Akson rejenerasyonunu ve retinal ganglion hücreli aksonunu hedef alan müdahaleleri değerlendirmek için sıçanlarda kılıf koruyucu optik sinir transeksiyonu

Özet

Bu protokol, sıçanlarda optik sinir kılıfını koruyan bir optik sinir transeksiyonunu tanımlar. Mikroenjeksiyonlardan optik sinire gelen hidrostatik basınç, transekte edilen optik sinir uçlarının dikişsiz yeniden atanmasına ve bir transeksiyon modelinde aksonal kompartmanın doğrudan hedeflenmesine izin veren tam bir transeksiyon oluşturur.

Özet

Retinal ganglion hücresi (RGC) aksonları, görsel bilgiyi retinadan beyne iletmek için optik sinir başında birleşir. Glokom, travma ve iskemik optik nöropatiler gibi patolojiler RGC aksonlarına zarar verir, görsel uyaranların iletimini bozar ve görme kaybına neden olur. RGC akson yaralanmasını simüle eden hayvan modelleri, optik sinir ezilme ve transeksiyon paradigmalarını içerir. Bu modellerin her birinin kendine özgü avantajları ve dezavantajları vardır. Optik sinir ezilmesi genellikle transeksiyondan daha az şiddetlidir ve lezyon bölgesi boyunca akson rejenerasyonunu test etmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, ezilme kuvveti ve süresindeki farklılıklar doku tepkilerini etkileyebilir, bu da değişken tekrarlanabilirlik ve lezyon tamlığı ile sonuçlanabilir. Optik sinir transeksiyonu ile tüm aksonları tamamen lezyona uğratan ciddi ve tekrarlanabilir bir yaralanma vardır. Bununla birlikte, optik sinirin kesilmesi, optik sinir kılıfını ihlal ederek ve optik siniri periferik ortama maruz bırakarak kan beyin bariyerini önemli ölçüde değiştirir. Ayrıca, bir transeksiyon bölgesinin ötesindeki rejenerasyon, kesilen sinir uçları yeniden biçilmeden değerlendirilemez. Ayrıca, farklı dejeneratif değişiklikler ve hücresel yollar, bir ezilme veya transeksiyon yaralanması ile aktive edilir.

Burada açıklanan yöntem, dezavantajları azaltırken hem optik sinir ezilme hem de transeksiyon modellerinin avantajlarını içerir. Mikroenjeksiyon ile optik sinir içine verilen hidrostatik basınç, optik sinir kılıfının bütünlüğünü koruyarak optik siniri tamamen keser. Kesilen optik sinir uçları, akson rejenerasyon testlerine izin vermek için yeniden uygulanır. Bu yöntemin potansiyel bir sınırlaması, potansiyel bir değişkenlik kaynağı olan tam transeksiyonun görselleştirilememesidir. Bununla birlikte, optik sinirin görünür kısmının kesildiğinin görsel olarak doğrulanması, %90-95 başarı ile tam bir optik sinir transeksiyonunun göstergesidir. Bu yöntem, bir transeksiyon modelinde akson rejenerasyonunu teşvik etme stratejilerini değerlendirmek veya aksonal bölmeleri hedef alan müdahaleleri araştırmak için uygulanabilir.

Giriş

Aksonal yaralanma ve dejenerasyon, travma sonrası retinal ganglion hücrelerinde (RGC'ler) veya glokom gibi nörodejeneratif hastalıklarda meydana gelir ^1,2. RGC'lerin kaybı ve retinofugal projeksiyonların bozulması kalıcı görme kaybına neden olur³. Dejeneratif süreçlerden sorumlu moleküler yolları anlamak ve aksonal ve RGC kaybını azaltmak veya RGC aksonlarını rejenere etmek için stratejiler geliştirmek için, optik sinir ezilme ve optik sinir transeksiyonu modelleri dahil olmak üzere optik sinir hasarını simüle etmek için deneysel hayvan modelleri kullanılmıştır. Deneysel bir model seçerken, her bir yaklaşımın avantaj ve dezavantajlarının yanı sıra yaralanma tarafından aktive edilen moleküler yolaklar da hesaba katılmalıdır⁴.

Burada açıklanan yöntemi geliştirmenin mantığı, optik sinir ezme⁵ ve transeksiyon⁶ modellerinin avantajlarından yararlanırken, dezavantajları azaltmaktır. Bu yöntemin amacı, tüm aksonların tartışmasız ve tamamen kesildiği, periferik bağışıklık sistemine maruziyetin en aza indirildiği ve optik sinirin kesilen uçlarının RGC rejenerasyonunun değerlendirilmesine izin vermek için kolayca yeniden yerleştirildiği tekrarlanabilir bir optik sinir yaralanması oluşturmaktı. Ek olarak, yöntem, yaralı RGC'lerin aksonal kısmına bölümlere ayrılmış erişime izin vermek ve akson spesifik müdahaleleri (ör., nörotrofik faktörler, hücresel nakiller) lokal olarak retroorbital optik sinire iletmek için geliştirilmiştir.

Bu tekniğin alternatif yöntemlere göre birçok avantajı vardır. Optik sinir ezilmesi ile karşılaştırıldığında, bu yöntem optik siniri tamamen ve güvenilir bir şekilde keser; Bu, istenmeyen akson koruma^7'nin potansiyel bir sorununu ele alır. Ek olarak, açıklanan yöntem, bir ezilme yaralanmasında olduğu gibi operatör tarafından uygulanan kuvvetin miktarına ve süresine bağlı olmayan ciddi bir aksonal yaralanmaya neden olur ve böylece değişkenliği azaltır⁸. Optik siniri kesmek için yerleşik yöntemlerin aksine, bu protokolde ayrıntılı olarak açıklanan yaklaşım, optik sinir kılıfının bütünlüğünü korur. Optik sinir kılıfını korumanın bir avantajı, optik sinirin periferik bağışıklık sistemine maruz kalmasını önlemesidir. Ayrıca, optik sinir kılıfının kesilen optik sinir üzerine uyguladığı mekanik kuvvetler, zorlu mikrocerrahi manipülasyonlara gerek kalmadan kesilen sinir uçlarını yeniden oluşturur ^9,10,11. Son olarak, optik sinir kılıfı sağlam olduğunda, yöntem, optik sinir kütükleri arasında, kök hücrelerin, nörotrofik faktörlerin veya polimerlerin lezyonlu RGC aksonlarına doğrudan sokulabileceği fiziksel bir boşluk üretir.

Optik sinir ezilmesi, tedavilerin etkinliğini belirlemek için optik sinir rejenerasyon stratejilerinin değerlendirildiği altın standart modeldir. Kemirgen optik sinirin boyutu, olası manipülasyonları, özellikle sinirin transeksiyonunu ve yeniden adaptasyonunu sınırlar. Bununla birlikte, omurilik yaralanması ve rejenerasyonu alanında, aksonal rejenerasyonu korunmuş akson^12'den ayırt etmek için tam bir transeksiyonun ideal model olduğu konusunda fikir birliği vardır. Burada açıklanan yöntem, bir optik sinir transeksiyon modelinde rejeneratif stratejileri değerlendirmek için teknik engelleri azaltır. Bu nedenle, bu model, optik sinir transeksiyonu ile optik sinir ezilme paradigmalarında tanımlanan umut verici stratejileri doğrulamak için kullanılabilir. Ek olarak, bu model doğrudan aksonal kompartmanı hedef aldığından, yaralı yetişkin RGC aksonları ve aksonal dejeneratif ve rejeneratif süreçlerden sorumlu mekanizmalar üzerindeki müdahalelerin incelenmesini sağlar.

Bu çalışmada tarif edilen optik sinir transeksiyonu modeli, optik sinir kılıfını korurken optik siniri tamamen kesmektedir. Bu yeni yaklaşım, optik sinir uçlarını yeniden şekillendirmek gibi teknik olarak zorlu bir sürece ihtiyaç duymadan bir transeksiyon modelinde akson rejenerasyonunu değerlendirmeyi amaçlayan deneyler için uygundur. Tekniğin yönleri, optik sinir ezmesi gerçekleştirmeye benzer; Bu nedenle, yaklaşım, optik sinir ezilmesi konusunda deneyimli operatörler tarafından gerçekleştirilebilir. Cerrahi yaklaşım, özel olarak tasarlanmış aletler gerektirmez ve hazır cerrahi aletler ve bir mikroenjeksiyon sistemi ile tamamlanabilir, bu da onu erişilebilir ve ekonomik hale getirir.

Protokol

Hayvanları içeren prosedürler, Gazi İşleri San Diego Sağlık Sisteminin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Postoperatif enfeksiyonları ve komplikasyonları sınırlamak için cerrahi aletler ve solüsyonlar cerrahi öncesi sterilize edildi.

1. Cerrahi teknik

1. Aseptik teknikler kullanarak ve kuruma özel hayvan kullanım protokollerine göre deneyler yapın.
2. Enfeksiyonları önlemek, hayvan refahını olumsuz etkilemekten kaçınmak ve çalışma üzerindeki olası olumsuz etkileri en aza indirmek için canlı dokularla temas eden aletleri ve malzemeleri sterilize edin. Yabancı maddeleri uzaklaştırmak ve buhar veya hızlı sterilizasyon ile sterilize etmek için cerrahi aletleri su ve deterjan veya enzimatik ürünlerle iyice temizleyin.
3. Aliquot sıvılarını bir doku kültürü başlığında steril kaplara koyun. Mikrolitre şırıngayı %70 etanol ile yıkayarak ve steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulayarak sterilize edin.

2. Anestezi

1. Bir izofluran buharlaştırıcı sistemi kullanarak sıçanları uyuşturun. İzofluranı 1 L / dk hızında tıbbi sınıf oksijen kullanarak% 4.5'lik bir konsantrasyonda ekli bir anestezi kutusuna buharlaştırın. Solunumu yavaşlayana ve hayvan sakinleşene kadar hayvanı anestezi kutusuna yerleştirin.
   NOT: Gaz anestezik ile anestezi kullanan bu ilk adım, operatör sedasyonsuz hayvanlara enjekte edilebilir anesteziklerin uygulanması konusunda rahat ve bilgiliyse gerekli değildir.
2. Ketamin (50 mg / kg), ksilazin (2.6 mg / kg) ve asepromazinden (0.5 mg / kg) oluşan yeterli miktarda anestezik kokteyli 30 G tüberkülin şırıngasına çekin. Sedasyonlu hayvanı anestezi kutusundan çıkarın. İşlem boyunca tutarlı sedasyon derinliği elde etmek için anestezi enjeksiyonunu intraperitoneal olarak uygulayın ve hayvanı kafesine geri koyun.
3. Bir ayak parmağı tutamağı bir yanıt uyandırmadığında işleme başlayın. Hayvanı derinlik ve solunum hızı açısından değerlendirin ve ağrı olmamasını sağlamak için prosedür boyunca her 5 dakikada bir ayak parmağınızı çimdikleyin.
4. Ameliyatın tamamlanmasının ardından, hayvanı stereotaksik çerçeveden çıkarın. Analjezi ve sıvı desteği sağlamak için deri altı salin (3 mL), ampisilin (0.15-0.2 mg / kg) ve banamin (2.5-5 mg / kg) enjeksiyonu uygulayın. Vücut ısısını korumak için hayvanı ısıtılmış bir kuluçka makinesine aktarın.

3. Cerrahi yaklaşım

1. Sıçanı (7-8 haftalık, Fischer 344 suşu) bir kafa stereotaksik çerçevesine ve ısıtılmış bir pedin üzerine yerleştirin. Stereotaksik çerçeveyi, sıçan kafası cerrahın soluna bakacak şekilde konumlandırın ve sol yörüngeyi cerrahi görüş alanında ortalayın.
2. Sol göze bir damla proparakain uygulayın ve göz kapağına ve göze %5 povidon-iyot uygulayarak gözü temizleyin. Kornea nemini korumak ve katarakt oluşumunu önlemek için her iki gözün korneasına oftalmik merhem sürün.
3. Üst göz kapağının epidermisinden göz kapağı kenarının orta yönüne 4-0'lık bir poliglaktin sütür geçirin ve bu dikişi daha sonraki adımlarda geçici bir tarsorrafi için kullanın. Göz kapağını açmak ve superior forniksi ortaya çıkarmak için dikişi kullanın.
4. Sabit çekiş ve pozlama uygulamak için poliglaktin sütürü stereotaksik çerçeveye bantlayın. Retroorbital içeriğin maruz kalmasını sınırlayabileceğinden aşırı çekişten kaçının.
5. Colibri forseps kullanarak, üst konjonktivayı yükseltin ve konjonktivayı bir çift Vannas makası ile limbus boyunca kesin. Üst limbus boyunca saat 4 yönünde bir peritomi yapın.
6. Serbest uçları kürenin altında olacak şekilde üst limbus boyunca ilmekli bir polipropilen sütür yerleştirerek küreye hafif düşük çekiş uygulayın. Peritomiyi takip eden superior limbus boyunca rezidüel doku, sütürü sklera veya limbustan geçirmeye gerek kalmadan sütür halkası üzerinde çekiş sağlamak için yeterlidir.
   1. Halkanın uçlarını bir bulldog kelepçesi ile sabitleyin ve kelepçenin havada serbestçe sallanmasına izin verin. Kelepçenin ağırlığı, küre üzerinde daha düşük çekiş uygulayacak ve retroorbital boşluğun daha fazlasını açığa çıkaracaktır.
7. Vannas makası ile sklera boyunca, dünyanın arka yüzünü takip ederek ve superior rektusun altında künt diseksiyon. Retroorbital boşluğa erişmek için kas tendonunu Vannas makasıyla keserek üst rektus kaslarını dünyadan çıkarın.

4. Optik sinire erişim

1. Arka kürenin temporal yönü boyunca Dumont # 5/45 forseps ile künt diseksiyon yapın ve üst lateral vorteks venini tanımlayın. Optik sinirin etrafındaki orbital kas konisini ortaya çıkarmak ve optik sinire erken zarar vermekten kaçınmak için superior lateral vorteks venine daha fazla künt diseksiyon yapın. Vorteks damarına zarar vermekten kaçının çünkü bu önemli kanamaya neden olabilir. Kanama olursa, kanama durana kadar pamuk uçlu bir aplikatör uygulanabilir.
2. Dumont #5/45 forsepslerini kullanarak, ucu orbital kas konisinin temporal yönüne dikkatlice yerleştirin ve optik siniri ortaya çıkarmak için forsepsleri kas liflerinin seyrine paralel olarak açın. Optik sinirin üzerindeki kas liflerini yanal olarak yer değiştirmek ve siniri tamamen açığa çıkarmak için forsepsleri kullanın. Artık kas lifleri, çekilen cam kılcal pipetin optik siniri kolayca delmesini önleyeceğinden, yalnızca optik sinir kılıfının optik siniri kapladığından emin olun.
3. Sinirin her iki yan yönü boyunca iki Dumont # 5/45 forseps yerleştirerek ve forsepsleri açarak sinirin maruz kalmasını sağlayın. Maruz kalma miktarı, optik sinirin kürenin 1.5-2.0 mm gerisinde ezilmesine ve optik sinire dorsal yönden çekilmiş bir cam kılcal pipetin yerleştirilmesine izin vermelidir.

5. Optik sinirin optik kılıf içine geçirilmesi

1. Dumont # 5/45 forseps kullanarak, uçları optik sinirin her iki tarafına dünyanın en az 1.5-2.0 mm arkasına yerleştirin. Forsepsin uçlarının sinirin çapı kadar uzandığından emin olun. Optik siniri ezmek için forsepsleri 5 saniye boyunca tamamen kapatın ve ezilme bölgesinin konumunu not edin.
2. Mikrolitrelik bir şırınga ile, camdan çekilmiş bir kılcal pipeti 1-2 μL PBS ile doldurun ve pipeti bir pipet tutucusuna takın. Pipet tutucuyu bir mikromanipülatöre monte edin ve mikromanipülatörü stereotaksik çerçeveye takın.
3. Mikroenjeksiyon sistemini, düğmeye her basıldığında 20 psi'lik bir basınçta 4 ms süreli tek bir darbe verecek şekilde ayarlayın. Pipeti cerrahi alana yerleştirin.
4. Cerrahi kapsam altında, pipet ucunu küçük bir hacim sağlayabilen ancak optik sinir kılıfına nüfuz etmek için yeterli sertliği sağlayacak kadar büyük bir boyuta (~ 20-30 μm çap) kırmak ve eğim vermek için bir çift # 55 forseps kullanın. Tek bir darbe vererek ve pipet ucunda sıvı olup olmadığını gözlemleyerek pipet ucunun açıklığını onaylayın.
5. Pipet ucunun konumunu, optik sinirin merkezindeki ve optik sinir kılıfı ile temas halinde olan optik sinir ezilme bölgesinin hemen üzerine kadar hassaslaştırın. Daha sonra 200 μm'lik bir derinlik belirlemek için pipetin mikromanipülatör üzerindeki dikey konumuna dikkat edin.
6. Pipet optik sinire girene kadar cerrahi dürbün altında ucu gözlemlerken pipeti indirin. Pipet ucu bükülürse ve optik sinir kılıfına nüfuz edecek sertliğe sahip değilse, pipeti geri çekin ve pipet ucunun uzunluğunu azaltmak ve çapını artırmak için bir çift #55 forseps kullanın. Pipet ucunda ayarlamalar yapıldıktan sonra, pipetle optik sinir kılıfına nüfuz etmeyi yeniden deneyin.
7. Pipet ucu ile optik sinire girdikten sonra, gerekirse pipeti geri çekin. Pipet ucunun konumu, stereotaksik mikromanipülatör tarafından gösterildiği gibi, adım 5.5'te belirtilen başlangıç konumundan optik sinirin yüzeyinin 200 μm altında olmalıdır.
8. Cerrahi kapsam altında optik siniri gözlemlerken, mikroenjeksiyon sistemi ile hidrostatik basınç darbeleri uygulayın. Darbeler uygulanırken, optik sinirin transeksiyonunu doğrulamak için optik sinirin distal ve proksimal uçları arasında doğrusal bir ayrım not edilmelidir.
   NOT: 250-500 nL'lik enjeksiyon hacmi, optik siniri kesmek için gerekli kuvveti sağlamak için genellikle yeterlidir. 1 μL'den fazla gerektiren enjeksiyonlar, enjeksiyon bölgesini yeniden konumlandırma ihtiyacını gösterebilir. Sağlam parankima enjekte edilen daha büyük hacimler, yöntemin optik siniri tamamen kestiği göz önüne alındığında ek RGC hasarına neden olmayabilir, ancak optik sinirin fasikülleri boyunca takip etme olasılığı daha yüksektir. Yeterli sıvı hacminin enjeksiyonuna rağmen optik sinirin doğrusal bir transeksiyonunun gözlenmemesi, muhtemelen pipetin ezilme bölgesinde yanlış konumlandırıldığını ve yeniden konumlandırılması gerektiğini gösterir. Enjeksiyon basıncında %50'lik bir artış da gerekli olabilir.

6. Kapanış ve kurtarma

1. Pipeti geri çekin ve geri çekilen Dumont #5/45 forsepslerini çıkarın. Bulldog kelepçesini ve ilmekli polipropilen sütürü küreden çıkararak gözü nötr konuma getirin.
2. Konjonktivayı kornea limbusuna yeniden konumlandırın, dokunun uygun şekilde yerleştirilmesine ve iyileşmesine izin vermek için ters çevrilmiş herhangi bir konjonktivayı serbest bırakmayı sağlayın. Göze oftalmik topikal antibiyotik merhem sürün.
3. Bandı göz kapağı 4–0 poliglaktin süüründen çıkarın ve geçici bir tarsorrafi için kullanmak üzere dikişi yerinde tutun. Sütürü alt göz kapağının göz kapağı kenarından, subkutiküler bölgeden inferior olarak geçirin ve epidermisten çıkın. Sütürü, gözü kapatmaya yetecek kadar basınçla bağlayın.
4. Cerrahi sonrası analjezikleri kurumsal protokollere ve hayvan bakım otoritesi yönergelerine göre uygulayın. Ameliyattan sonra iyileşmek için hayvanı bağımsız olarak ısıtılmış bir kafeste barındırın. Kazara aspirasyonu önlemek için kurtarma kafesine yatak takımı koymayın.

Sonuçlar

Optik sinirin transeksiyonu tipik olarak yaralanmadan sonraki 14 gün içinde yaralanan RGC'lerin %80-90'ının apoptotik kaybına neden olur. Tarif edilen teknik, optik sinir kılıf bütünlüğünü korurken optik siniri keser (Şekil 1). RGC kaybının derecesi, burada açıklanan yöntemle transeksiyon sonrası kesilen sinir uçlarının zahmetsizce takılması avantajıyla geleneksel optik sinir transeksiyonu ve optik sinir ezilme modelleriyle karşılaştırılabilir (Şekil 2). Kesilen optik sinir uçlarının bu şekilde yeniden bağlanması, aksonların büyüyebileceği bir substrat sağlayarak ve kesilen sinir uçlarını yeniden bağlamak için mikrocerrahi manipülasyona gerek kalmadan bir transeksiyon modelinde RGC aksonal rejenerasyonunun değerlendirilmesini sağlar (Şekil 3). RGC aksonlarının kolera toksin B alt birimi (CTB) ile anterograd izlemesi, CTB pozitif aksonların optik sinir transeksiyonunu koruyan bir kılıf sonrasında tamamen kesildiğini göstermektedir (Şekil 4). Optik siniri keserken optik sinir kılıfını korumak, nörotrofik faktörler veya hücreler gibi araştırma materyallerinin lezyonlu RGC aksonlarına iletilebileceği ve pozisyonda tutulabileceği kapalı bir alan oluşturur (Şekil 5). Eğitimin ilk aşamalarında, toplam transeksiyonun %60-70 oranında başarı oranı beklenmektedir. Tecrübe ile total transeksiyonun başarı oranı yaklaşık %90-95'tir.

Şekil 1: Optik sinir kılıfını korurken optik siniri kesmek. (A) Transeksiyondan önce sağlam optik sinirin maruz kaldığını gösteren cerrahi alanın resmi. (B) Transeksiyonu takiben optik sinirin resmi. İnce bir cam pipet, transeksiyon bölgesindeki optik sinir kılıfını deldi ve optik sinir uçları arasındaki boşluğa bir hücre süspansiyonu (bulanık çözelti) verdi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Optik sinir transeksiyonunu koruyan bir optik sinir kılıfını takiben retinal ganglion hücre kaybı. (A) sağlam bir optik sinir, (B) optik sinir transeksiyonunu koruyan bir optik sinir kılıfı, (C) geleneksel bir optik sinir transeksiyonu veya (D) 14 gün önce optik sinir ezilmesi olan gözlerden elde edilen temsili tüm retina düz montajları gama sinüklein (SNCG) için immün olarak etiketlendi. Görüntüler, 10x objektif kullanılarak bir floresan mikroskobundan elde edildi, gölgeleme için düzeltildi ve tek bir görüntü oluşturmak için dikildi. Retina boyunca retina ganglion hücre (RGC) cisimlerinin kaybı lezyonlu gözlerde belirgindi. İç kısımlar, retinanın daha yüksek büyütme görüntülerini gösterir ve optik sinir yaralanmalarını takiben önemli RGC kaybı gösterir. (E) RGC sağkalımının ölçülmesi, optik sinir yaralanmalarını takiben sağlam optik sinirlerin kontrolüne kıyasla önemli RGC kaybı gösterir. *P< Sağlam ile karşılaştırıldığında 0.05; post-hoc Tukey testi ile tek yönlü ANOVA. n = grup başına 3 hayvan; hata çubukları SD'yi temsil eder. SP-ONT, kılıf koruyucu optik sinir transeksiyonu; ONT, optik sinir transeksiyonu; ONC, optik sinir ezilmesi. Ölçek çubukları = 1.000 μm. İç kısımlardaki ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Optik sinir yaralanmalarını takiben optik sinirlerin kesitleri. (A-C) optik sinir kılıfı koruyucu transeksiyon, (D-F) geleneksel optik sinir transeksiyonu veya (G-I) optik sinir ezilmesinden 14 gün sonra optik sinirler boyunca uzunlamasına kesitin temsili görüntüleri. (A,D,G) Glial fibriler asidik protein (GFAP) için immünoetiketleme lezyonun derecesini tanımlarken, (B, E, H) 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile DNA işaretlemesi, optik sinirin uzunluğu boyunca ve lezyon bölgesi içinde bitişik hücreselliği gösterir. (C,F,I) Lezyon bölgesinde GFAP pozitif nöral dokunun lokalizasyonunu ve hücreselliği gösteren birleştirilmiş görüntüler. Ölçek çubukları = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Optik sinir transeksiyonunu koruyan bir optik sinir kılıfını takiben optik sinirin kesiti. İntravitreal kolera toksin B alt birimi (CTB) enjeksiyonu ile anterograd akson izleme ile transeksiyonu koruyan bir optik sinir kılıfından 14 gün sonra bir optik sinir boyunca uzunlamasına bir kesitin temsili görüntüleri. (A) Küreden (solda) beyne (sağda) uzanan CTB işaretli RGC aksonlarının tam lezyonu gözlenebilir. (B) Glial fibriler asidik protein (GFAP) için immünoetiketleme, optik sinirin tüm çapını içeren geniş bir lezyonu tanımlar. (C) 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile DNA etiketlemesi, lezyon bölgesi içindeki hücreselliği gösterir. (D) Lezyon bölgesinde CTB işaretli aksonların, GFAP pozitif nöral dokunun ve hücreselliğin lokalizasyonunu gösteren birleştirilmiş bir görüntü. Ölçek çubukları = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Hücre grefti alan transekte edilmiş bir optik sinirin uzunlamasına kesiti. Floresan protein tdTomato'yu eksprese eden nöral kök hücrelerin (NSC'ler) transeksiyonu ve transplantasyonunu koruyan bir optik sinir kılıfından 14 gün sonra bir optik sinir boyunca uzunlamasına bir kesitin temsili görüntüleri. (A) Glial fibriler asidik protein (GFAP) için immünoetiketleme, kesilen optik sinir uçlarının tamamen ayrıldığını gösterdi. (B) tdTomato eksprese eden NSC'ler, tarif edilen teknikle oluşturulan boşluk içinde yer aldı ve transplantasyondan sonra hayatta kalmaya devam etti. (C) Aşılanmış NSC'ler, kesilen optik sinirin her iki kesi ucuna doğrudan uygulandı. Ölçek çubukları, 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

Optik sinir transeksiyon modelini tanımlayan cerrahi işlemler daha önce yayınlanmıştır⁶. Bununla birlikte, bu protokollerde detaylandırılan teknikler, optik siniri kesmek için meningeal kılıfın kesilmesini içerir. Ayrıca, önceki transeksiyon modellerinde RGC akson rejenerasyonunu değerlendirmek için, proksimal optik sinir kütüğüne kesilen optik sinir uçlarını veya periferik sinir greftini yerleştirmek için zorlu mikrocerrahi manipülasyonlar gerekliydi^10,13. Burada tarif edilen protokol, optik siniri keserken optik sinir kılıfını minimal düzeyde bozar ve teknik olarak zorlayıcı mikrocerrahi manipülasyonlara gerek kalmadan bir transeksiyon modelinde RGC akson rejenerasyonunun değerlendirilmesine izin verir.

Bu protokolde birkaç adım kritik öneme sahiptir. Oftalmik artere ve optik sinir başını besleyen damar sistemine zarar vermemek için özen gösterilmelidir. Bu nedenle, adım 5.1, dünyanın en az 1.5-2.0 mm gerisinde tamamlanmalıdır. Oftalmik arterde hasar meydana gelirse ve retinal kan akışını bozarsa, phthisis takip etmesi muhtemel olduğundan göz daha sonraki deneylerden çıkarılmalıdır. Adım 5.4-5.6 sırasında, optik sinir kılıfının bütünlüğünü korumak ve cam pipetin optik sinire girdiği açıklığın boyutunu en aza indirmek önemlidir. Bunu yapmak, sıvı geri akışını azaltmak için pipet ucunun etrafında sıkı bir sızdırmazlık oluşturur ve optik siniri kesmek için yeterli hidrostatik basıncın oluşmasına izin verir. Cam pipetlerin ucunun eğim verilmesi, pipetin ikincil hasara neden olmadan optik sinire girme kolaylığını artıracaktır.

Bu yöntemin erişilebilirliğini iyileştirmek için operatörlerin yapabileceği olası değişiklikler vardır. Tarif edilen prosedürler, fasiyal ve trigeminal sinirin korunması ile orbital dokunun minimal diseksiyonunu ve çıkarılmasını içerir. Bu, morbiditeyi ve kanama risklerini azaltırken, orbital yağ ve lakrimal bez gibi dokular önemli yapıların görüntülenmesini sınırlayabilir. Özellikle yaşlı hayvanlarda görselleştirmeyi geliştirmek için cerrahi alanı tıkayan dokunun dikkatli bir şekilde çıkarılması gerekebilir. Optik sinire erişimi iyileştirmek için yanal bir yaklaşım da kullanılabilir. Bununla birlikte, lateral diseksiyon, trigeminal sinir de dahil olmak üzere ek yapılara zarar verme riski taşır, daha fazla yer tutar ve enjeksiyonlar için enstrümantasyonun yönlendirilmesinde kendi zorluklarını ortaya çıkarabilir.

Bu yöntemin olası bir sınırlaması, optik siniri doğrudan manipüle edememe ve tüm transeksiyonu tamamen görselleştirememesidir. Bu nedenle, eksik bir transeksiyon olasılığı vardır. Bununla birlikte, adım 5.8 sırasında ayrılan sinir uçlarının görsel olarak doğrulanmasının, başarılı ve tam bir transeksiyonun güvenilir bir göstergesi olduğunu gözlemledik. Sinir uçları ayrılmazsa, enjeksiyon pipetinin yeniden konumlandırılması veya enjeksiyonun basıncının %50 oranında arttırılması, sinirin tamamen kesilmesi için yeterli kuvveti sağlamalıdır.

Mevcut yöntemlerle ilgili olarak, bu yaklaşım optik sinir kılıfının bütünlüğünü korur. Optik sinir kılıfının bütünlüğünün korunmasında, kesilen optik sinirin uçları orbital ortama ve periferik bağışıklık sistemine maruz kalmaz, böylece RGC yanıtlarını potansiyel olarak etkileyebilecek bağışıklık faktörlerine maruz kalmayı sınırlar. Ek olarak, optik siniri keserken optik sinir kılıfının bütünlüğünü korumak, optik sinir uçları ve optik sinir kılıfı tarafından sınırlanan kapalı bir fiziksel alan oluşturur. Nörotrofik faktörlerin, hücrelerin veya polimerlerin yaralı RGC'lerin aksonal bölmesine lokalize olarak verilmesi, yeni oluşturulan boşluğa enjekte edilerek sağlanabilir. ¹⁴ Alternatif olarak, RGC akson rejenerasyonu, zorlu mikrocerrahi tekniklere ihtiyaç duymadan, kesilen optik sinir uçlarının anastomoz yapmasına izin vererek bir transeksiyon modelinde değerlendirilebilir.

Bu yöntemin uygulamaları, aksonal dejenerasyondan sorumlu yolakların belirlenmesi ve transeksiyon yaralanması sonrası aksonal kaybın önlenmesi için yaralı RGC aksonal kompartmanının aksona özgü müdahalelerle değerlendirilmesini içerir. Ayrıca, bu yöntem, teknik olarak zor optik sinir anastomoz prosedürlerine olan ihtiyacı ortadan kaldırarak, transeksiyon modelinde RGC aksonal rejenerasyon çalışmalarını daha geniş araştırma topluluğu için erişilebilir hale getirir. RGC akson rejenerasyonunu teşvik etmeyi amaçlayan müdahaleler, bu ciddi yaralanma modeli ile değerlendirilebilir ve korunmuş aksonlar için endişe olmadan tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlayabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Polyglactin suture	Ethicon	J315H
9-0 Polypropylene suture	Ethicon	1754G
Acepromazine	Butler	003845	0.5-4 mg/kg Stock Concentration: 10 mg/mL Final Concentration: 0.25 mg/mL
Ampicillin	Sandoz	0781-3404-85	80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/mL
Anesthesia System	VetEquip	901806
Animal incubator	Precision Incubators	Chick Chalet II
Banamine	Schering-Plough	0061-0851-03	2.5-5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/mL Final Concentration: 0.5 mg/mL
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	1B150F-4
Colibri forceps	Katena	K5-1500
Dumont #5/45 forceps	Fine Science Tools	11251-35
Heat therapy pump	Kent Scientific	HTP-1500
Isoflurane	Covetrus	29404
Johns Hopkins Bulldog Clamp	Roboz	RS-7440
Ketamine	Putney	26637-411-01	40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/mL Final Concentration: 25 mg/mL
Microinjection system (Picospritzer II)	General Valve, Inc
Microliter syringe 5 µL	Hamilton	88000
Micropipette puller	Sutter Instrument Co.	Model P-77 Brown-Flaming
Neomycin/Polymyxin B sulfates/Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment	Bausch + Lomb
PBS	Millipore	BSS-1005-B
Povidone-iodine	Healthpets	BET16OZ
Proparacaine hydrochloride 0.5%	Bausch + Lomb
Ringers	Abbott	04860-04-10	2-3 mL/injection
Stereotaxic Frame	Kopf
Surgical Microscope	Zeiss
Vannas scissors	Fine Science Tools	91500-09
Xylazine	Lloyd	0410	2.5-8 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/mL Final Concentration: 5.8 mg/mL