzere farklı hücre yapışma durumlarına sahiptir. (C, D) ZO-1-RFP ifade eden derin ektoderm hücre agregalarının hızlandırılmış konfokal görüntüleri, radyal olarak intercalating hücrelerinin yüzeye (C, sarı yıldız) hareket ettiğini ve agregaların içinde hareket ettiğini (D, mavi yıldız) gösterir. Ölçek çubukları = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

X. laevis embriyonun derin ektoderm hücrelerinden üretilen mucociliary epitel organoidler, çok güçlü ataların in vitro epitelizasyonunu ve farklılaşmasını incelemek için güçlü bir araçtır. Yaygın olarak benimsenen hayvan kapağı test¹⁶ in vitro organogenez¹³ ve mücociliary epitel gelişimi aksine^15,17,22 bozulmamış ektoderm kullanan, bu protokolde sunulan derin ektoderm kaynaklı organoidler yüzey epitel 14 doku mekaniği odaklı rejenerasyon aşamaları izlemek için ayrı bir fırsat sunuyoruz¹⁴. Yaklaşık olarak 2 hpa, yeni oluşturulan ZO-1 pozitif epitel hücreleri(Şekil 2) organoidlerin apikal yüzeyinde görünmeye başlar ve doku katılaştırmak veya uyumu azaltır gibi tüm organoid kapsayacak şekilde popülasyonunu artırmak¹⁴. Mukus üreten goblet hücreleri için epitelin yenilenmesi ve sonraki soy özellikleri bir gün içinde kimyasal olarak tanımlanmış bir kültür medyasında kendiliğinden ilerler. Bu hızla gelişen mukozier epitel organoidler epitel rejenerasyon ilerici adımlar sırasında, gerçek zamanlı olarak dinamik hücre davranışlarını incelemek için bir platform sağlar. Ayrıca mucociliary epitel gelişimi sırasında ortaya çıkan temel soruların araştırılmasını sağlamak, homeostaz, ve ilişkili hastalıklar^2,9,23. Özellikle, organoidler tespit epitel goblet hücre öncüleri geçiş sırasında derin progenitor hücrelerinmekanik duyarlılık¹⁴ mukus salgılayan goblet hücreleri üzerinde olduğu anormal bazal diferansiyasyon ile ilişkili solunum hastalıkları bağlamak için hizmet edebilir- veya az üretilen²³.

Bu protokol bu organoidler oluşturmak için basit bir yaklaşım sunarken, deneylerde başarı için birkaç kritik adım vardır. Derin ektoderm hücrelerinin hayvan başlığından izole edilmesi sırasında yüzeysel epitel hücrelerinin kirlenmesini önlemek için, kalsiyum ve magnezyumsuz DFA'ya yerleştirilen hayvan kapağını stereoskop altında izlemeli ve hayvan kapağının koyu pigmentli yüzeysel tabakasının ayrılığını başlatmak için doğru zamanı saptamalıdır. Doku kalsiyum ve magnezyum içermeyen DFA çok uzun süre tutulursa, tüm doku ayrışacak ve derin ve yüzeysel hücreler arasında ayrım daha sonra derin ektoderm agregalar için imkansız olacaktır. Derin ektoderm agregalarında yüzeysel hücrelerin yokluğunu doğrulamak için, mikrocerrahiden önce embriyonun apikal yüzeyini NHS-rhodamine (adım 1.4¹⁴⁾ile floresan olarak etiketlemenizi öneririz; ortaya çıkan organoidler varsa bu yüzey hücrelerinin kolayca tanımlanması için izin verecek. Epitel rejenerasyon doku mekaniği tarafından düzenlenir beri¹⁴, kendi kendini organize organoidler için istenmeyen kuvvet oluşumunu önlemek için esastır. Özellikle canlı agregaların görüntüleme penceresi ile ücretsiz temas sağladığından TEM ızgaralarının kenarlarına agregalar yerleştirerek canlı görüntüleme sırasında görüntüleme odasının cam alt kısmıyla temastan kaçınmanızı öneririz (adım 5.1.2.). Bu in vitro-mucociliary epitel için kültürlü, kendi kendine organize 3D model epitel rejenerasyon ve goblet hücrelerinin soy özellikleri sırasında ortaya çıkan temel soruları cevaplamak için bir çekilebilir araç olarak hizmet edecektir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Dual-stage Glass Micropipette Puller	Narishige	PC-100
Picoliter microinjector	Warner Instruments	PLI-100A
Confocal Laser Microscope
Stereoscope
Tools
Forcep	Dumont	Dumont #5
Hair knife		Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991)
Hair loop		Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991)
hCG injection
human chorionic gonadotropin	Sigma	cg10-10vl
MBS solution
10M Sodium hydroxide	Sigma	72068
Calcium chloride	Sigma	C3881
Calcium nitrate	Sigma	C1396
HEPES	Sigma	H4034
Magnesium sulfate	Sigma	230391
Phenol-red	Sigma	P0290
Potassium chloride	Sigma	7447-40-7
Sodium bicarbonate	Sigma	S6014
Sodium chloride	Sigma	S9625
Sodium hydroxide reagent grade, 97%, powder-25g	Sigma	655104
dejellying solution
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma	C7880
Sodium hydroxide 10M	Sigma	72068
Ficoll solution
Ficoll	Sigma	F4375
DFA solution
Sodium chloride	Sigma	S9625
0.22mm Filter	Millipore	S2GPT05RE
Antibiotic Antimycotic Solution	Sigma	A5955
Bicine	Sigma	B3876
Calcium chloride	Sigma	C3881
Magnesium sulfate	Sigma	230391
Potassium gluconate	Sigma	G4500
Sodium carbonate	Sigma	222321
Sodium gluconate	Sigma	G9005
mRNA in vitro transcription
SP6/T7 in vitro transcription kit	Invitrogen	AM1340
mRNA microinjection
Borosilicate glass capillary tubes	Harvard Apparatus	GC100-10
Eppendorf microloader pipette tips	ThermoFisher	A25547
Mineral oil	Sigma	M5904
PCR tube coating
BSA	Thermofisher	26140079
PCR tubes	SSI	SSI-3245-00
Imaging
Custom-milled acrylic chamber
Coverglass 24mmX50mm	Duran	B01_001650
SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (50mesh)	SPI	275HGN-XA
SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (75mesh)	SPI	2775GN-XA
Silicone grease	Shinetsu	HIVAC-G
Fixation
20ml screw top-cap vial	Wheaton	WH.986580
2ml screw top-cap vial
Benzyl alcohol	Sigma	305197
Benzyl benzoate	Sigma	B6630
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sgima	D4540
Glutaraldehyde 10% EM GRADE	Electron Microscopy Sciences	16120
Goat serum	Jackson	005-000-121
Methanol	Sigma	322415
Paraforlamdehyde	Sigma	P6148
Phosphate-buffered saline (PBS)	LPS Solution	CBP007B
Triton X-100	Sigma	T8787
Primary antibody (1:200)
acetylated tubulin	Sigma	clone 6-11B-1
Itln1	Proteintech	11770-1-AP
Keratin	Developmental Studies Hybridoma Bank	1h5
ZO1	Invitrogen	402200
Vectors
pCS2-mem-GFP		Gift from Dr. Lance Davidson
pCS2-ZO1-RFP		Gift from Dr. Lance Davidson