Nohutta Kuru Kök Çürüklüğü Hastalığı Tahlilleri: Detaylı Bir Metodoloji

Özet

Bu çalışmada nohut-Rhizoctonia bataticola etkileşiminin altında yatan patomorfolojik ve moleküler mekanizmaları incelemek için metodolojiler sunulmuştur. Blotting kağıt yöntemi hızla nohut genotip yanıtları çalışma için yararlıdır, hasta pot tabanlı yöntem aynı anda kuraklık ve R. bataticola enfeksiyon empoze etmek için kullanılabilir ve toleranslı genotipler için ekran.

Özet

Kuru kök çürümesi (DRR) hastalığı, dünyada nohut yetiştiriciliği için ortaya çıkan biyotik stres tehdididir. Bir toprak kaynaklı mantar patojeni neden olur, Rhizoctonia bataticola. Literatürde hastalık tahlilleri ile ilgili kapsamlı ve ayrıntılı adım adım protokoller seyrektir. Bu makalede, DRR direnci için genotiplerin hızlı bir şekilde taranması için bir lekeleme kağıt tekniği kurma dahil adımlar hakkında tam ayrıntılar sağlar. Lekekağıt tekniği kolay ve daha az pahalıdır. Başka bir yöntem, hasta pot yaklaşımına dayalı, doğal enfeksiyon bir taklit ve etkileşen bileşenleri incelemek için uygulanabilir -bitki, patojen, ve çevre-hastalık üçgeninde yer.

Ayrıca, doğada, DRR çoğunlukla bitki büyüme ilerledikçe toprak nem çekilir yağmurla beslenen nohut yetiştirme alanlarında oluşur. Kuraklık stresi DRR hastalığına nohut bitkileri yatkınlık bilinmektedir. Kuraklık stresi altında bitki-patojen etkileşiminin patomorfolojik ve moleküler olarak anlaşılması, nohut mikroplu havuzdan drr dirençli elit çeşitlerin belirlenmesinin önünü açabilir. Bu makalede, bir hasta pot ve sonraki hastalık tsay hazırlanması için adım adımlı bir metodoloji sağlar. Genel olarak, burada sunulan bilgiler araştırmacılarR bataticola mantar inoculum hazırlamak, bu patojen korumak, leke kağıt tekniği kurmak, hasta kültür ve hasta pot hazırlamak ve nohut bitkilerde patojen enfeksiyonu değerlendirmek yardımcı olacaktır.

Giriş

Kuru kök çürümesi (DRR) nohut^1,2ekonomik açıdan önemli hastalıklardan biridir. Rhizoctonia bataticola (teleomorf, Makroforin phaseolina)neden olduğu köke özgü bir hastalıktır. Enfekte bitkiler lateral kökleri eksikliği ve kırılgan taproots ve sarı yaprakları^1,3sahip . Kuraklık stres altında DRR nohut ekimi için ortaya çıkan bir tehdit olduğu bildirilmiştir^1,2,3. Ayrıca, DRR insidansı alan koşulları altında kuraklık stres altında ağırlaştırılmış olduğu bildirilmiştir^1,2,3. DRR daha fazla sulu alanlarda daha yağmurla beslenen alanlarda yaygındır⁴. Dirençli çeşitlerin kullanımı hastalığın üstesinden gelmek ve fungisit kullanımı atlatmak için bir yoldur^1,13. Nohut germplasm dünya çapında mevcut özelliği için genetik varyasyon barındıran çünkü^5,tarama ve dirençli / duyarlı genotiplerin belirlenmesi ürün geliştirme için moleküler ıslahı için önemlidir.

Sağlam, kolay ve uygun maliyetli hastalık tahlilleri nohutta R. bataticola enfeksiyon modellerini araştırmak için gereklidir. Nohut genotiplerinin R. bataticola enfeksiyonuna tepkisini gözlemlemek için kullanılan birincil hastalık, lekeleme kağıt tekniği^1,4'tür. Bu basit bir tekniktir ve sıvı mantar inoculum kullanılarak yürütülebilir, kökleri ile fideler, ve steril leke kağıt. Ancak literatürde adım adım protokol bulunmadığından bu teknik en üst düzeyde kullanılmamıştır.

Bu arada, hasta pot tekniği potansiyel bir hasta kültürünün hazırlanması ve kuraklık stres dayatılması içerir. Kuraklık stresi DRR hastalığı insidansını ağırlaştırdığı göz önüne alındığında³, bu kuraklık stres altında bitki-patojen etkileşimi çalışmak için gereklidir^6,7. Hasta pot tekniği böyle bir eşzamanlı çalışma için platform sağlar, germplasm tarama için daha iyi olanaklar teşvik ve etkileşim mekanistik temelini anlamak. Kök uzunluğunun artması ve lateral kök sayısında azalma gibi patomorfolojik değişiklikler —DRR hastalığına bağlı olarak— hasta pot tekniği^1,3,7kullanılarak ele alınabilir.

Burada, nohut ve R. bataticola ve ekran nohut germplasm arasındaki etkileşimi incelemek için kullanılabilecek kağıt ve hasta pot teknikleri, lekeleme için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Çalışmada kullanılan malzemelerin ayrıntıları Malzeme Tablosu'ndaverilmiştir.

Protokol

1. R. bataticola ve depolama izolasyon

1. Nohut genotip ve DRR semptomlarının ayrıntıları
   1. Nohut bitkileri kullanın (genotip, JG 62) genellikle tipik DRR belirtileri göstermek, kuru gibi, kabuğu altında hiçbir lateral kökleri ve mikrosclerotia ve pith içinde^1,3.
2. Toplama ve yıkama
   1. Epidermis tabakası altında mikrosclerotia ile kuru saman renkli foliar ve kırılgan birincil kök gibi belirtiler gösteren uproot bitkiler. Kök sökme sırasında, enfekte kökleri kırılgan olduğu gibi köklerin büyük bir kısmı toprak içinde kalacaktır. Köke bağlı kaba toprak enkaz kaldırın. Kökleri ayrı ayrı kesin ve uygun etiketle kağıt zarflarda (27,5 cm x 12 cm) toplayın ve bir numune toplama kutusuna yerleştirin.
   2. Numuneleri laboratuvara taşıdıktan sonra, kökleri 200 mL'lik bir kabın üzerine yerleştirin ve örgü (3 mm çapında gözenek boyutuna sahip naylon örgü) ile kaplayın ve yapışan toprak parçacıklarını çıkarmak için kökleri akan musluk suyuyla iyice yıkayın.
   3. Sonunda bir kez durulamak için ters ozmoz (RO) su kullanın.
3. Yüzey sterilizasyonu
   1. Kökleri her biri neşter bıçakla 2 cm uzunluğunda dört parçaya bölün ve temiz bir 200 mL kabına koyun.
   2. Otoklavlı RO suyunu, %2 NaOCl,kavanozu atın ve otoklavlı blotasyon kağıdını (5 cm²⁾laminar akış odasının içinde birleştirin.
   3. Kökleri 50 mL otoklavlı RO suyu ile üç kez ve daha sonra 50 mL 2% 2 NaOCl ile 10 dakika yıkayın. NaOCl kaldırmak için tekrar üç kez RO su 50 mL ile kökleri yıkayın.
   4. Lekeler otoklavlı leke kağıdına kökleri yerleştirerek kökleri kurutun ve kökleri kuruyana kadar bırakın.
4. Medya ve kuluçka
   1. Sterilize edilmiş bir neşter bıçağı ile köklerin kenarlarını çıkarın. Bıçak kullanarak kökleri bölün ve streptomisin sülfat (50 mg L^-1) ve ampisilin (50 mg L^-1)içeren bir patates dekstroz agar (PDA) medya Petri plaka üzerine yerleştirmek için sterilize forseps kullanın.
   2. Plakayı kapatın, parafilm ile kapatın ve karanlıkta iki gün boyunca 28 °C'de bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatın.
5. Hipür ucu yöntemi
   1. İki günlük kuluçkadan sonra plakaları laminar akış odasına getirin. Bir stereomikroskop altında hyphal büyüme⁸ ucunu kesin (Leica EZ4 eğitim stereomikroskop) ve streptomisin sülfat ve ampisilin ile taze bir PDA plaka içine aktarın.
   2. 28 °C'de kuvözdeki plakaları karanlıkta on gün kuluçkaya yatırın.
6. R. bataticola fungal inoculum'un depolanması ve bakımı
   1. Test tüpleri PDA eğimler olun ve alev sterilize aşılama döngü kullanarak on günlük kültür plaka bir mantar agar fiş transfer. Test tüpü kapağını parafilm ile kapatın.
   2. 28 °C'de 10 gün boyunca karanlıkta eğimleri kuluçkaya yatırın.
   3. Kapağı tekrar parafilm ile kapatın ve ileride kullanmak üzere buzdolabında 4 °C'de saklayın.
   4. Mantarı korumak için her altı ayda bir alt kültür.
7. Virülans Bakımı
   1. Hasta pot tekniğinde belirtildiği gibi hazırlanan saf mantar inokül ile bitkilere bulaştırmak³. Enfekte bitkilerden aynı mantar izole (Koch's postülatlar)⁹ ve daha fazla deney için kullanın.
      NOT: Bu çalışmada mantarın bir alan izole suşu kullanılmıştır (GenBank: MH509971.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH509971)

2. Blotting kağıt tekniği

NOT: Lekeleme kağıdı tekniği sıvı mantar inokülhazırlanmasını, fide hazırlamayı ve hastalık değerlendirmesini gerektirir.

1. Sıvı R. bataticola inoculum hazırlanması
   NOT: Sıvı R. bataticola fungal inoculum hem misel hem de mikroskroti içerir. Bu yapıların her ikisi de birincil inokül görevi görededir.
   1. 1.000 mL'lik bir şişede 500 mL PDB ortam hazırlayın ve 15 dakika boyunca 121 lbs'de otoklavlayın.
   2. Ortam soğuduktan sonra, mantar eğimli bir kültürden bir döngü dolusu mantar agar fişi ile suyu aşılayın ve karanlıkta 180 rpm'de bir çalkalayıcıda beş gün boyunca 28 °C'de kuluçkaya yatırın.
   3. Otoklavlı cam veya plastik huni (10 cm), bir litrelik konik şişe ve iki kat örgü (10 cm² ebat) (3 mm çapında gözenek boyutuna sahip naylon örgü) masada bir araya getirin. Örgükullanarak mantar miselve mikrosclerotifiltre. Otoklavlı blotlama kağıdında mantarı kurutun.
   4. % 50 inoculum için 100 g misel tartmak ve oda sıcaklığında tutmak.
2. Nohut bitkisinin hazırlanması
   1. Seçin 50 sağlıklı tohum (Bu çalışmada, DRR duyarlı genotip JG 62 kullanılmıştır), 100 mL kabına yerleştirin ve bir örgü ile kaplayın.
   2. Toprak enkaz kaldırmak için ilk musluk suyu ile tohumları yıkayın.
   3. Laminar akış odasına tohumlu kabı alın ve yıkama başına 1 dakika boyunca steril 50 mL RO su ile üç kez yıkayın.
   4. Tohumları 50 mL %2 sulu NaOCl ile 2 dk boyunca sürekli sallayarak sterilize edin ve tohumları 50 mL steril su ile 1 dk'lık beş kez yıkayın.
   5. Bir polietilen torbayı (47,5 cm x 25 cm) Soilrite ile doldurun (bahçecilik sınıfı genişletilmiş perlitkarışımı, İrlanda turba yosunu ve aynı oranda eksfoliyon vermikülit yani, 1/3:1/3:1/3), yüzeysterilize 50 tohum iki cm derinliğinde ekmek ve 28 °C ± 2 °C sıcaklık, 16 saat fotoperiod 150 μmol m⁻² s⁻¹ışık yoğunluğu ve %70 bağıl nem ile bir büyüme odası / oda tutun. Ro su ile su ve ekim sekiz gün sonra bitkilerin kökünü.
   6. Soilrite parçacıkları kaldırmak için musluk suyunda kökleri yıkayın. Kökleri steril RO suyuyla durulayın ve 1000 mL'lik bir kabın içinde RO suyunda saklayın.
3. Tepsilerde lekeleme kağıdı hazırlanması
   1. Bir leke kağıt alın ve çoğaltmaları karşılamak için yeterli sayıda parçalar (30 cm × 23 cm) onları kesti.
   2. Otoklavlanabilir polietilen torba içinde yaprak paketi ve 15 dakika boyunca 121 lbs onları otoklav ve kurutma için sıcak hava fırında tutun.
   3. Kat her lekeli kağıt levha yarısında.
   4. Kağıt, Şekil 2i-iv'tegösterildiği gibi temiz, ruhla silinmiş plastik tepsiye yerleştirin.
4. Daldırma ile bitki aşılama
   1. %50 inoculum elde etmek için 200 mL otoklavlı RO suyunda 100 g mantar inoculumunu 200 mL'lik bir kabın içinde çözün.
   2. Mantar inokülünün tek tip bağlanmasını sağlamak için bitki köklerini aralıklı yukarı ve aşağı hareketlerle 1 dakika boyunca hazırlanan inoküle batırın.
5. Bitkileri leke kağıdına yerleştirme
   1. Steril RO suyu ile tepsiye yerleştirilen leke kağıdının alt tarafını ıslatın. Bitkileri sadece köklerin kağıtla kaplandığı ve sürgünlerin dışarıda bırakıldığı bir şekilde kağıda yerleştirin.
   2. Blotlama kağıdının üst tarafını katlayarak kapatın ve bitki büyümesini sürdürmek için yeterli su sağlamak için tüm kağıdı ıslatın.
   3. Tepsiyi günde bir kez sulayın ve tepsileri 28 °C'de tutun. Nekroz, kök çürümesi ve günlük yaprak sararken sararma gibi belirtileri gözlemleyin.

3. Hasta pot tekniği

NOT: Hasta pot tekniği öldürücü inokül ve hasta bir tencere hazırlanması, nem seviyesinin korunması ve hastalık belirtilerinin değerlendirilmesi gerektirir.

1. Substrat hazırlanması
   1. Herhangi bir ticari nohut tohumu bir kg alın. Enfekte tohumları çıkarın (mantar büyüme, enfeksiyon lekeleri ve böcek hasarı ile tohumlar). 5 L plastik kabıyerleştirin ve büyük enkaz kaldırmak için iyice 3-4 kez musluk suyu ile yıkayın.
   2. Tohumları 2 L RO suyu yla üç kez yıkayın ve 1 kg'lık tohumları 5 L'lik bir kabın içine beş saat boyunca üç kat daha fazla su ile ıslatın.
   3. Bir kez tohumlar su imbibed, tohum exudates kaldırmak için RO su üç kez onları yeniden yıkayın.
   4. Suyu tamamen çıkarın ve tohumları reçel şişelerine (300 mL, 12 cm yükseklik, 6 cm çapında ve 155 g ağırlık) yaklaşık^1/4'lük kapasiteye (reçel şişesi başına 100 g) paketleyin ve şişeleri kapaklarla kapatın. Bir otoklavable plastik torba (48 cm x 30 cm) otoklav iki kez 15 dakika boyunca 15 dakika boyunca 121 lbs pack on reçel şişeleri.
   5. Şişeiçindeki su damlacıklarını çıkarmak için tohumları bir gecede fırında 40 °C'de kurulayın.
2. Hasta kültürünün hazırlanması
   1. BSL-2 seviyesi laminar akış odasını açın. % 70 etanol ile zemin iyice silin ve 15 dakika UV açın. Sonra, laminar akış odası içinde tohumları tutun.
   2. 10 günlük taze izole R. bataticola kültürünü (bölüm 1) ele alalım. Daha sonra, steril bir pipet ucu veya mantar borer kullanarak üç mantar agar fişleri (4 mm çapında) almak ve aseptik reçel şişeleri içine koyun. Kapaklar ve parafilm ile mühür ile şişe kapağı.
   3. Mantar diskini nohut tohumlarıile eşit bir şekilde karıştırmak için şişeleri sallayın.
   4. Şişeleri 30 °C'de karanlıkta 15 gün kuluçkaya yatırın.
   5. Siyah mantar büyüme ile reçel şişeleri alın(Şekil 4iii)ve steril çömetler kullanarak bir cam Petri plaka reçel şişeleri hasta kültürü (mikrosclerotia ile tohum) aktarın. Bir cam Petri plaka iki gün boyunca oda sıcaklığında kurulayın.
   6. Mantar kütlesini bir harç ve havan topu kullanarak tozlayın ve tozu 4 °C'de saklayın.
   7. Autoclave Soilrite iki kez 15 dakika için 121 £ de.
   8. Otoklavlı Soilrite karışımını güneşlik altında kurutun.
   9. Mantar tozunu %50 w/w'de Soilrite ile karıştırın, tencereleri karışımla doldurun ve bir gün oda sıcaklığında tutun.
   10. Tencere başına yüzeye dayanıklı DRR duyarlı nohut tohumu (10 cm yuvarlak kaplar)(Malzeme Tablosu)ekin ve %80 alan kapasitesi (FC) nem seviyesini koruyun.
   11. Çimlenme sonrası bitkileri söküp nekroz ve kök çürümesi gibi belirtileri gözlemleyin.
3. Hasta pot verimliliğinin değerlendirilmesi
   NOT: Bitkiler kökleri tamamen çürümüş olduğunda sarı foliar belirtileri gösterir.
   1. Lezyonun (nekrotik lekeler)(Ek Şekil 2C)sayılarını ve kök çürümesinin şiddetine göre bir hastalık skoru geliştirin. %90 bitki ölümünü gösteren hasta kaplar daha fazla kullanılabilir.
4. Genotip taraması
   1. Büyük miktarlarda hasta kültürü hazırlamak ve 30 cm boyunda tencere sterilize Soilrite veya alan toprak (% 5 w / w) ile karıştırın. Yüzeyi ıslamak için tencereleri sulayın ve yedi gün boyunca bozulmadan bekletin.
   2. 10 cm yuvarlak tencere başına bir yüzeysterilize tohum ve 30 cm yuvarlak tencere başına üç tohum ekin ve yeterli su.
   3. Sarı foliar ve kök çürümesi belirtileri gözlemleyin.
5. Kombine kuraklık ve R. bataticola enfeksiyonu
   1. Sinha ve ark.'da (2019) belirtilen protokolleri izleyerek kuraklık stresi uygulayın.

Sonuçlar

Bu çalışmada, kuraklık stresi altında bitki-patojen etkileşiminin patomorfolojik ve moleküler anlaşılmasını kolaylaştırmak için kağıt ve hasta saksı teknikleri gibi teknikler gösterilmiştir. Bunu başarmak için, DRR belirtileri sergileyen bitkiler^1,3,4 bir nohut alanından toplandı ve mantar hiphal ucu yöntemi 8 kullanılarak izole edildi . R. bataticola mantar kültürü, k...

Tartışmalar

Blotting kağıt tekniği laboratuvar koşullarında nohut genotipleri ekrana basit bir yaklaşım sağlar. Dip aşılama, inokül yükü üzerinde kolay kontrol(Ek Şekil 1)ile etkileşimin zamansal olarak araştırılmasını sağlar ve in vitro taramayı kolaylaştırır. Ayrıca genç fideler bile kullanılabilir. Beş günlük mantar kültürü(Şekil 1B)bitkilere bulaştırmak için yeterli inoculum verebilir. Sıvı inokül hem misel hem de mikroskroti içerir (

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fungus- Rhizoctonia bataticola	Pathogen inoculum	Indian Type Culture Collection No. 8365	GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article& id=1251&Itemid=1370)
Soilrite mix	Soil medium in the lab	Keltech Energies Limited, Bangalore, India	http://www.keltechenergies.com/
Filter paper	Blotting paper to support the plant growth	Himedia	http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374
Pot	Growing plants	10 and 30 cm size pots	Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html
Potato dextrose agar/broth	Culture and maintain the fungus	Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA	https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946
Incubator	Culture the fungus	LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker	http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131
Growth chamber	Growing plants in controlled condition	Model No. A1000, Conviron, Canada	https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber
Laminar airflow	Carrying out aseptic exercises	Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000	https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html
Mesh	Filtering the fungal mycelia	Nylon mosquito net	Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size
Autoclave	Autoclaving media and chickpea seeds	Autoclave	http://www.scientificsystems.in/autoclave
Microscopes	Visualizing the infection ang fungal mycelia	SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope	https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i
Weighing balance	Weighing fungus and chemicals	Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW	https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances
WGA-FITC	Fungus staining	Sigma	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en&region=IN
Aniline blue	Fungus staining	Himedia	http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901