Murin İntraabdominal Yağ Depolarından Adipojenik ve Fibroinflamatuar Stromal Hücre Alt Popülasyonlarının İzolasyonu

Özet

Bu protokol, adipojenik ve fibro-inflamatuar stromal hücre alt popülasyonlarını murin karın içi beyaz yağ dokusu (WAT) depolarından floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması veya immünmanyetik boncuk ayırma yoluyla izole etmek için teknik yaklaşımı açıklar.

Özet

Beyaz yağ dokusunun (WAT) stromal-vasküler fraksiyonu (SVF) oldukça heterojendir ve yetişkinlikte WAT'ın genişlemesine ve yeniden şekillenmesine işlevsel olarak katkıda bulunan çok sayıda hücre tipinden oluşur. Bu hücresel heterojenliğin etkilerini incelemenin önündeki muazzam bir engel, in vitro ve in vivo analizler için işlevsel olarak farklı hücre alt popülasyonlarını WAT SVF'den kolayca izole edememektir. Tek hücreli dizileme teknolojisi, son zamanlarda yetişkin farelerin karın içi WAT depolarında fonksiyonel olarak farklı fibro-inflamatuar ve adipojenik PDGFRβ+ perivasküler hücre alt popülasyonlarını tanımlamıştır. Fibro-inflamatuar progenitörler ("FIP'ler" olarak adlandırılır), proinflamatuar bir fenotip uygulayabilen adipojenik olmayan kollajen üreten hücrelerdir. PDGFRβ+ adiposit öncü hücreleri (APC'ler), hücre transplantasyonu üzerine hem in vitro hem de in vivo olarak oldukça adipojeniktir. Burada, bu stromal hücre alt popülasyonlarının murin intraabdominal WAT depolarından izolasyonu için birden fazla yöntem tanımlanmıştır. FIP'ler ve APC'ler, floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) ile veya biyotinile antikor bazlı immünomanyetik boncuk teknolojisinden yararlanılarak izole edilebilir. İzole edilmiş hücreler moleküler ve fonksiyonel analiz için kullanılabilir. Stromal hücre alt popülasyonunun fonksiyonel özelliklerini izole olarak incelemek, hücresel düzeyde fizyolojik veya patolojik koşullar altında yağ dokusunun yeniden şekillenmesi hakkındaki mevcut bilgilerimizi genişletecektir.

Giriş

Beyaz yağ dokusu (WAT), memelilerde enerji depolamanın ana bölgesini temsil eder. Bu doku içinde, adipositler veya "yağ hücreleri", büyük tek gözlü lipid damlacıkları halinde paketlenmiş trigliserit formunda fazla kaloriyi depolar. Ayrıca, adipositler, enerji homeostazının^çeşitli yönlerini düzenleyen çok sayıda faktör salgılar ^1,2,3. Adipositler, WAT hacminin büyük kısmını oluşturur; bununla birlikte, adipositler, WAT ^4,5'te bulunan toplam hücrelerin yalnızca %50'sinden daha azını temsil eder. WAT'ın adiposit olmayan ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm hayvan protokolleri ve prosedürleri, Texas Üniversitesi Güneybatı Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Kullanımı ve Bakımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Gonadal beyaz yağ dokusundan stromal vasküler fraksiyonun (SVF) izolasyonu

1. 6-8 haftalık farelerden gonadal beyaz yağ dokusunu inceleyin ve yağ pedlerini 1x PBS çözeltisine yerleştirin.
2. 4 adede kadar yağ deposunu birleştirin (1-2 fareden 2-4 depo önerilir) ve dokuyu 200 μL sindirim tamponu (1x HBSS,% 1.5 BSA ve 1 mg / mL kollajenaz D) içeren 10 mL'lik bir beherde kıyın.
3. Kıyılmış dokuyu 10 mL sindirim tamponu içeren 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu protokol, yetişkin farelerin karın içi WAT depolarından farklı stromal hücre popülasyonlarının izolasyonuna izin veren iki stratejiyi tanımlar. APC'ler ve FIP'ler, FACS (Şekil 1) veya biyotinile antikorlarla immünomanyetik boncuk ayırma (Şekil 2) ile izole edilebilir. Her iki yaklaşım da ticari olarak temin edilebilen reaktifleri ve antikorları kullanır. İmmünomanyetik boncuk ayrımı, gWAT SVF'den adipojenik olmayan hücrelerden adipojeni.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Farelerin C57BL / 6 suşu, diyete bağlı obezite çalışmalarında en çok kullanılan fare türüdür. C57BL / 6 fareleri, yüksek yağlı bir diyete (HFD) yerleştirildiğinde hızla kilo alır ve obezite ile ilişkili metabolik sendromun bazı belirgin özelliklerini geliştirir (örneğin, insülin direnci ve hiperlipidemi). Özellikle, yüksek yağlı diyet (HFD) beslemesi ile ilişkili olarak meydana gelen WAT genişlemesi, depoya özgü bir şekilde gerçekleşir 19,20,21,22,23.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mechanical Tissue Preparation and SVF Isolation
40 and 100 µm cell strainers	Fisher Scientific	352340/352360
1X Phosphate buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	21040CV
5ml polypropylene tubes	Fisher Scientific	352053
Digestion Buffer (for 10mL)
10 ml HBSS	Sigma	H8264
10 mg Collagenase D (1 mg/ml final cc.)	Roche	11088882001
0.15 g BSA (1.5 % final cc.)	Fisher Scientific	BP1605-100
Immunomagnetic separation of APCs and non-APCs
5X MojoSort Buffer (MS buffer)	BioLegend	480017
5 ml MojoSort Magnet (MS magnet)	BioLegend	480019
100 µL MojoSort Streptavidin Nanobeads	BioLegend	480015
Purity Check and FACS
10X Red Blood Cell Lysis Buffer	eBioscience	00-4300-54
Fc block (Mouse CD16/CD32)	eBioscience	553141
Antibodies
Biotin CD45	BioLegend	103103	Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: 30-F11
Biotin CD31	BioLegend	102503	Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: MEC13.3
Biotin CD9	BioLegend	124803	Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: MZ3
Biotin LY6C	BioLegend	128003	Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: HK1.4
CD31-PerCP/Cy5.5	BioLegend	102419	Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: 390
CD45-PerCP/Cy5.5	BioLegend	103131	Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: 30-F11
CD140b PDGFRβ-PE	BioLegend	136006	Concentration: Dilution 1:50 Species: Mouse Clone: APB5
LY6C-APC	BioLegend	128016	Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: HK1.4
CD9-FITC	BioLegend	124808	Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: MZ3
Cell Culture and Differentiation
Gonadal APC Culture media (for 500mL)
288 mL DMEM with 1 g/L glucose	Corning	10-014-CV
192 mL MCDB201	Sigma	M6770
10 mL Fetal bovine serum (FBS)** lot#14E024	Sigma	12303C
5 mL 100% ITS premix	BD Bioscience	354352
5 mL 10 mM L-ascorbic acid-2-2phosphate	Sigma	A8960-5G
50 µL 100 g/ml FGF-basic	R&D systems	3139-FB-025/CF
5 mL Pen/Strep	Corning	30-001-CI
500 µL Gentamycin	Gibco	15750-060
**NOTE: The adipogenic capacity of primary APCs can vary from lot to lot of commercial FBS. Multiple lots/sources of FBS should be tested.