Fare Hipokampal Uyarıcı ve Sınıfa Özgü inhibitör Nöronların Farklı Organotipik Dilim Kültürü boyunca Tek Hücreli Elektroporasyon

Özet

Burada sunulan, çeşitli in vitro hipokampal dilim kültürü çağlarında hem uyarıcı hem de inhibitör nöronlarda genler sağlayabilen tek hücreli elektroporasyon için bir protokoldür. Yaklaşımımız, hücre-otonom ve hücreler arası fonksiyonları incelemek için kullanılabilecek tek tek hücrelerdeki genlerin kesin ve verimli bir şekilde ifade edilmesini sağlar.

Özet

Elektroporasyon, işlevlerini anlamak için belirli genleri hücrelere aktarmak için kritik bir yöntem olarak kendini belirlemiştir. Burada, fare organotipik hipokampal dilim kültüründe uyarıcı ve sınıfa özgü inhibitör nöronlarda in vitro gen transfeksiyonunun verimliliğini (~%80) en üst düzeye çıkaran tek hücreli bir elektroporasyon tekniğini açıklıyoruz. Büyük cam elektrotlar, tetrodotoksin içeren yapay beyin omurilik sıvısı ve hafif elektriksel darbeler kullanarak, kültürlü hipokampal CA1 piramidal nöronlarına ve inhibitör internöronlara ilgi çekici bir gen sunduk. Ayrıca, elektroporasyon, transfeksiyon verimliliğinde herhangi bir azalma olmadan 21 güne kadar kültürlü hipokampal dilimlerde gerçekleştirilebilir ve farklı dilim kültürü gelişim aşamalarının incelenmesine olanak sağlar. Çeşitli hücre tiplerinde genlerin moleküler fonksiyonlarını incelemeye olan ilgi artarken, yöntemimiz fare beyin dokusunda mevcut elektrofizyoloji ekipmanı ve teknikleri ile gerçekleştirilebilen in vitro gen transfeksiyonunda güvenilir ve basit bir yaklaşım göstermektedir.

Giriş

Moleküler biyolojide, bir araştırmacının en önemli hususlarından biri, işlevini ortaya çıkarmak için bir hücreye veya hücre popülasyonuna ilgi çekici bir genin nasıl teslimılacağıdır. Farklı teslimat yöntemleri biyolojik (örneğin, viral bir vektör), kimyasal (örneğin, kalsiyum fosfat veya lipit) veya fiziksel (örneğin, elektroporasyon, mikroenjeksiyon veya biyoliztik) olarak kategorize edilebilir^1,2. Biyolojik yöntemler oldukça verimlidir ve hücre tipine özgü olabilir, ancak spesifik genetik araçların geliştirilmesi ile sınırlıdır. Kimyasal yaklaşımlar çok güçlü in vitrodur, ancak transeksiyonlar genellikle rastgeledir; ayrıca, bu yaklaşımlar çoğunlukla yalnızca birincil hücreler için ayrılmıştır. Fiziksel yaklaşımlar arasında biyolistik teknik açıdan en basit ve en kolay olanıdır, ancak yine nispeten düşük verimlilikte rastgele transfeksiyon sonuçları üretir. Genetik araçlar geliştirmeye gerek kalmadan belirli hücrelere transfer gerektiren uygulamalar için, tek hücreli elektroporasyon^3,4'e bakıyoruz.

Elektroporasyon sadece alan elektroporasyonunu ifade etmek için kullanılırken, son yirmi yıl içinde, özgüllüğü ve verimliliği artırmak için çoklu in vitro ve in vivo tek hücreli elektroporasyon protokolleri geliştirilmiştir⁵,^6,7, elektroporasyonun genleri tek tek hücrelere aktarmak için kullanılabileceğini ve bu nedenle son derece hassas olabileceğini göstermiştir. Ancak, prosedürler teknik olarak zorlu, zaman alıcı ve nispeten verimsizdir. Gerçekten de, daha yeni makaleler mekanize elektroporasyon makinelerinin fizibilitesini araştırdı^8,9, bu tür robotikleri kurmakla ilgilenen araştırmacılar için bu engellerin birkaçını ortadan kaldırmaya yardımcı olabilir. Ancak daha basit araçlar arayanlar için, elektroporasyon, yani hücre ölümü, transfeksiyon yetmezliği ve pipet tıkanması ile ilgili sorunlar bir endişe olmaya devam ediyor.

Son zamanlarda daha büyük uçlu cam pipetler kullanan bir elektroporasyon yöntemi geliştirdik, daha hafif elektriksel darbe parametreleri ve eksistik nöronlarda önceki yöntemlere göre çok daha yüksek transfeksiyon verimliliği sağlayan ve ilk kez fare organotipik dilim kültürünün hipokampal CA1 bölgesindeki somatostatin ekspresyon inhibitör internöronlar da dahil olmak üzere inhibitör internöronlardaki genleri dönüştürmemizi sağlayan benzersiz bir basınç döngüsü adımı¹⁰. Ancak bu elektroporasyon yönteminin farklı inhibitör internöron tiplerinde ve nöronal gelişim evrelerinde güvenilirliği ele alınmamıştır. Burada, bu elektroporasyon tekniğinin genleri hem uyarıcı nöronlara hem de farklı internöron sınıflarına aktarabildiğini gösterdik. Daha da önemlisi, test edilen in vitro (DIV) dilim kültürü yaşı ne olursa olsun transfeksiyon verimliliği yüksekti. Bu yerleşik ve kullanıcı dostu teknik, in vitro fare beyin dokusu bağlamında farklı hücre tipleri için tek hücreli elektroporasyon kullanmak isteyen herhangi bir araştırmacıya şiddetle tavsiye edilir.

Protokol

Tüm hayvan protokolleri Massachusetts Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından incelendi ve onaylandı. Dilim kültürü hazırlama, plazmid hazırlama ve elektroporasyon da daha önce yayınlanan yöntemlerimizde ayrıntılı olarak açıklanmıştır ve ek bilgi için başvurulabilir¹⁰.

1. Dilim kültürü hazırlığı

1. Daha önce açıklandığı gibi fare organotipik hipokampal dilim kültürleri hazırlayın¹¹, her iki cinsiyetin doğum sonrası 6 ila 7 günlük farelerini kullanarak.
   1. Diseksiyon ortamını (mM olarak): 238 sakkarozdan oluşan organotipik dilim kültürü için hazırlayın, 2.5 KCl, 1 CaCl₂, 4 MgCl₂, 26 NaHCO₃, 1 NaH₂PO₄ve deiyonize suda 11 glikoz, daha sonra% 5 CO₂/ 95% O₂ ile 7.4 pH'a gaz.
   2. Organotipik dilim kültür medyasını hazırlayın: %78,8 (v/v) Minimum Esansiyel Orta Kartal, %20 (v/v) at serumu, 17,9 mM NaHCO₃, 26,6 mM glikoz, 2 M CaCl₂, 2 M MgSO₄, 30 mM HEPES, insülin (1 μg/mL) ve 0,06 mM askorbik asit, pH 7,3'e ayarlanmıştır. Omometre kullanarak omuzolariteyi 310-330 osmol'e ayarlayın.
   3. Hipokampiyi iki spatula kullanarak tüm beyinden ayırın ve bir doku helikopteri kullanarak dilimleyin (400 μm). İki ton sesi kullanarak dilimleri ayırın ve kesici uçların altındaki kültür ortamı (950 μL) ile dolu 6 kuyu plakasında 30 mm hücre kültürü kesici uçlarına aktarın.
2. Organotipik dilim kültürlerini bir doku kültürü inkübatöründe (%35°C, %5 CO₂₎saklayın ve dilim kültürü ortamını iki günde bir değiştirin.

2. Plazmid hazırlığı

1. Plazmidi ilgi genine hazırlayın.
   1. Bir pCAG vektörüne yeşil floresan protein (EGFP) geninin alt sıvısı.
   2. pCAG-EGFP plazmidini endotoksin içermeyen bir arıtma kiti ile arındırın ve 140 mM K-metansülfonat içeren dietil pirokarbonat arıtılmış sudan oluşan bir iç çözeltide çözün, 0,2 mM EGTA, 2 mM MgCl₂ve 10 mM HEPES, KOH ile pH 7,3'e ayarlanmıştır (plazmid konsantrasyonu: 0,1 μg/μL).

3. Cam pipet hazırlama

1. Bir mikropipette çekme üzerine borosilikat cam pipetleri (4,5 – 8 MΩ) çekin (Şekil 1A).
   NOT: Tüm hücreli yama kelepçe kayıtları için kullanılan cam pipetler elektroporasyon için idealdir.
2. Sterilize etmek için cam pipetleri 200°C'de geceleyin pişirin.
3. Elektrik direncini yaklaşık olarak görmek için pipet ucunun boyutunu diseksiyon mikroskobu altında kontrol edin.
   1. İsteğe bağlı:Pipeti elektroporasyon elektroduna bağlayarak pipet direncini doğrulayın ve pipet ucunu filtre sterilize edilmiş yapay beyin omurilik sıvısına (aCSF) manevra yapmak için mikromanipülatörü kullanın (mM): 119 NaCl, 2.5 KCl, 0.5 CaCl₂, 5 MgCl₂, 26 NaHCO₃, 1 NaH₂PO₄ ve 11 glikoz deiyonize suda, % 5 CO_{2 /95}O₂ ile 7.4 pH'a gazlanır. Elektroporatördeki okumayı kullanarak gerçek direnci onaylayın.
      NOT: Pipet ucu ne kadar keskinse, elektrik direnci o kadar büyük olacaktır. Pipet direnci 10 MΩ'nin altında olmalıdır. Yüksek pipet direncine sahip cam pipetler (Şekil 1B) genellikle tekrarlanan elektroporasyon sırasında ucu tıkanır.

4. Elektroporasyon teçhizatı kurulumu

1. Elektroporatörü, bir mikromanipülatör ve peristaltik pompa ile değişen bir masaya monte edilmiş dik bir mikroskopla donatılmış standart bir tam hücre elektrofizyoloji makinesine takın.
2. Elektroporatörün başlığını bir mikromanipülatöre takın ve bir çift hoparlörü elektroporatöre bağlayın. Elektroporatörü, hazır olduğunda nabız göndermek için kullanılabilecek bir ayak pedalı ile bağlayın.
   NOT: Hoparlörler açıldığında bir ton yayar, bu da elektrot üzerindeki elektrik direncinin bir göstergesidir. Bu, dikkatleri prosedürden uzaklaştırmadan dirençteki göreceli değişiklikleri belirlemeyi mümkün kılar.

5. Elektroporasyon hazırlığı

1. Dilim kültürü kesici uçlarını 6 kuyu tabağından 900 μL kültür ortamı ile yüklenmiş 3 cm Petri tabaklarına aktarın ve elektroporasyon yapmaya hazır olana kadar bir masa üstü CO₂ inkübatörde saklayın.
   1. Taze kültür eklemelerini, elektrik çarpmasından sonra kültür dilimlerine 3,5 cm Petri kabında en az 30 dakika boyunca dilim kültür ortamı (1 mL) ile ön kuluçkaya yatırın.
2. Makineyi temizleyin ve elektroporasyona hazırlayın.
   1. Gün için deneye başlamadan önce boruyu ve hazneyi sterilize etmek için hatları 5 dakika boyunca% 10 çamaşır suyu ile perfuse edin.
   2. Tamamen durulamak için hatları deiyonize otoklavlı suyla en az 30 dakika boyunca perfuse edin.
   3. Hatları 0.001 mM tetrodotoxin (TTX) içeren filtre sterilize edilmiş aCSF ile destekleyin.
      NOT: TTX, internöronların aşırı heyecanlanması nedeniyle hücresel toksisiteyi ve ölümü en aza indirir¹⁰.
3. Elektroporatörun darbe parametrelerini ayarlayın: –5 V genliği, kare darbe, 500 ms tren, 50 Hz frekans ve 500 μs darbe genişliği.
4. Cam pipeti 5 μL plazmid içeren iç çözelti ile doldurun.
   1. Kıstırılan hava kabarcıklarını pipet ucundan hafifçe dokunarak ve ucuna birden fazla kez dokunarak çıkarın.
   2. Ucu diseksiyon mikroskobu altında görselleştirerek veya pipet direncini kontrol etmek için 3.3.1 adımını tekrarlayarak hasara karşı kontrol edin.
      NOT: Uç hasarlıysa, cam pipet atılmalıdır ve bu adım daha önce 3.
5. Pipet ucunu elektrota güvenli bir şekilde takın ve hoparlörleri açın. Uç aCSF ortamıyla temas ettiğinde elektroporatörnün okumasını (pipet direnci) kaydedin.
6. Keskin bir bıçak kullanarak kültürün ekleme zarını kesin ve bir dilim kültürünü izole edin. Keskin açılı empepiler kullanarak dilim kültürünü elektroporasyon odasına dikkatlice aktarın ve konumunu bir dilim ankrajı ile sabitleyin.
   1. Dilim kültürünü, nöronal sağlıktaki değişiklikler veya işlev¹²gibi yan etkileri önlemek için bir seferde 30 dakikadan fazla inkübatörün dışında tutmayın.

6. İlgi çekici elektroporat hücreleri

1. Pipete ağızla veya boruya bağlı 1 mL şırıngar (0,2 - 0,5 mL basınç) kullanarak pozitif basınç uygulayın.
2. Pipet ucunu dilim kültürünün yüzeyine yakın bir yerde manevra yapmak için mikromanipülatör 3 boyutlu düğme kontrollerini kullanın.
3. Bir hedef hücre seçin ve mikroskopta görünür olan hücre yüzeyinde bir gamze oluşana kadar uygulanan pozitif basıncı koruyarak ona yaklaşın.
4. Basınç döngüleri gerçekleştirin.
   1. Boru ucu ile plazma zarı arasında gevşek bir sızdırmazlık oluşur, böylece membran pipet ucuna biraz yukarı çıkar. Hoparlörlerden gelen tonda bir artış dinleyerek pipet direncinde bir artış (~2,5 kat başlangıç direnci) gözlemleyin. Gamzenin yeniden şekillenebilmesi için pozitif basıncı hızlı bir şekilde yeniden uygulayın.
   2. Duraklatmadan en az iki basınç döngüsünü daha hemen tamamlayın, ardından 1 sn boyunca negatif basınç tutun.
      NOT: Döngüler arasında duraklamak, çok fazla basınç uygulamak veya negatif basıncı çok uzun süre tutmak önemli hücre hasarına neden olabilir ve muhtemelen elektroporasyon sırasında hücrenin ölmesine neden olabilir.
5. Hoparlörlerden gelen ton perdede sabit bir tepe noktasına ulaştığında ayak pedalını kullanarak elektroporatöre hızlı bir şekilde darbe yapın ve bu da en yüksek elektrik direncini gösterir. Nabzı göndermeden önce 1 s'den fazla tepe direncinde beklemeyin.
   NOT: Bu protokolü kullanırken hedef dışı elektroporasyon gözlemlemedik¹⁰. Sadece basınç döngüleri sırasında cam pipetle temas eden hücreler transkröme edildi. Pipetin diğer nöronların yakınında konumlandırılması gen transfeksiyonla sonuç vermez.
6. Pipeti basınç uygulamadan hücreden yaklaşık 100 μm geri çek.
7. Direncin 5.5.
   1. Elektroporasyondan sonra görsel olarak veya önemli ölçüde artmış (%>15 daha yüksek) pipet direnci ile belirtilen potansiyel tıkanıklıkları pozitif basınç uygulayarak çıkarın.
      NOT: Görünür bir tıkanıklık yoksa ve direnç hala önemli ölçüde daha yüksekse, pipeti atın ve yeni bir tane kullanın. Ortalama olarak, kullanıcı dikkatli olursa 20 elektroporasyon olayı için bir pipet kullanılabilir¹⁰.
8. Elektroporasyondan sonra, dilim kültürünü taze bir kültür kesici ucuna aktarın ve 3 güne kadar inkübatörde 35 ° C'de kuluçkaya yatırın.

7. Organotipik hipokampal dilim kültürlerinin sabitlenmesi, lekelenmesi ve görüntülenmesi

1. Elektroporlu organotipik dilim kültürlerini transeksiyondan 2 – 3 gün sonra% 4 paraformaldehit ve% 4 sakkaroz ile 0.01 M fosfat tamponlu salin (1x PBS) oda sıcaklığında 1.5 saat sabitleyin.
2. 2 saat boyunca 0,1 M fosfat tamponunda (1x PB) %30 sakkarozda sabitleyici ve kuluçka dilimlerini çıkarın.
3. Dilimleri bir slayt camına yerleştirin ve slayt camını ezilmiş kuru buzun üzerine koyarak dondurun. Dilimleri oda sıcaklığında çözün ve 1x PBS ile dolu 6 kuyu plakasına aktarın.
4. Dilimleri GDB tamponunda fare anti-GFP ve tavşan anti-RFP antikorları (%0,1 jelatin, %0,3 Triton X-100, 450 mM NaCl ve %32 1x PB, pH 7,4) ile oda sıcaklığında 2 saat boyunca lekeleyin.
5. Her yıkama için oda sıcaklığında üç kez 1x PBS ile dilimleri yıkayın.
6. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca GDB tamponunda anti-fare Alexa 488 konjuge ikincil antikor ve anti-tavşan Alexa 594 konjuge ikincil antikor ile dilimleri kuluçkaya yatırın. Dapi (4 μg/mL) ile dilimleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1x PBS'de kuluçkaya yatır.
7. 1x PBS'li dilimleri oda sıcaklığında üç kez yıkayın ve her yıkamada 3 dakika yıkayın.
8. Montaj ortamını kullanarak dilimleri cam slaytlara monte edin ve floresan görüntüleme gerçekleştirin.

Sonuçlar

Tek hücreli elektroporasyonumuz genleri görsel olarak tanımlanmış uyarıcı ve inhibitör nöronlara tam olarak ulaştırabilir. Üç farklı nöronal hücre tiplerini üç farklı zaman noktasında elektropore ettik. Nöronları ifade eden parvalbumin (Pv) veya veziküler glutamat tip 3 (VGT3), sırasıyla Pv/TdTomato ve VGT3/TdTomato hatları olarak adlandırılan TdTomato (kırmızı floresan proteinin bir çeşidi) muhabir hattı (Jax #007905) ile Pv cre (JAX #008069) veya VGT3^cre (JAX #018147) çizgi...

Tartışmalar

Burada hem uyarıcı hem de inhibitör nöronları yüksek verimlilik ve hassasiyetle transfect eden bir elektroporasyon yöntemini tarif ediyoruz. Optimize edilmiş elektroporasyon protokolümüz, yüksek verimli gen transfeksiyonunu elde etmek için üç yenilikçi atılım gerçekleştirmektedir. İlk modifikasyonumuz pipet boyutunu daha önce yayınlanan^protokollerekıyasla artırmaktı 3^,5,6. Bu değişiklik, pipet tıkanma...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid preparation
Plasmid Purification Kit	Qiagen	12362
Organotypic slice culture preparation
6 Well Plates	GREINER BIO-ONE	657160
Dumont #5/45 Forceps	FST	#5/45	Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation
Flask Filter Unit	Millipore	SCHVU02RE	Filtration and storage of culture media
Incubator	Binder	BD C150-UL
McIlwain Tissue Chopper	TED PELLA, INC.	10180	Tissue chopper for organotypic slice culture preparation
Millicell Cell Culture Insert, 30 mm	Millipore	PIHP03050	Organotypic slice culture inserts
Osmometer	Precision Systems	OSMETTE II
PTFE coated spatulas	Cole-Parmer	SK-06369-11
Scissors	FST	14958-09
Stereo Microscope	Olympus	SZ61
Sterile Vacuum Filtration System	Millipore	SCGPT01RE	Filtration and storage of aCSF
Electrode preparation
Capillary Glasses	Warner Instruments	640796
Micropipetter Puller	Sutter Instrument	P-1000	Puller
Oven	Binder	BD (E2)
Puller Filament	Sutter Instrument	FB330B	Puller
Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1
3.5 mm Falcon Petri Dishes	BD Falcon	353001
Airtable	TMC	63-7512E
CCD camera	Q Imaging	Retiga-2000DC	Camera
Electroporation System	Molecular Devices	Axoporator 800A	Electroporator
Fluorescence Illumination System	Prior	Lumen 200
Manipulator	Sutter Instrument	MPC-385	Manipulator
Metamorph software	Molecular Devices		Image acquisition
Peristaltic Pump	Rainin	Dynamax, RP-2	Perfusion pump
Shifting Table	Luigs & Neuman	240 XY
Speaker	Unknown		Speakers connected to the electroporator
Stereo Microscope	Olympus	SZ30
Table Top Incubator	Thermo Scientific	MIDI 40
Upright Microscope	Olympus	BX61WI
Fluorescence imaging #2
All-in-One Fluorescence Microscope	Keyence	BZ-X710