Yara Yanıtları Sırasında Zebra Balığı Nötrofillerdeki Kemokin Reseptörlerinin Canlı Görüntülenmesi

Özet

Burada, zebra balığı nötrofillerde kemoattractant reseptör dinamiklerinin canlı görüntüleme ve kantitatif analizini gerçekleştirmek için protokolleri açıklıyoruz.

Özet

Kimyasal gradyanlar tarafından lökosit rehberliği, immün yanıtlar için gereklidir. Nötrofiller, önemli antimikrobiyal işlevleri yerine getirdikleri doku hasarı bölgelerine alınan ilk hücrelerdir. Bu lokuslara yapılan kaçakçılık, kemokinler de dahil olmak üzere çeşitli enflamatuar kemoattractantlar tarafından düzenlenmektedir. Moleküler düzeyde, kemoattractant sinyalleme, karşılık gelen reseptörlerin hücre içi trafiği ile düzenlenir. Bununla birlikte, kemokin reseptörlerindeki hücre altı değişikliklerin hücre ve doku düzeyinde lökosit migrasyon dinamiklerini nasıl etkilediği belirsizliğini korumaktadır. Burada, doku hasarına inflamatuar yanıtlar sırasında nötrofillerde kemokin reseptör dinamiklerinin canlı görüntüleme ve kantitatif analizi için bir metodoloji açıklanmaktadır. Bu araçlar, zebra balığı nötrofillerinde diferansiyel kemokin reseptörü kaçakçılığının, doku hasarı bölgelerinde nötrofil kümelenmesini ve dağılmasını koordine ettiğini ortaya koymuştur. Bunun, enflamatuar yanıtların kendi kendine nasıl çözüldüğünü anlamamız için etkileri vardır. Tarif edilen araçlar, çeşitli fizyolojik ve patolojik ortamlarda nötrofil göç paternlerini anlamak için kullanılabilir ve metodoloji diğer sinyal reseptörlerine genişletilebilir.

Giriş

Lökosit göçü immün yanıtlar için büyük önem taşımaktadır. Bağışıklık hücreleri, dokuları ve kan damarlarını geçebilen ve mikroplara veya diğer önemli konakçı hücrelere doğru yönlü olarak göç etmek için bir dizi kimyasal rehberlik ipucunu algılayabilen prototipik göçmen hücrelerdir. Doğru rehberlik, kemokinlerin en belirgin kategori^1'i temsil ettiği kemoattractantların tanınmasına dayanır. Kemokinler, oldukça spesifik yedi transmembran G protein eşleşmiş reseptörleri tarafından tanınır. Kemokin bağlanması üzerine, kemokin reseptörleri, ilişkili trimerik G proteinlerinin aktivasyonuna ve bunların sitoiskelet değişikliklerini ve yönlendirilmiş migrasyonunu destekleyen fonksiyonel sinyal alt birimlerine ayrışmasına yol açan konformasyonu değiştirir¹. İkincil olarak, kemokin reseptörleri fosforile edilir ve bu modifikasyon, cezbedici için duyarsızlaştırmaya yol açar, bunu hızlı yeniden duyarlılaştırma / geri dönüşüm veya hücre içi bozunma ve hücre yüzeyinden aşağı regülasyon^{izleyebilir 2}. Bu reseptör dinamikleri, hücreler tarafından alınan sinyallemenin süresini ve dozunu etkiler, ancak lökosit migrasyon davranışını nasıl etkilediklerini in vivo olarak aydınlatmak zor olmuştur.

Geleneksel memeli sistemlerinde canlı lökositlerdeki reseptör dinamiklerinin izlenmesi çeşitli zorluklarla karşı karşıyadır. Canlı çalışmalar için, floresan proteinlerle reseptör füzyonları hücrelerde eksprese edilmelidir. Bu, birincil lökositlerde, özellikle nötrofillerde zordur ve şimdiye kadar yapılan çalışmalar, kemokin reseptörlerini ^3,4 eksprese etmek için vekil nötrofil hücre hatlarını kullanmıştır. Lökositlerin bilgilendirici kaçakçılık kusurları^5,6 olan bir floresan reseptörü veya mutant reseptörleri eksprese ettiği transgenik fare modellerinin oluşturulması^, önemli miktarda zaman ve kaynak yatırımı gerektirir. Bu durumlarda bile, canlı hayvanda görüntüleme reseptör dinamikleri için görüntüleme çözünürlüğü ve kontrastı sınırlı olabilir ve çalışmalar sabit doku kesitleri^5'te immünohistokimyayı kullanmıştır. Bu teknik zorluklar göz önüne alındığında, kemoattractant reseptör dinamiklerinin canlı bir doku ortamında hücre davranışını nasıl etkilediğine dair anlayışımız şu anda sınırlıdır.

Burada, zebra balığı nötrofillerinde reseptör kaçakçılığını izlemek için bir metodoloji sunuyoruz. Zebra balığı, fareler gibi genetik olarak izlenebilir, ancak transgenez, verimli transpozon sistemleri ve doğrudan zigot manipülasyonu⁷ kullanılarak nispeten daha basittir. Şeffaf larva ideal olarak görüntülemeye uygundur. Kemokin reseptör dinamikleri, primordiyan germ hücrelerinde ve lateral line primordiumda, floresan muhabirler ^8,9,10 ile karşılık gelen füzyonların ekspresyonu ile görselleştirilmiştir. Zebra balığı larvaları, memeli nötrofillerine göre oldukça korunmuş genetik ve hücresel özelliklere sahip olgun nötrofiller ile donatılmıştır. Sitoiskelet dinamiği ve polarite düzenleyicileri gibi hücre altı sinyal dinamikleri, bu hücrelerde karşılık gelen transgenik çizgilerin üretilmesiyle görselleştirilmiştir^11,12,13. Son zamanlarda, doku hasarına inflamatuar yanıtlar sırasında nötrofillerdeki kemokin reseptör dinamiklerini görselleştirdik ve fonksiyonel olarak analiz ettik¹⁴. Burada, nötrofillerde kemokin sinyalizasyonu için transgenik muhabir hatlarının üretimini, canlı görüntüleme için embriyoların hazırlanmasını, nötrofil sinyallemesini incelemek için bir yara tahlili ve görüntülerin elde edilmesi ve analizi için protokolü açıklıyoruz. Ayrıca, aday ligandlara kemokin reseptör yanıtlarını test etmek için bir yan protokol sağlıyoruz, bu da karakterize edilmemiş reseptörlerde ligand tanıma paternleri oluşturmaya çalışırken yararlıdır. Bu teknikler, endojen kemokin ekspresyonunun inhibisyonu veya değiştirilmiş ligand kaynaklı kaçakçılık ile mutant reseptörlerin üretilmesi gibi daha ileri genetik manipülasyonlarla kombinasyon halinde, spesifik sinyal dinamiklerinin lökosit davranışını in vivo olarak nasıl etkilediğini sorgulamak için kullanılabilir. Floresan etiketli kemokin reseptörlerini ifade eden transgenik çizgiler, doğrudan antikor boyama ile tespit edilmesi zor olan endojen kemokin gradyanları için muhabir olarak da kullanılabilir. Açıklanan metodoloji, muhabirlerin üretimini diğer immüno-sinyal reseptörlerine genişletmek için kapsam sağlar.

Protokol

NOT: Tüm zebra balıkları, ARRIVE yönergelerine ve İngiltere İçişleri Bakanlığı düzenlemelerine, İngiltere Hayvanları (Bilimsel Prosedürler) Yasası 1986'ya göre tutulmuştur.

1. Lökositlerde reseptör kaçakçılığını görüntülemek için transgenik muhabir zebra balığı larvalarının oluşturulması

1. İlgilenilen floresan etiketli reseptörün dokuya özgü ekspresyonu için Tol2 tabanlı yapı oluşturun. Nötrofiller için, lizozim C¹⁵ ve miyeloperoksidaz geni^16'dan promotör dizileri kullanın. Yapı, tek bir floresan proteini (örneğin GFP), bir tandem floresan zamanlayıcı (örneğin, hızlı katlanan bir GFP ve daha yavaş olgunlaşan bir etiketRFP ^8,14,17) veya muhabir GFP'nin bisistronik bir ifadesi ve bir kontrol membranı işaretleyicisi⁹ ile bir füzyon olarak tasarlanabilir (yaklaşımı seçerken dikkat edilmesi gereken noktalar için bkz.
   NOT: Bu yapı, reseptör ekspresyonunun endojen seviyelerini özetlemez, ancak ilgilenilen hücre tipinde yüksek düzeyde reseptör ekspresyonu elde etmek için yararlıdır. Floresan etiketinin konumuna karar vermek için benzer reseptörler 3,5,6,8,9,10,14 hakkındaki literatüre bakın.
2. Standart hayvancılık uygulamalarını takip eden vahşi tip yetişkin erkek ve dişileri içeren bir tank kurun¹⁸, yumurta yumurtlamasından bir gün önce bir bariyerle ayrılmış.
3. Yumurta yumurtlama gününde, 12.5 ng / μL Tol2 DNA yapısı ve 17.5 ng / μL transpozaz mRNA⁷ içeren mikroenjeksiyon için transgenez karışımı hazırlayın. Işıklar sabah geldikten kısa bir süre sonra balık tanklarındaki bariyerleri kaldırın (bu farklı balık tesislerinde değişebilir) ve mRNA enjeksiyonu için 15 dakika içinde yumurta toplayın.
   NOT: Karışımdaki transpozaz mRNA'sının bozulmasını önlemek için DNA çözeltisinin RNaz içermeyen olduğundan emin olun. Bunu atlatmak için bir seçenek, yumurtaları ayrı Tol2 yapısı ve transpozaz çözeltileri ile enjekte etmektir.
4. Zebra balığı yumurtalarının transgenezi ve mikroenjeksiyonu için standart protokolleri izleyin¹⁹.
5. Çözeltinin 1 nL'sini tek hücreli aşamadaki embriyoların hücresine enjekte edin.
   NOT: İfade sonuçları, hücrenin içine enjekte edildiğinde ve hücrenin içinde net bir şekilde bulunmayabilecek enjeksiyonları atarken daha tutarlıdır. Tek hücreli aşama embriyoları, 2-16 hücreli aşama embriyoları enjekte ederken hücre başına hacim enjeksiyonunun değişkenliği nedeniyle hedeflenir. Bir seçenek, tek hücreli aşama enjeksiyonlarını, farklı etkinliklere sahip olmaları durumunda, daha sonraki enjeksiyonların partilerinden ayırmak olacaktır.
6. Enjekte edilen embriyoları günün ilerleyen saatlerinde kontrol edin ve debriyajı sağlıklı tutmak için döllenmemiş veya ölü yumurtaları çıkarın.
7. Döllenme sonrası 3 günde (dpf), larvaları floresan mikroskop altında tarayın. Belirteç, nötrofillerde, özellikle de bu hücreler bakımından zengin olan kaudal hematopoetik dokuda (CHT) görülecektir.
   NOT: Etiketlenen hücrelerin yüzdesi farklı yapılara göre değişir, ancak genellikle nötrofillerin% 20-60'ının yapıyı ifade etmesi beklenir. Düşük yüzdeler genellikle yetişkin aşamasında daha fazla tarama öngörmektedir. Balıkları büyütmeden önce bu embriyoların bir örneğinde, daha yüksek çözünürlüklü bir görüntüleme yaklaşımıyla, membrandaki reseptörün doğru lokalizasyonunu doğrulamak da iyi bir uygulamadır.
8. Standart hayvancılık uygulamalarını takiben pozitif larvalar yetiştirin²⁰. Bunlar F0 neslini temsil eder.
9. 3 aylıkken, kurucular için F0 balıklarını tarayın. Transgenik olmayan vahşi tipte bireysel balıkları çaprazlayın ve diseksiyon kapsamı altında görüntüleyerek reseptörün ekspresyonu için yavrularını 3 dpf'de tarayın. Her yapıya göre değişen transgenez başarısına bağlı olarak, haçların bir alt kümesinde pozitif yavruların bir yüzdesini gözlemleyin.
   NOT: İyi transgenez için, yetişkinlerin yaklaşık üçte biri ila yarısı pozitif yavrular verecektir. Bir debriyajda pozitif olan yavruların yüzdesi, yerleştirilen transgenlerin kopya sayısına göre değişir ve% 10-60 arasında olabilir. Tek yerleştirme transgeniklerini tanımlamak için debriyajlar içindeki mendel oranlarını takip etmek yararlıdır (bunlar, pozitif larvaların% 50'lik bir oranını arayarak F2 kavramalarında daha kolay tanımlanır)²⁰.
10. F1 neslini temsil eden pozitif yavruları büyütün.
11. 3 aylıkken, kararlı F2 transgenik hattı oluşturmak için F1 yetişkinlerini aynı şekilde tarayın.
12. Transgenin nötrofil-spesifik ekspresyonunu doğruladıktan sonra F2 larvaları üzerinde deneyler yapın.
    NOT: Transgenez sırasında, farklı seviyelerde reseptör ekspresyonu gözlemlenebilir ve biyolojik sorular için en uygun ekspresyon seviyesini elde etmek için farklı transgenik kavramaların tutulması önerilir. İlk sonuçlar F0 veya F1 larvalarında elde edilebilir.

2. Lökosit yara yanıtlarını değerlendirmek için zebra balığı embriyolarının toplanması

1. İstikrarlı bir transgenik muhabir hattı kurduktan sonra, yetişkin ve dişi transgenik balıklar arasında bir haç oluşturun ve ertesi sabah yumurta toplayın.
2. Embriyoları E3 ortamında (veya yumurta suyu¹⁸) 28.5 ° C'de büyütün.
3. İsteğe bağlı olarak, 24 hpf'de, embriyoları 5 dakika boyunca% 0.003 ağartıcı ile desteklenmiş 50 mL E3 ortamı içeren bir santrifüj tüpünde inkübe edin. Daha sonra, embriyoların tabana yerleşmesine izin vermek için tüpün birkaç dakika bekletilmesini sağlayarak E3 ortamında 3 kez durulayın ve daha sonra ortamı boşaltın ve değiştirin.
   NOT: Bu, larvaların enfeksiyona maruz kalması üzerinde bir kontrol seviyesi sağlar ve bu da yaralanma sırasında lökositlerin davranışını etkileyebilir.
4. Beyazlatmadan sonra, melanin sentezini önlemek için embriyoları% 0.003 1-fenil-2-tiyoüre ile takviye edilmiş E3 ortamında tutun. Genellikle mantar enfeksiyonlarını önlemek için kullanılan metilen mavisi, doku otofloresansını en aza indirmek için buraya eklenmez.
5. Larvaların doğal olarak yumurtadan çıkmasına izin verin ve nötrofiller bol olduğunda 3 dpf'de kullanın²¹.

3. Larvaların ventral yüzgeç yaralanması

1. Larvaları yaralama için hazırlayın. Bol miktarda nötrofil gözlendiğinde larvaları 2.5-3.5 dpf'de kullanın. Larvaları 160-200 mg / L trikain MS222 ile desteklenmiş E3 ortamına aktarın.
   NOT: Konsantre trikain çözeltileri önceden hazırlanmalı ve alikotlarda dondurulmalı ve gün içinde çözülmelidir.
2. Larvaları anestezi altına aldıklarından emin olmak için E3 + trikain ortamında 15 dakika bekletin. Küçük bir boya fırçası veya benzeri bir aletle hafifçe dokunarak yanıtlarını kontrol edin.
3. Bir floresan diseksiyon kapsamı altında transgenik reseptör ekspresyonuna sahip larvaları seçin.
4. Larvaları yaralama için E3 + trikainde 120 mm'lik bir Petri kabına aktarın. Steril bir neşter kullanmak, diseksiyon kapsamı altında gözlemlerken larvaların ventral yüzgecini keser (Şekil 1).
   NOT: Buradaki fikir, önemli nötrofil alımına neden olacak kadar derin bir kesim yapmaktır, ancak CHT'nin damarlarını kesmeden. Kesim, CHT eksenine dik olarak yapılır, böylece insizyon neredeyse CHT damarlarına ulaşır. Bu biraz pratik gerektirir ve önce bu amaç için üretilmeyen larvalar üzerinde gözetim altında yapılmalıdır (örneğin, başka bir deneyden aşırı larva).

4. Canlı görüntüleme için larvaların hazırlanması

1. Düşük erime noktalı (LMP) agarozu E3 ortamında ısıtarak eriyerek çözün ve sıvı% 2'lik bir agaroz çözeltisi elde edin.
2. Bu çözeltinin 60 °C'ye kadar soğumasına izin verin.
   NOT: Farklı larvaların montajı arasındaki agaroz ayarını önlemek için agarozlu bir şişeyi veya tüpü 60 ° C'de bir inkübatörde tutun.
3. Mikroskopi görüntüleme için cam tabanlı bir kapta 0,5 mL sıvı LMP + E3 pipeti.
4. Cam alt tabakta 0,5 mL E3 + 2x Trikain ile birlikte yaralı, anestezi uygulanmış bir zebra balığı larvasını pipetleyin.
5. İki çözeltiyi nazikçe karıştırarak %1 LMP/1x Trikain agaroz/E3 çözeltisi elde ederek kabarcık oluşumunu önleyin. Embriyoyu yanal olarak yönlendirin ve yavaşça aşağı doğru itin, böylece balığın kaudal kısmı cama mümkün olduğunca yakın olur.
   NOT: Görüntülenecek doku, ters çevrilmiş mikroskopla görüntüleme yaparken cam tabana mümkün olduğunca yakın olmalıdır. Larva için oryantasyon ayarı hızlı olmalıdır, böylece agaroz larva yerleştirilmeden önce ayarlanmaz.
6. Agaroz çözeltisinin soğumasına izin verin ve 5-10 dakika katılaşın. Agarozun ayarlanıp ayarlanmadığını, agaroz jeline küçük bir boya fırçası veya ucu ile hafifçe dokunarak test edin.
7. Agaroz katı hale geldiğinde, görüntüleme plakasına 0.2 mg / mL trikain ile desteklenmiş 2 mL E3 ekleyin.

5. Canlı konfokal görüntüleme

NOT: Dönen disk konfokal mikroskop veya eşdeğeri üzerindeki görüntü embriyoları (Şekil 2). Bir lazer tarama mikroskobu da kullanılabilir, ancak dinamiklerin zamansal çözünürlüğü daha sınırlayıcı olacaktır. Yaralı larvaları getirmeden önce görüntüleme ayarlarını hazırlayın, böylece yanıt yaralamadan sonra mümkün olduğunca çabuk görüntülenebilir. Nötrofiller 5 dakika içinde yaraya ulaşır ve ilk gelen hücrelerdeki reseptörler bu zaman dilimi içinde içselleşebilir. Uygulama ile yaralanma sonrası 15 dakika kadar erken bir sürede görüntü elde etmek mümkündür.

1. Mikroskopu açın: üretici talimatlarına göre lazer, kamera ve bilgisayar.
2. Görüntüleme ayarlarını yapmak için edinme yazılımını kullanın. Uygun floroforlar için lazerleri seçin ve önceki deneylere dayanarak yaklaşık maruz kalma sürelerini seçin (488 nm ile GFP ve 561 nm lazer ile tagRFP elde edin).
3. Plakayı, agaroz setlerinden sonra mümkün olan en kısa sürede, monte edilmiş embriyo ile birlikte, konfokal görüntüleme dönen disk platformuna aktarın.
4. Sahne joystickini kullanarak çanaktaki balıkları bulmak için mikroskop göz parçasını kullanın.
5. Odaklama düğmesini kullanarak yara bölgesine odaklanın.
   NOT: İlgi alanını bulmak için düşük büyütmeli bir hava hedefi (10x) kullanmak daha kolay olabilir.
6. Yaranın etrafında görüntülenecek alanı seçin. Yeterli çözünürlüğü elde etmek için yüksek sayısal diyafram açıklığına sahip 30x/40x objektif kullanın.
7. Pozlama süresini ayarlamak için yazılım düğmelerini kullanın, böylece floresan işaretleyici iyi kontrastla ancak sinyali doyurmadan görülebilir.
   NOT: Floresan maruziyetini en aza indirmek ve hızlandırılmış çekimde zamansal çözünürlüğü en üst düzeye çıkarmak için pozlama süresi mümkün olduğunca düşük olmalıdır. Lazer gücü, lazerin durumuna bağlıdır, ancak dinamik görüntüleme için yeterince düşük pozlama süresine izin veren bir seviyeye ayarlanması gerekir.
8. Görüntüye ses seviyesini z-stack olarak seçmek için yazılım düğmelerini kullanın
9. İstenilen süre boyunca her 30 saniyede bir zaman atlaması ayarlayın.
   NOT: Steril ventral yüzgeç yaraları için, maksimum işe alım 2-3 saat gözlenir.
10. Hızlandırılmış çekimi başlatmadan önce, görüş alanını belgelemek için parlak bir alan anlık görüntüsü alın. Mümkünse, hızlandırılmış filmde parlak alan elde edin.

6. Zebra balığı nötrofillerinde reseptör içselleştirmesinin nicelleştirilmesi

1. Görüntü alma zaman aralığını ve görüntünün piksel boyutunu kaydedin. Görüntülemenin yaralanmadan kaç dakika sonra başladığının kaydını tutun.
2. Görüntüyü yazılım arabirimine sürükleyerek Fiji'yi kullanarak görüntü veri kümelerini açın, zaman kaydırıcısını kullanarak her veri kümesi için temsili bir ilgi çerçevesi seçin (ör. yaralama sonrası 1-1,5 saat sonra) ve kaydedin.
3. Görüntü veri kümesini işlemek için MATLAB ile devam edin.
4. Yeni bir komut dosyası oluşturun ve görüntü okuma (Ek Dosya 1'de merkezcil tanım için 'select_neutrophils.m' olarak adlandırılan komut dosyasında satır 6), açma (Ek Dosya 1'de satır 11) ve görüntü üzerindeki noktaların manuel seçimi (Ek Dosya 1'de satır 12) için işlevler ekleyin.
5. Bu komut dosyasını çalıştırarak ilgilendiğiniz çerçeveyi açın (Ek dosya 1), görsel inceleme ile analiz edilecek nötrofilleri tanımlayın, üzerlerine tıklayın ve hem ventral yüzgeç yarasında hem de CHT'de merkezcillerinin bir tahminini kaydedin.
   NOT: CHT'deki mobilize edilmemiş nötrofiller, reseptör dağılımı sabit kalan nötrofiller için dahili bir referans görevi görür. Bu, yaradaki hücrelerin kontrast değerlerinin iç referansa normalleştirilmesini sağlar.
6. Aşağıdaki adımlarda açıklandığı gibi aktif kontur tekniği^22'yi kullanarak her çerçevedeki nötrofillerin segmentasyonuna devam edin.
7. Aktif konturlara göre segmentasyon için gereken meta verileri (yani, yineleme sayısı, kontur yanlılığı, tahmini merkezci vb.) dahil etmek için bir işlev oluşturun. ²² ( Ek Dosya 2'deki 'yara verileri.m' bölümüne bakınız).
8. Her nötrofilin segmentasyonu için gerekli bilgileri girmek üzere 'wound_data.m' işlevini çağıran bir komut dosyası oluşturun ( Ek Dosya 3'te 'calc_contrast.m' olarak adlandırılan komut dosyasında satır 28).
9. Görüntü okuma için komut dosyası komutlarını ekleyin ( Ek Dosya 3'teki satır 32).
10. Giriş görüntüsüne eşit büyüklükte siyah bir görüntünün (yani piksel değerlerinin sıfır olduğu görüntü) oluşturulmasını (Ek Dosya 3'te satır 44) ve her nötrofilin merkezinin etrafında 10 × 10 piksellik bir karenin tanımını (Ek Dosya 3'te satır 45) ekleyin.
11. Aktif konturlar (Ek dosya 3'teki satır 48-49) kullanarak nötrofil segmentasyonunu ve küçük yanlış algılanan nesnelerin kaldırılmasını ( Ek Dosya 3'te satır 52) dahil edin.
    NOT: İlk segmentasyon konturu, piksel yoğunluklarına, yineleme sayısına ve kontur yanlılığına bağlı olarak aktif kontur tekniği ile gelişen merkezin etrafındaki karedir. Segmentasyonun sonucu, pikselleri 1 değerine sahip nötrofil alanı dışında tüm piksellerin 0 değerine sahip olduğu ikili bir maskedir.
12. Yalnızca nötrofilin piksel yoğunluklarını elde etmek için bölümlenmiş ikili görüntünün orijinal görüntüyle çarpımını ekleyin, görüntünün geri kalanı bir sayı değildir, bu nedenle hesaplamalara katkıda bulunmaz ( Ek Dosya 3'teki 56-57. satırlar).
13. Her nötrofil (GLCM)^14,23 için gri düzeyli birlikte oluşum matrisinin hesaplamasını ekleyin (Ek Dosya 3'te satır 61). GLCM, piksel yoğunluğu açısından piksellerin göreceli konumunu gösteren görüntünün başka bir temsilidir.
14. GLCM'ye dayalı nötrofilin kontrastının hesaplanmasını dahil edin ( Ek Dosya 3'teki 62,65 satırları). Kontrast metriği, komşu pikseller arasındaki yoğunluk farklılıklarını ölçer. Pikseller, yoğunluktaki yerel zirvelerin boyutuna göre ampirik olarak ayarlanabilen belirli mesafelerdeki piksellerle karşılaştırılır. Bir gösterge olarak, 0.389 μm'lik bir piksel boyutuna sahip görüntüler için, reseptör veziküler dağılım gösterdiğinde, her parlak nokta 5 piksel aralığındaydı. Bu nedenle, yoğunluklar birbirinden 5 piksel aralıklı piksellerle karşılaştırılmıştır.
15. Ventral yüzgecindeki tek tek nötrofiller için değerleri ayrı ayrı kaydetmek için komutlar ekleyin ( Ek Dosya 3'teki satır 68).
16. Tüm CHT nötrofillerinden ortalama nötrofil kontrast değerinin hesaplanmasını, yaradaki nötrofiller için olduğu gibi dahil edin (Ek dosya 3'teki satır 72-119). CHT nötrofiller için, 'cht_data.m' fonksiyonunu çağırın ( Ek Dosya 4'te satır 77).
17. Yaradaki bireysel nötrofillerin kontrast değerinin normalleştirilmesini, yukarıda adım 6.16'da (yani, bölünme) hesaplanan CHT nötrofillerin ortalama kontrastına dahil edin ( Ek Dosya 3'teki satır 122). Bu, yanıt vermeyen hücreleri kontrol etmeye göre bireysel yanıt veren hücrelerde reseptör görünümünün ne kadar 'noktalı' olduğunu yansıtan normalleştirilmiş bir kontrast verir (Şekil 3 ve Şekil 4).
18. Yazılımdaki çalıştırma sembolünü tıklatarak komut dosyasını (Ek Dosya 3) çalıştırın.
19. Farklı koşullar için tüm adımları yineleyin.
20. Bir sütun tablosu oluşturarak farklı koşulların sonuçlarını içe aktarmak, sonuçları çizmek ve ortalama değerler arasındaki farkın anlamlılığını kontrol etmek için istatistiksel test yapmak üzere istatistiksel yazılım kullanın (bkz.
    NOT: Analiz için kodlar GitHub'da https://github.com/LeukocyteMotionAndDynamics/ReceptorTraffic

7. Erken embriyolarda kemokin yanıt testleri

NOT: Bu, bir aday kemokine yanıt olarak reseptör dağılımı değişikliklerinin test edilmesine izin veren isteğe bağlı bir yan deneydir ve reseptör yapılarının nötrofil ekspresyonu ile ilgili yukarıda açıklanan deneylerden bağımsızdır. Reseptörler arasındaki ligand kaynaklı kaçakçılıktaki farklılıkların, ligand seviyeleri^14'ü doyurduğu için bu teknikle belirlenmesi zordur. Bununla birlikte, bu sistemde bir reseptörün ligand-içselleştirilmesi görülürse, bu, ligand kimliğinin belirsiz olduğu durumlarda ligandın reseptör tarafından tanındığının bir göstergesi olabilir. Bu yararlıdır, çünkü HEK293T hücreleri¹⁴ gibi yerleşik hücre hatlarında kemokin reseptörlerinin ekspresyonu hantal olabilir.

1. Yabani balık türünde bir haç (örneğin, AB) oluşturun ve ertesi sabah ayırıcıları kaldırdıktan kısa bir süre sonra yumurta toplayın (yukarıda açıklandığı gibi).
2. Bir membran belirteci (örneğin, membran CFP) için 100 pg mRNA (örneğin, Cxcr1-FT) ile birlikte 100 pg floresan etiketli reseptör mRNA'sı enjekte edin. Karışıma kemokin ligand için değişen dozlarda mRNA ekleyin.
   NOT: Bir gösterge olarak 150 pg Cxcl8a mRNA, floresan Cxcr1-FT'nin belirgin bir şekilde içselleştirilmesini sağlamıştır (bkz. Şekil 5).
3. Embriyoları E3 ortamında durulayın ve 28 ° C'de inkübe edin.
4. Yaklaşık 7 hpf'de, mRNA'nın ekspresyonunu bir floresan diseksiyon kapsamı üzerinde test edin ve görüntülenecek embriyoları seçin.
5. % 0.8 LMP agarozunu önceden hazırlayın ve 60 ° C'de bir ısı bloğunda cam tüp içinde saklayın. Embriyoları manipüle etmek için bir cam pipet kullanın. Her elinizde bir çift forseps kullanarak embriyoları nazikçe dekoryonlayın.
6. Ucunda kabarcık olmadığından emin olmak için cam pipetle bireysel bir dekoriyonlu embriyoyu aspire edin. Embriyoyu yavaşça agaroz tüpüne bırakın ve tüpe batmasına izin verin.
7. Embriyoyu agaroz tüpünden aspire edin, yol boyunca bir miktar sıvı agaroz toplayın. Embriyoyu cam tabanlı bir görüntüleme kabının merkezine yavaşça bırakın. Embriyoyu, hayvan kutbu çanağın dibine bakacak şekilde hızlı bir şekilde döndürün (ters çevrilmiş bir mikroskop kullanırken bu taraf hedefe en yakın olmalıdır).
   NOT: Agaloz hala ayarlanırken embriyoların oryantasyonunu yeniden ayarlamak gerekebilir.
8. Agaroz ayarlandıktan sonra, 2 mL E3 ortamı ile takviye edin.
   NOT: Bu aşamadaki embriyolar larvalara kıyasla çok kırılgandır ve dekoryonat ve montaj için biraz pratik gerekir. Embriyo yırtılmasını önlemek için mümkün olduğunca nazikçe aspire etmek ve serbest bırakmak önemlidir.
9. Çanak başına 3-5 embriyo yüklemeyi amaçlayan işlemi tekrarlayın.
10. Ters çevrilmiş konfokal mikroskopta embriyoları görüntüleyin (bakınız Malzeme Tablosu). Yeterince yüksek çözünürlük elde etmek için 40x/1,3 NA yağ hedefi kullanın. Kapsamda sırasıyla 405, 488 ve 552 nm ile mCFP, sfGFP ve tagRFP'yi görselleştirin. Doygunluğu önlerken filtreleri ve ayarları yüksek kontrasta sahip olacak şekilde ayarlayın ve kanallar arasındaki sızıntıyı en aza indirin.
11. Farklı koşullar için montaj ve görüntülemeyi tekrarlayın.

Sonuçlar

Ventral yüzgeç yaralanmasını KHT'den ventral yüzgece hızlı nötrofil mobilizasyonu ve 30-60 dakika içinde yara kenarında kümelenme izler (Şekil 1). Zebra balığı nötrofilleri 24 tarafından eksprese edilen ve eğirme diski konfokal mikroskopisi kullanarak Cxcl8a ve Cxcl8b^14'ü tanıyan iki kemokin reseptörünün, Cxcr1 ve Cxcr2'nin dağılımını görselleştirdik. Nötrofillerin reseptörün floresan zamanlayıcı (FT) yapısını ifade ettiği, yani sfGFP ve tagRFP tandemiyle bir füzyon olan Tg (lyz: Cxcr1-FT) ve Tg (lyz: Cxcr2-FT) olmak üzere iki karşılık gelen transgenik çizgi ürettik (Şekil 2 ve referans¹⁴). İki floroforun kullanımı, çok çeşitli reseptör kaderlerinin izlenmesine izin vermek ve plazma zarında protein devir süresi tahminleri sağlamak için tasarlandı, çünkü yeni sentezlenen reseptörler yeşil renkte floresan olacak ve ^8,14 yaşlarında giderek kırmızı hale gelecektir. Bununla birlikte, bu reseptörlerin nötrofil plazma membranında hızlı kurucu ciroya sahip olduğu ve ikamet süresinin tagRFP'nin olgunlaşma süresinden daha kısa olduğu, sfGFP'nin membran lokalizasyonunu gösterdiği ve tagRFP'nin kararlı durumda veziküler lokalizasyonu gösterdiği bulunmuştur (Ek Video 1 ve ref¹⁴). Bu nedenle, doku hasarı bölgelerinde ligand kaynaklı içselleştirmeyi izlemek için sfGFP'nin dağılımına odaklandık. Reseptör dağılımının paterni, komşu pikseller arasındaki yoğunluk farklılıklarını bildiren kontrast metriği kullanılarak ölçüldü. Gerekçe, reseptör dağılımı membranöz ve pürüzsüz olduğunda, kontrast değerinin düşük olmasıdır. Reseptör dağılımı veziküler ve daha fazla noktasal olduğunda, kontrast değeri yüksektir (Şekil 3).

Alternatif bir yöntem, reseptör seviyelerinin (sfGFP yoğunluğu) bir kontrol membranı belirtecinin seviyelerine oranını ölçmektir, örneğin membran CFP (mCFP) (Şekil 3). Her iki yöntem de, hücrede küresel olarak daha fazla veziküler reseptör dağılım paterni (daha yüksek kontrast değeri) veya membrandaki daha düşük reseptör seviyeleri (daha düşük sfGFP / mCFP oranı) ile belirtildiği gibi reseptör içselleştirmesini tespit edebilir. Bununla birlikte, kontrast metriği, membran segmentasyonunun daha az doğru olduğu ve uygulanamadığı yaradaki nötrofil kümelerinde reseptör içselleştirmesini de tespit edebilir (Şekil 3). Bu metriği kullanarak, yaralardaki nötrofillerde Cxcr1 ve Cxcr2 kaçakçılığı arasındaki gözle görülür farklılıkları ölçebildik (Şekil 4 ve Ek Video 2). Cxcr1-FT yarada bulunan hücrelerde içselleştirilirken, Cxcr2-FT yaradaki nötrofillerde membranöz kalmıştır (Şekil 4A-C, Ek Video 2 ve Ek Video 3). Morfolino tedavisi ile Cxcl8a ve Cxcl8b'nin baskılanması, yaralarda Cxcr1-FT içselleştirmesini farklı şekilde etkilemiştir (Şekil 4C,D). Cxcr1-FT'nin Cxcl8a'ya yanıt verdiğini daha da doğrulamak için, erken embriyolarda kemokin yanıt testleri yaptık. Cxcr1-FT'nin, Cxcl8a'nın birlikte eksprese edildiği embriyolarda belirgin bir şekilde içselleştirildiğini bulduk(Şekil 5). Tüm bu sonuçlar, nötrofillerde kemokin kaynaklı reseptör içselleştirmesini ölçmek ve bu etkilere aracılık eden ligandın kimliğini belirlemek için tarif edilen yöntemlerin uygulanabileceğini göstermektedir.

Şekil 1: Ventral yüzgeç yaralarına nötrofil göçü. (A) (Solda) Kaudal hematopoetik dokunun (CHT), venüs dolaşımının (VC, mavi), ventral yüzgecin (VF) ve yara yerinin yerini gösteren 3 dpf larva karikatürü. (Sağda) Nötrofillerin CHT'den harekete geçirilmesi ve yarada kümelenmesiyle yaranın (W) alanını gösteren karikatür. CHT dokusunun kaudal ven pleksusu (CVP) mavi renkte çizilir. (B) Ventral yüzgeç yarasını ve Tg (mpx: GFP) larvalarındaki nötrofillerin dağılımını gösteren parlak alan görüntüsü (solda) ve konfokal projeksiyon (sağda) yaralama sonrası 2 saatte. Kesikli çizgiler VF ve CHT anahatlarını gösterir. Ölçek çubuğu = 25 μm. ^Ref.14'ten (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) değiştirilmiş karikatür ve floresan görüntü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Nötrofillerde kemokin reseptörü kaçakçılığının canlı görüntülenmesi. (A) Cxcr1-FT (Floresan Zamanlayıcı) ve Cxcr2-FT'nin nötrofil-spesifik transgenik ekspresyonu için kullanılan yapılar 3 dpf transgenik larva (Tg(lyz:Cxcr1-FT), üstteki nötrofillerin konfokal projeksiyonları; Tg (lyz:Cxcr2-FT), alt) tRFP (macenta) ve sfGFP (yeşil) kanallarını gösterir. Ölçek çubuğu = 20 μm. (B) Şekil 1A'daki gibi 3 dpf larvanın anatomik şeması. Larvaların altında, yaranın (W) alanını gösteren şemalar, nötrofillerin CHT'den (üstte) mobilize edilmesi veya ventral yüzgece (alt) girdikten sonra kemotaksis yapılması ile tasvir edilir. Kesikli kare, sağdaki anlık görüntülerde görüntülenen alanı gösterir. (C) Tg(lyz:Cxcr1-FT) larvalarındaki nötrofiller (sfGFP gösterilmiştir) CHT'den (üst paneller) veya kemotaksisten yaraya (alt paneller) doğru mobilizasyon üzerine. Oklar zaman içinde aynı hücreleri gösterir. Sağdaki görüntüdeki zaman noktaları, soldaki görüntüden sonra geçen dakikalardır. Ölçek çubuğu = 10 μm. (D) Kemokin reseptörü kaçakçılığının canlı görüntülenmesi için deneysel yaklaşımın şematik gösterimi. Paneller A-C ^ref.14'ten (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Reseptör dinamiklerinin nicelleştirme örnekleri. Yaralardaki tek (mavi) veya kümelenmiş nötrofiller (yeşil) veya CHT'deki (kırmızı, turuncu) mobilize edilmemiş nötrofiller, sonuçları karşılaştırmak için farklı yöntemlerle bölümlere ayrıldı ve analiz edildi. Gösterilen aynı örnek hücreler, görüntüde görülenleri çıkarılan değer aralığıyla ilişkilendirmek için iki yöntemle analiz edilmiştir. (A) Seçilen, örnek hücrelerin yüzeyi, sfGFP kanalındaki kontur tanımına göre bölümlere ayrılmıştır. (B) Kontrast, A'da gösterilen örnek hücrelerden hesaplandı. (C) Seçilen, örnek hücrelerin zarı, CFP kanalındaki kontur tanımına göre bölümlere ayrılmıştır. Bunu sfGFP/CFP'nin oranmetrik analizi izledi. (D) SfGFP / CFP oranı, C'de gösterilen örnek hücreler üzerinde hesaplanmıştır. hata çubukları, tek tek hücrelerden S.E.M.'yi temsil eder, n>1 durumunda, buradaki değerler istatistiksel analiz için değil, yalnızca farklı niceleme yöntemleriyle elde edilen ölçümleri örneklemek için kullanılmıştır. Ölçek çubuğu = 10 μm. Şekil ^ref.14'ten (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Yaralanmaya yanıt olarak Cxcr1 ve Cxcr2'nin diferansiyel dinamikleri. (A) Tg(lyz:Cxcr1-FT) veya Tg(lyz:Cxcr2-FT) larvalarındaki nötrofillerin yara sonrası 80 dakikada konfokal projeksiyonu (sfGFP kanalı gösterilmiştir). Ölçek çubuğu = 10 μm.  (B) Yarada büyütülmüş Cxcr1-FT nötrofil (solda) ve Cxcr2-FT (sağda). Yeşil reseptör gri renkte gösterilir. Ölçek çubuğu = 5 μm. (C) Normalleştirilmiş kontrast (CHT'deki mobilize edilmemiş hücrelerin ortalama kontrastına normalleştirilmiş bireysel nötrofil başına kontrast). cxcl8a, cxcl8a için çeviri bloke edici bir morfolino ile birlikte bir ekleme blokajının enjeksiyonunu ifade eder. cxcl8b, cxcl8b için ekleme bloke edici bir morfolino ile enjeksiyonu ifade eder. Tg (lyz: Cxcr1-FT için: n = 24 hücre (CHT), n = 8 larvadan 47 hücre (yara). Morfolinolu Tg (lyz: Cxcr1-FT) için: 5 larvadan n = 28 hücre (Cxcl8a-MO), 5 larvadan n = 16 hücre (Cxcl8b-MO). Tg (lyz: Cxcr2-FT için): n = 10 hücre (CHT) ve n = 20 hücre (yara) 3 larvadan. Veriler 1-5 görüntüleme seansında elde edilen bağımsız larvalardan toplandı. Kruskal-Wallis, Dunn'ın Tg (lyz: Cxcr1-FT) için çoklu karşılaştırma testi, Tg (lyz: Cxcr2-FT) için iki kuyruklu eşleşmemiş Mann-Whitney testi ile test edildi. (D) Cxcl8a morfolinosu (MO) (solda) ve cxcl8b MO (sağda) ile tedavi edilen Tg (lyz: Cxcr1-FT) transgenik larvalarında yüzgeç yaralarına (yeşil renkte gösterilen sfGFP kanalı) yanıt veren nötrofillerin konfokal projeksiyonu. Eşdeğer nötrofil birikiminin zaman noktalarında çekilen anlık görüntü (sol görüntüde 85 dakika yaralama sonrası ve sağ görüntüde 45 dakika yaralama sonrası). Ölçek çubuğu = 10 μm. Şekil ^ref.14'ten (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Erken embriyolarda kemokin yanıt testi. Cxcr1-FT. 100 pg Cxcr1-FT mRNA'nın ekspresyonunu ve dağılımını gösteren gastrulating embriyolarının lazer taramalı konfokal dilimleri, 150 pg Cxcl8a mRNA'lı veya Cxcl8a mRNA'sız bir hücre aşaması yumurtasına enjekte edildi. Yeşil ve kırmızı reseptörler ayrı kanallarda gösterilir. Kontrol membranı CFP işaretleyicisi (mCFP) camgöbeği kanalında gösterilir. Ölçek çubuğu = 20 μm. Şekil ^ref.14'ten (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Film 1: 3 dpf'de bir Tg (lyz: Cxcr1-FT) (solda) ve Tg (lyz: Cxcr2-FT) (sağda) larvalarının kafasındaki transgenik nötrofiller. sfGFP (yeşil), tagRFP (macenta). Kare aralığı 30 sn'dir ve kare hızı 5 fps'dir. Ölçek çubuğu = 20 μm. Video, ^ref.14'ten (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) alınmıştır. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Film 2: Tg(lyz:Cxcr1-FT) (solda) ve Tg(lyz:Cxcr2-FT) (sağda) transgenik larvalarında yüzgeç yaralarına yanıt veren nötrofiller. Film yaralama sonrası 10 dakika içinde başlar ve 60 dakika sürer. sfGFP (yeşil), tagRFP (macenta). Kare aralığı 30 sn'dir ve kare hızı 10 fps'dir. CHT = kaudal hematopoetik doku. VF = ventral yüzgeç. Ölçek çubuğu = 25 μm. Video, ^ref.14'ten (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) alınmıştır. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Film 3. Yaralı bir Tg (lyz: Cxcr1- FT) transgenik larvadan (Video 2'de gösterilenden farklı larva) nötrofillerin ek örnekleri, daha yüksek çözünürlükte elde edilir, CHT'de mobilizasyon üzerine veya girişte reseptör içselleşmesini (yeşil renkle gösterilen sfGFP kanalı) gösterir ve ventral yüzgeçte kemotaksis. Kare aralığı 30 sn'dir ve kare hızı 2 fps'dir. Ölçek çubuğu = 10 μm. Video, ^ref.14'ten (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) alınmıştır. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 1: Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 3: Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 4: Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

Tarif edilen yöntem, doku hasarına inflamatuar yanıt sırasında endojen ligandlara in situ yanıt olarak reseptör dinamiklerinin canlı görüntülenmesini sağlar. Cxcr1 / Cxcr2 nötrofil muhabirlerinin kullanımı, enfeksiyon, tümör modelleri veya diğer doku hasarı türleri gibi diğer fizyolojik ortamlara genişletilebilir 14,25,26,27. Ek olarak, endojen reseptörün eksojen bir mutant reseptör tarafından bastırıldığı ve kurtarıldığı transgenik kurtarma hatları, immün yanıtlarda spesifik nötrofil migrasyon paternlerinin önemini incelemek için yararlı araçlar sağlayabilir. Örneğin, duyarsızlaştırmayı bozan Cxcr1 reseptör mutantları, enflamatuar bölgelerde daha belirgin nötrofil kümelenmesine neden olur¹⁴. Bu fonksiyon kazancı fenotipi, nötrofil cemaatinin farklı fizyolojik süreçlerdeki rolünü anlamak için kullanılabilir, örneğin, yara onarımı, bulaşıcı hastalık veya tümör evrimi ve kompleman reseptör nakavt / nakavt deneyleri. Metodoloji ayrıca mevcut muhabirlerin aralığını genişletmek için bir temel sağlar. Floresan muhabir seçimi dikkate alınması önemlidir ve biyolojik soruya bağlıdır. Nötrofillerdeki bu kemokin reseptörlerinin kurucu döngüsünün, epitel hücrelerine kıyasla yüksek olduğunu ve hızlı olgunlaşması olan muhabirlerin (örneğin, sfGFP) membran seviyelerini kararlı durumda bildirmeleri ve nötrofil stimülasyonu^üzerindeki farklılıkları çözmeleri gerektiğini ^bulduk8,14. Bu nedenle, sfGFP / tagRFP'nin membran oranları, bu hücre tipinde ligand kaynaklı içselleştirmeyi ölçmek için geçerli değildir, ancak tagRFP paterni, bazı çalışmalarda yararlı olabilecek reseptörün hücre içi kaderlerinin izlenmesine izin verir. Ayrıca, tagRFP'nin daha konsantre hücre içi sinyalinin bireysel larvaları taramak için yararlı olduğunu bulduk. Plazma zarındaki reseptör seviyelerini ölçmek için alternatif bir yaklaşım, nötrofillerdeki bir floresan membran belirtecini aynı transgen^9'da veya bağımsız bir transgen^14'te birlikte eksprese etmek olacaktır. Önceki senaryoda, transgen balığın taranması için ek bir araç sağlayacak ve ekspresyon seviyeleri belirteç ve reseptör arasında karşılaştırılabilir olacaktır. İkinci yaklaşım daha modüler olacaktır, çünkü bir reseptör muhabiri olan bir zebra balığı çizgisi farklı muhabir hatlarıyla birleştirilebilir. Her iki durumda da, kümelenmiş nötrofillerde reseptör seviyelerinin membran nicelleştirilmesinin zor olduğunu belirtmek gerekir (aşağıya bakınız). Son olarak, bu protokolün olası bir uzantısının, daha ayrıntılı lokalizasyon analizleri için canlı görüntülemeyi immünohistokimya ile takip etmek olacağını not ediyoruz.

Tol2 transgenez sistemi iyi kurulmuş^7'dir ve lizozim C promotörü nötrofil ekspresyonu^11,15 için yaygın olarak kullanılmıştır. Bu nedenle, transgenez yaklaşımı nispeten basittir ve bu promotör ile elde edilen ekspresyon seviyesi, reseptör dinamiklerinin analizi için yeterli kontrast sağlayacak kadar yüksektir. Olası bir sınırlama, ekspresyon seviyesinin endojen reseptör ekspresyon seviyelerini özetlememesidir. Yeni CRISPR teknolojileri, özellikle ilgi çekici reseptörler için zincirleme hatlar oluşturmak üzere konuşlandırılabilir²⁸. Bu teknolojiler hala hantaldır ve hücre altı görüntüleme için gerekli ekspresyon seviyelerini garanti etmeyebilir, ancak başarılı gelişimleri endojen sinyal dinamiklerini anlamak için önemli bir atılım olacaktır. Fonksiyonel doğrulamalar, transgenik reseptör yapıları ile verilerin yorumlanması için önemlidir. Örneğin, floresan füzyon proteininin işlevsel olduğunu belirlemek için ligand tanıma testleri kullanılabilir ve transgenik nötrofil ekspresyon seviyelerinin işlevsellik¹⁴ ile uyumlu olduğunu belirlemek için nakavt fenotiplerinin kurtarılması kullanılabilir. Son olarak, reseptör füzyonunu doğrulamanın daha doğrudan bir yolu, etiketlenmemiş versiyonlar^14'ün yanı sıra etiketli reseptörlü in vitro fonksiyonel bir tahlil kullanmak olacaktır.

Niceleme yaklaşımı, nötrofillerde in vivo olarak doğru membran segmentasyonundaki spesifik zorlukları ele almaktadır. Epitel niteliğindeki hücrelerde, membran reseptör seviyelerinin normalleştirilmesi, membran reseptör seviyelerinin bir kontrol belirtecine normalleştirilmesiyle otomatik olarak gerçekleştirilebilir, bu da tandem veya ayrı ayrı ifade edilebilir⁹. Gerçekten de, gastrulating embriyolarında ligand tanıma testini kullanırken böyle bir yaklaşım uyguladık¹⁴. Bununla birlikte, nötrofiller in vivo hücre şeklinde karmaşık, hızlı değişikliklere uğrar ve membran segmentasyonunu hem 2D hem de 3D^14'te zorlaştırır. Bu, birçok fizyolojik ortamda meydana gelen nötrofiller kümelendiğinde daha da zordur²⁹. Kontrast metrik, membran segmentasyonu gerektirmediği, bunun yerine hücredeki reseptör dağılımının genel durumunu yansıttığı için bu sınırlamanın üstesinden gelir (membranöz / pürüzsüz vs veziküler / noktalı). Kontrast metriğinin görüntünün genel kontrastından etkilenebileceğine dikkat etmek önemlidir, bu nedenle farklı embriyolarda / örneklerde sinyalin değişkenliğini hesaba katmak için bireysel hücre değerlerinin dahili bir referansa normalleştirilmesi gerekir. Örneğin, CHT'deki yanıt vermeyen nötrofillerin ortalama hücre kontrast değerini kullandık (yani, sabit kalan ve ventral yüzgecine göç etmeyen nötrofiller)¹⁴. Ek bir olasılık, aynı hücredeki bir kontrol işaretçisinin kontrast değerleriyle normalleştirmek olacaktır. Bu, yanıt vermeyen hücrelerin dahili bir referansı mevcut olmadığında bir çözüm sağlayacaktır ve muhtemelen farklı koşullar arasındaki reseptör dinamiklerindeki daha ince nicel farklılıkları çözebilir.

Görüntülemenin yeri dikkate alınması gereken başka bir değişkendir. Burada ventral yüzgeç yarasının seçilmesinin nedeni, daha yaygın olarak kullanılan kuyruk yüzgeci yara modeli^16,30'un aksine^, yaralama yerinin nötrofil ikametgahı / göçmen kökenli bölgeye yakın olmasıdır. Bu, nötrofillerin gelmesi nispeten az zaman aldığı için tahlilin zaman çizelgesini hızlandırır. Ek olarak, hem göç kaynağında (CHT) hem de ilgilenilen hedef konumda (yara) hücre davranışını yakalama fırsatı sağlar. Bu burada önemlidir, çünkü hücre altı görüntüleme için gereken uzamsal ve zamansal çözünürlüğün geniş bir görüş alanı veya çok konumlu tarama ile birleştirilmesi zordur. Bu nedenle, ventral yüzgeç yara testi, göç orijininden göç yanıtının evriminin izlenmesine ve yanıt vermeyen hücrelerdeki spesifik olmayan reseptör dalgalanmalarının eşzamanlı olarak yakalanmasına izin verir. Yukarıda belirtildiği gibi, ikincisi, spesifik olmayan dinamikler için dahili bir referans sağladığı için niceleme amaçları için yararlıdır. Diğer sistemlerde, böyle bir iç referansa sahip olmak mümkün olmayabilir, bu durumda birlikte ifade edilen bir membran işaretleyicisinin kontrast değerleri alternatif bir kontrol sağlayacaktır.

Özetle, metodolojinin diğer sistemlere uygulanabilir olduğunu ve çeşitli amaçlar için konuşlandırılabileceğini öngörüyoruz. Örneğin, aynı muhabirler enfeksiyon ayarları veya diğer hastalık modelleri gibi diğer enflamatuar ortamlarda kullanılabilir. Zebra balığı reseptör raporlayıcı hatlarının repertuarı, sinyal mekanizmalarını anlamak veya ligand dinamiklerini in vivo olarak bildirmek için diğer sinyal reseptörlerine genişletilebilir. Yaklaşım, gözlemlenen dinamiklerin mekanik temelini sorgulamak için nakavt / nakavt teknikleriyle birleştirilebilir. Örneğin, ligand ekspresyonunun pertürbasyonu, gözlemlenen reseptör dinamikleri için ligand bağımlılığını gösterebilir. Gelecekte, sistemin muhabirlerin zincirleme olarak yerleştirilmesini içerecek şekilde daha da rafine edilebileceğini öngörüyoruz. Nihayetinde, bu metodolojiyi kullanan bulgular, memelilerde bu sinyal reseptörlerinin korunması ve bu çalışmaların daha büyük organizmalarda yürütülmesinin göreceli zorluğu göz önüne alındığında, zebra balığı topluluğunun ötesinde değerli yeni bilgiler sağlayacaktır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-phenyl-2-thiourea	Sigma-Aldrich	P7629-25G
50mL CellStar Centrifuge Tube	Grenier Bio-One Limited	210270
Clark capillary glass	Harvard Apparatus	30-0020
Cleanline Thin Bleach	Scientific Laboratory Supplies	CLE0301
Dissecting scope	Nikon	SMZ645
Dri Block heater	Techne	FDB02AD
Fiji	National Institutes of Health, Bethesda, MD
Forceps, Jewelers Dumont No. 5	Sigma-Aldrich	F6521
Glass bottom microwell dishes	MatTek	P35G-1.5-14-C
Glass pasteur pipette	Fisherbrand	11795098
Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit	Invitrogen	10391175
Leica SP8 confocal microscope	Leica	N/A
Low melting point agarose	Invitrogen	16520-100
Magnetic stand	Narishige	GJ-1
MATLAB	The MathWorks, Inc., Natick, MA
Methylene blue	Sigma-Aldrich	M9140-25G
MgSO4	Sigma-Aldrich	M-2643
Microinjection system	Parker	Picospritzer III
Microloader pipette tips	Eppendorf	5242956003
Micromanipulator	Narishige	M-152
Micropipette Puller	Sutter Instrument Company	Flaming/Brown P-97
Microscope slide	Thermo-Scientific	J1800AMNZ
PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope	Olympus	N/A
Petri dish (120mm)	Grenier Bio-One Limited	632180
Phenol red	Sigma-Aldrich	P0290-100ML
Poly(A) Tailing Kit	Invitrogen	AM1350
Prism	GraphPad Software
Small paintbrush	N/A
Spectral Applied Research LMM5 laser module		N/A
Surgical Scalpel Blade No. 23	Swann-Morton	233-5528
Tricaine MS222	Sigma-Aldrich	E10521-50G
Volocity software		N/A
Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner	Yokogawa	N/A