Kan Türevi Nöronal Hücrelerin GM'den Arındırılmış Üretimi

Özet

Yeniden programlanmış periferik kan hücrelerinden nöronal fenotip içeren hücreler elde etmek için genetiği değiştirilmiş (GM içermeyen) bir yöntem sunuyoruz. Yeni insan GPI bağlantılı proteine bağlı bir sinyal yolunun aktivasyonu, insan pluripotent kök hücrelerini elde etmek için verimli bir GM içermeyen yöntem ortaya koymaktadır.

Özet

Birçok insan nörolojik bozukluğu, beyindeki nöronların ve glial hücrelerin dejenerasyonundan kaynaklanır. Farmakolojik ve diğer terapötik stratejilerdeki sınırlamalar nedeniyle, şu anda yaralı veya hastalıklı beyin için mevcut bir tedavi yoktur. Hücre replasmanı nörodejeneratif durumlar için umut verici bir terapötik strateji olarak ortaya çıkar. Bu güne kadar fetal dokulardan, insan embriyonik hücrelerinden (ES) veya indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC) nöral kök hücreler (NSC) başarıyla oluşturulmuştur. Pluripotent kök hücrelerin üretilmesine yol açan yeni insan GPI bağlantılı glikoproteinin aktivasyonu ile bir adanmışlık süreci başlatılmıştır. Bu kan türevli pluripotent kök hücreler (BD-PSC'ler) in vitroyu brightfield ve immünofluoresans mikroskopisinde gösterildiği gibi nöral fenotipli hücrelere ayırır. Bu hücrelerin elektron mikroskopisi ile ultrayapısal analizi, ilkel yapılarının yanı sıra nöronal benzeri morfoloji ve hücre altı özelliklerini doğrular.

Giriş

Temel ve klinik öncesi kök hücre araştırma yöntemlerinin geliştirilmesi, nörolojik hastalıklar için kök hücre temelli tedavilerin klinik olarak uygulanmasını teşvik eder. Bu tür potansiyel tedavi kritik fonksiyonel iyileşmeye yol açan insan sinir hücrelerinin üretimi için yönteme bağlıdır¹.

Nöral kök hücreler (NSC'ler) yetişkin nörogenez adı verilen bir süreçte yaşam boyunca kendini yeniler ve yeni nöronlara ayırır. Sadece çok kısıtlı beyin bölgeleri, yetişkinlikte yenidoğan nöronları üretmeye yetkin NSC'leri barındırır. Bu tür NSC'ler, öğrenme ve hafızada yer alan olgun nöronlara yol açabilir, böylece kayıp veya hasarlı nöronların yerini alabilir. Ne yazık ki, bu NSC'ler sınırlı miktarlarda bulunur ve bu sınırlı nörogenez çocuk gelişimi sırasında hızla azalır². Bu nedenle, diğer sinirsel hücre kaynakları bir hücre tedavisi hedefinde düşünülmelidir.

Dejeneratif nörolojik hastalıkların standart farmakolojik yaklaşımlar kullanılarak tedavisi zordur. Birçok eskiyen nörolojik bozukluğu kucaklamak için yeni terapötik stratejiler, hastalıklı ve yaralı dokunun hücre protezi tedavilerine dayanmaktadır. NSC transplantasyonu hasarlı hücrelerin yerini alabilir ve yararlı etkiler sağlayabilir. Nöral hücre değişimi için diğer kaynaklar arasında memeli blastosistler^3'üniç hücre kütlesinden elde edilen insan embriyonik kök hücreleri (ESC) ve^ESC'lergibi geniş kendini yenileme kapasitesine sahip ve çeşitli hücre soylarına farklılaşabilen iPSC 4 bulunur. NSC'ler ayrıca pluripotent durumdan kaçınarak insan fibroblastlarından doğrudan yeniden programlama ile de oluşturulabilir⁵.

Hücre replasman tedavisi hala zorlu bir konudur. ESC, fetal veya iPS birçok tedavi edilemez nörolojik hastalığın tedavisi için nöronal hücrelerin üretimi için bir kaynak olsa da, hasarlı dokuların otolog yetişkin SCS hücre değişimi, immünolojik, etik ve güvenlik endişelerini atlatan daha iyi bir alternatiftir.

İnsan GPI bağlantılı proteinin PLCφ/PI3K/Akt/mTor/PTEN fosforilasyonu yoluyla antikor-çapraz bağlama ile aktivasyonu, kan progenitör hücrelerinin ve kan türevli pluripotent kök hücrelerin (BD-PSC' ler) üretimine adanmışlık başlatır⁶. Bu hücreler, parlak alan, immünofluoresans ve iletim elektron mikroskopisi (TEM) analizi ile doğrulanan nöronal hücrelere doğru in vitro farklılaşmaz.

Bu çalışmada, BD-PSC'lerin GM'den arındırılmış neslini ve nöronal fenotipli hücrelere başarılı bir şekilde yeniden ayırt etmelerini anlatıyoruz.

Protokol

Deneyler yapılırken etik onaylar alındı.

1. İnsan periferik kan mononükleer hücrelerinin izolasyonu (PBMNC'ler)

1. Tüm bağışçıların kurumsal yönergelere uygun olarak kan çekmeden önce bilgilendirilmiş onay imzaladığını sağlayın.
2. Standart protokole göre eğitimli sağlık personeli tarafından sağlıklı donörlerden 30 mL kan alın.
3. PBMNC'leri yoğunluk degrade ortamları tarafından yalıtın. Fosfat tampon salin (PBS) ile seyreltilmiş 25 mL 1:1 kan ile 10 mL ortam ve 30 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj kullanın.
4. Plazma ile yoğunluk gradyan ortamı arasındaki ara faz tabakasını pipetleme ile izole edin. İzole edilmiş hücreleri 5 mL steril PBS ve santrifüj ile 300 x g'da 10 dakika yıkayın.
5. Sayım odası kullanarak standart yöntemlerle hücre sayısını sayın.

2. PBMNC'lerin yüzeyinde antikor çapraz bağlantısı ile insan GPI bağlantılı glikoproteinin aktivasyonu

1. 6 x 10⁶ mononükleer hücreyi (MNC) 15 mL tüplere yerleştirin ve hücreleri insan GPI bağlantılı membran proteine özgü antikor (30 μg/mL) ile PBS'de 37 °C'de % 1 sığır serum albümini (BSA) ile 30 dakika kuluçkaya yatırarak antikor çapraz bağlama işlemi gerçekleştirin.
2. Kuluçka ortamını Iscove'un modifiye Dulbecco's medium'u ile %10 fetal sığır serumu (FBS) ile değiştirin.
3. 15 mL polistiren tüplerde hücreleri büyütün, tüpleri 8-10 gün boyunca (titremeden) 37 ° C ve% 5 CO_2'de bir inkübatöre koyun. D5'te, her 15 mL tüpe% 10 FBS ile desteklenmiş iscove'un ortamına ek bir 1-2 mL ekleyin.

3. Yeni oluşturulan farklılaştırılmış hücrelerin sıralanması

1. Otomatik hücre sayacı (18 μL hücre süspansiyonu + 2 μL floresan boyası) veya bir sayım odasındaki hücreleri sayın.
2. Santrifüj kültürlü hücre süspansiyonu (5-7 x^{10 6) 10}dakika boyunca 300 x g'da ve elde edilen süpernatantı steril bir Pasteur pipetle aspire edin.
3. Hücre peletini önceden soğutulmuş PBS pH 7.2, %0.5 BSA ve 2 mM EDTA'da 90 μL'de yeniden askıya alın.
4. Hücre süspansiyonu içine CD45 pozitif nano boyutlu manyetik boncuklar (80 μL) ekleyin ve 15 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
5. 10 dakika boyunca 300 x g'da 2 mL PBS tampon ve santrifüj ekleyerek hücreleri yıkayın.
6. Hücreleri 500 μL PBS tamponunda yeniden askıya alın.
7. Kolonu 500 μL önceden soğutulmuş PBS tamponu ile yıkayın ve manyetik alana yerleştirin.
8. Hücre süspansiyonunu kolona yerleştirin ve 500 μL PBS tamponu (iki kez) ve CD45 negatif hücreler içeren santrifüj akışı ile yıkayın. Bunları Iscove'un %1 BSA ile desteklenmiş ortamında toplayın.
9. Sayım odasındaki hücreleri say.

4. Yeni oluşturulan kök hücrelerin nöronal farklılaşması için hücre kültürü yemeklerinin hazırlanması

1. Nöronal hücrelerin büyümesi için kültür damarlarını poli-L-ornitin ve laminin ile kapla.
2. Cam kapakları 4 kuyulu plakalara yerleştirin ve ddH 2 O'da 1:5 seyreltilmiş poli-L-ornitin (ddH₂O'da 0,1 mg/mL) ile kaplayın. Daha sonra ddH₂O ile yıkayın.
3. Laminin 'i (0.5-2.0 mg/mL) yavaşça çözün ve kapakların üstüne ekleyin. 2 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
4. 49 mL D-MEM/F12, 500 μL N2 takviyesi, 400 μL esansiyel olmayan amino asit (NEAA), 20 ng/mL son konsantrasyonda temel FGF çözeltisi (100 μg/mL stok çözeltisinden hazırlanan) ve 2 ng/mL son konsantrasyonda heparinden oluşan sinirsel indüksiyon ortamı N2 hazırlayın.
5. Pipetleme ile fazla lamininleri çıkarın ve kültür yemeklerine nöronal orta N2 ekleyin.

5. Nöronal adanmış kan hücrelerinin kült örünttürme

1. Kültür BD türevli CD45 negatif hücreler laminin/ornitin kaplı cam kapaklar üzerinde 2 gün boyunca 37 °C'de bir inkübatörde ve N2 ortamında% 5 CO₂ yeni BD tarafından oluşturulan hücrelerin nöronal farklılaşması başlatmak için.
2. 48 mL Nörobasal ortam, 500 μL L-glutamin, 1 mL B27 Takviyesi, 500 μL NEAA'dan oluşan nöronal farklılaşma ortamında daha fazla kültür hücreleri, PBS/%0,1 BSA'da 5 μg/250 μL'de 50 μL rekombinant insan glial türevli nörotrofik faktör (GDNF) ve 50 μL rekombinant insan beyni PBS/%0.1 BSA'da 5 μg/200 μL'de türetilmiş nörotrofik faktör (BDNF) ve PBS'de 2.9 g/50 mL askorbik asit çözeltisi 50 μL. Plakaları 37 °C ve%5 CO 2'de bir inkübatöre_{yerleştirin.}

6. Kan türevi nöral hücrelerin immünofluoresans mikroskopi analizi

1. Hücreleri yukarıda açıklandığı gibi 16 gün boyunca kültüre edin ve ortamı kaldırın.
   1. 75 mL steril su, 4 g paraformaldehit içeren önceden ısıtılmış fiksatif ile kuluçkaya yatırın. Gerektiğinde 10 N NaOH ekleyin ve çözelti temizleninceye kadar karıştırın. Ardından 10 mL 10x PBS, 0,5 mL MgCl_2, 2 mL 0,5 M EGTA ve 4 g sakkaroz ekleyin. 6 N HCl ile pH 7.4'e titrat ve Marchenko ve ark.^7'yegöre 15 dakika boyunca 100 mL steril suya getirin.
   2. Fiksatifi atın ve hücreleri her seferinde 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın. Hemen yeni yapılmış% 0.3 Triton X çözeltisi ekleyin ve hücreleri 5 dakika boyunca permeabilize edin. PBS ile 3 kez yıkayın ve PBS ve% 5 BSA tarafından yapılan bir engelleme çözümü ekleyin.
   3. Hücreleri oda sıcaklığında bir rocker plakasında 1 saat boyunca engelleyin.
   4. %1 BSA/PBS'de antikorların uygun seyreltilmesini hazırlayın ve hücreleri oda sıcaklığında 1,5 saat boyunca rocker plakasında antikor seyreltmeleri ile kuluçkaya yatırın. Hücreleri PBS ile her biri 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın, hücreleri DAPI ile kuluçkaya yatırın ve kapakları mikroskopta görselleştirme için montaj ortamı ile monte edin.
      NOT: Bu deneyde kullanılan doğrudan etiketli antikorlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

7. Yeni oluşturulan hücrelerin iletim elektron mikroskopisi analizi

1. TEM için hücreleri 8 kuyulu hazneli kaydıraklara tohumleyin.
2. Hücreleri 37 °C'de 1 saat boyunca % 3,5 glutaraldehitte sabitlayın, oda sıcaklığında ek bir saat için% 2 OsO_4'te sabitleme sonrası ve 2 saat 30 dakika boyunca 4 °C'de karanlıkta% 2 uranil asetat lekesi.
3. Son olarak, hücreleri damıtılmış suda durulayın, etanolde susuz bırakın ve bir gecede epoksi reçineye gömün. Ertesi gün numuneleri reçine sertleştirme için 72 saat boyunca 70 °C fırına aktarın.
4. Gömülü hücre kültürlerini oda kaydıraktan ve tutkaldan araldite bloklarına ayırın.
5. Seri yarı ince kesitleri (1,5 μm) bir makineyle kesin, cam slaytlara monte edin ve% 1 toluidin mavisi ile hafifçe lekeleyin.
6. Seçilen yarı ince bölümleri araldite bloklarına yapıştırın ve tekrarlanan dondurma (sıvı nitrojende) ve çözülme ile cam kaydıraktan ayırın.
7. Ultra ince bölümleri (0,06-0,08 μm) bir makineyle hazırlayın ve kurşun sitrat ile daha fazla kontrasta sahip olun.
8. Dijital kamera ile elektron tarama mikroskobu kullanarak mikrografiler elde edin.

Sonuçlar

Sonuçlar, bu yeni GM içermeyen yöntemin, kan progenitör hücrelerini doğrudan insan genomuna göre hareket etmeden en ilkel durumlarına döndürebildiğine dair kanıtlar sürmüştir.

Daha önce GPI bağlantılı proteine özgü antikor çapraz bağlantısının, WNT, NOTCH ve C-Kit gibi yüksek oranda korunmuş gelişimsel olarak ilgili genlerin PLCφ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN ile yukarı doğrulması yoluyla başlatıldığını, böylece HSC'lerin üretimine ilk adıma ve BD-PSC'le...

Tartışmalar

Bu çalışmada açıklanan insan hücrelerini yeniden programlamanın GM olmayan yöntemi, manipüle edilmemiş insan periferik kanından elde edilen ex vivo üretimine ve kendi kendini yenileyen PSC'lerin genişlemesine yol açan adanmışlık sürecini başlatan GPI bağlantılı insan membranı glikoproteinin arkasındaki sinyalizasyon (lar) makinelerinin çekirdek aktivasyonuna membran dayanmaktadır. Bu hücreler uygun ortamda kültürlendiğinde, farklı mikrop katmanlarına ait hücrelere yeniden ayırt ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumin Fraction V	Roth	T8444.4
Anti-GFAP Cy3 conjugate	Merck Millipore	MAB3402C3
Anti-MAP2 Alexa Fluor 555	Merck Millipore	MAB3418A5
Anti-Nestin Alexa Fluor 488	Merck Millipore	MAB5326A4
Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488	BD Pharmingen	560381
AO/PI Cell Viability kit	Biozym	872045	Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes	Sigma Aldrich	A8960-5G
B27 Serum free 50x	Fisher Scientific (Gibco)	11530536
Basic FGF solution	Fisher Scientific (Gibco)	10647225
Biocoll	Merck Millipore	L6115-BC	density gradient media
BSA Frac V 7.5%	Gibco	15260037
CD45 MicroBeads	Miltenyi	130-045-801	nano-sized magnetic beads
Cell counting slides Luna	Biozym	872010	Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Chamber Slides Lab-Tek	Fisher Scientific	10234121
D-MEM/F12	Merck Millipore	FG4815-BC
Durcupan	Sigma Aldrich	44610	epoxy resin
FBS	Merck Millipore	S0115/1030B	Discontinued. Available under: TMS-013-B
GDNF recombinant human	Fisher Scientific (Gibco)	10679963
GlutaMax 100x	Gibco	35050038	L-glutamine
Glutaraldehyde grade	Sigma-Aldrich	G5882-50ML
Heparin sodium cell	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Human BDNF	Fisher Scientific (Gibco)	11588836
Iscove (IMDM)	Biochrom	FG0465
Laminin mouse	Fisher Scientific (Gibco)	10267092
Lead citrate	Sigma-Aldrich	15326-25G
Luna FL Automated Cell Counter	Biozym	872040	Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
MACS Buffer	Miltenyi	130-091-221
MEM NEAA 100x	Gibco	11140035
MiniMACS Trennsäulen	Miltenyi	130-042-201
Morada digital camera	Olympus
Multiplatte Nunclon 4 wells	Fisher Scientific	10507591
N2 Supplement 100x	Fisher Scientific (Gibco)	11520536
Neurobasal Medium	Gibco	10888022
PBS sterile	Roth	9143.2
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957-50ML
Super Glue-3 Loctite	Henkel
TEM FEI Technai G2 Spirit	FEI Europe
Ultracut UC-6	Leica
Uranyl acetate C	EMS	22400