Doku Örneklerinin Kütle Spektrometresi Bazlı Av Tüfeği Proteomik Kapsamlı İş Akışı

Özet

Açıklanan protokol, iki yaklaşım kullanarak doku örneklerinin optimize edilmiş bir nicel proteomik analizini sağlar: etiket bazlı ve etiketsiz nicellik. Etiket tabanlı yaklaşımlar proteinlerin daha doğru nicelliği avantajına sahipken, etiketsiz bir yaklaşım daha uygun maliyetlidir ve bir kohorttan yüzlerce örneği analiz etmek için kullanılır.

Özet

Kütle spektrometreslerindeki son gelişmeler, sağlam ve tekrarlanabilir veri kümelerinin üretimiyle birlikte derin proteomik analizlerle sonuçlanmıştır. Bununla birlikte, önemli teknik gelişmelere rağmen, hasta kanı, CSF ve doku gibi biyospepsimenlerden örnek hazırlama hala önemli zorluklar oluşturmaktadır. Biyobelirteçleri tanımlamak için, doku proteomik genellikle araştırma bulgularını kürsüden kliniğe çevirmek için çekici bir örnek kaynak sağlar. Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı gibi kanser ve nörodejeneratif hastalıkların erken tanısı için potansiyel aday biyobelirteçleri ortaya alabilir. Doku proteomik ayrıca proteinlerin bolluğuna dayanan çok sayıda sistemik bilgi verir ve ilginç biyolojik soruların ele alınmasına yardımcı olur.

Nicel proteomik analiz iki geniş kategoride gruplandırılabilir: etiket tabanlı ve etiketsiz bir yaklaşım. Etiket tabanlı yaklaşımda, proteinler veya peptitler SILAC (hücre kültüründe amino asitlerle kararlı izotop etiketlemesi) gibi kararlı izotoplar veya ICAT (izotop kodlu benzeşim etiketleri), TMT (tandem kütle etiketi) veya iTRAQ (göreceli ve mutlak nicelik için izobarik etiket) gibi kimyasal etiketler kullanılarak etiketlenir. Etiket tabanlı yaklaşımlar proteinlerin daha doğru nicelliği avantajına sahiptir ve izobarik etiketler kullanılarak, tek bir deneyde birden fazla örnek analiz edilebilir. Etiketsiz yaklaşım, etiket tabanlı yaklaşımlara uygun maliyetli bir alternatif sağlar. Belirli bir kohorta ait yüzlerce hasta örneği, klinik özelliklere göre analiz edilebilir ve diğer kohortlarla karşılaştırılabilir. Burada, yaşam bilimlerindeki uygulamalar, özellikle biyobelirteç keşfi tabanlı projeler için çok önemli olan etiketsiz ve etiket tabanlı proteom profilleme yöntemlerini kullanan doku örnekleri için optimize edilmiş bir nicel proteomik iş akışı tanımladık.

Giriş

Proteomik teknolojiler, hastalığın tespiti ve prognostikasyonuna yardımcı olabilecek potansiyel aday belirteçlerinin tanımlanmasını ve nicelleştirilmesini sağlama potansiyeline sahiptir¹. Kütle spektrometresi alanındaki son gelişmeler protein düzeyinde klinik araştırmaları hızlandırmıştır. Araştırmacılar, şimdi protein tanımlama ve niceleme için daha fazla hassasiyet sunan kütle spektrometrisi bazlı proteomik kullanarak birkaç hastalığın karmaşık patobiyolojisinin zorluğunu ele almaya çalışıyorlar². Proteinlerin doğru nicel ölçümü, sağlıklı ve hastalıklı bireylerde proteinler arasındaki dinamik ve mekansal işbirliğini an....

Protokol

Bu çalışma kurumsal inceleme kurulları ve Hindistan Teknoloji Enstitüsü Bombay etik komitesi (IITB-IEC/2016/026) tarafından incelenmiş ve onaylanmıştır. Hastalar/katılımcılar bu çalışmaya katılmak için yazılı onaylarını sundular.

1. Doku lysate hazırlığı

NOT: Proteazları etkin tutmamak için buz üzerinde aşağıdaki adımların tümlerini uygulayın. Çapraz bulaşmayı önlemek için neşterlerin ve kullanılan tüplerin steril olduğundan emin olun.

1. Boncuk dövme tüpüne ~ 30 mg doku alın, 200 μL 1x fosfat tampon salin (PBS) ekleyin ve girdap ekleyin.
   NOT: Bu çalışmada lysate hazırlığı için taze don....

Sonuçlar

Keşif proteomik için iki farklı yaklaşım kullandık: etiketsiz ve etiket tabanlı proteomik yaklaşımlar. SDS-PAGE'deki doku örneklerinin protein profili bozulmamış proteinleri göstermiştir ve proteomik analiz için düşünülebilir (Şekil 2A). Cihazın kalite kontrol kontrolü sistem uygunluk yazılımı ile izlendi ve cihaz performansındaki günsel varyasyonu gösterdi (Şekil 2B). BSA örneğinin 30 dakikalık LC gradyanı

Tartışmalar

Biyolojik örneklerin doku proteomikleri, hastalığın ilerlemesinin farklı aşamalarıyla ilişkili yeni potansiyel biyobelirteçleri keşfetmemizi sağlar. Ayrıca sinyalizasyon mekanizmasını ve hastalığın ilerlemesiyle ilişkili yolları açıklar. Doku nicel proteomik analizi için açıklanan protokol tekrarlanabilir iyi kapsama verileri sağlar. Adımların çoğu üreticinin talimatlarından uyarlanmıştır. Yüksek kaliteli veri elde etmek için aşağıdaki adımlar çok önemlidir. Bu nedenle, bu adıml.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Acetonitrile (MS grade)	Fisher Scientific	A/0620/21
Bovine Serum Albumin	HiMedia	TC194-25G
Calcium chloride	Fischer Scienific	BP510-500
Formic acid (MS grade)	Fisher Scientific	147930250
Iodoacetamide	Sigma	1149-25G
Isopropanol (MS grade)	Fisher Scientific	Q13827
Magnesium Chloride	Fischer Scienific	BP214-500
Methanol (MS grade)	Fisher Scientific	A456-4
MS grade water	Pierce	51140
Phosphate Buffer Saline	HiMedia	TL1006-500ML
Protease inhibitor cocktail	Roche Diagnostics	11873580001
Sodium Chloride	Merck	DF6D661300
TCEP	Sigma	646547
Tris Base	Merck	648310
Trypsin (MS grade)	Pierce	90058
Bradford Reagent	Bio-Rad	5000205
Urea	Merck	MB1D691237
Supplies
Hypersil Gold C18 column	Thermo	25002-102130
Micropipettes	Gilson	F167380
Stage tips	MilliPore	ZTC18M008
Zirconia/Silica beads	BioSpec products	11079110z
Equipment
Bead beater (Homogeniser)	Bertin Minilys	P000673-MLYS0-A
Microplate reader (spectrophotometer)	Thermo	MultiSkan Go
pH meter	Eutech	CyberScan pH 510
Probe Sonicator	Sonics Materials, Inc	VCX 130
Shaking Drybath	Thermo	88880028
Orbitrap Fusion mass spectrometer	Thermo	FSN 10452
Nano LC	Thermo	EASY-nLC1200
Vacuum concentrator	Thermo	Savant ISS 110
Software
Proteome Discoverer	Thrermo	Proteome Discoverer 2.2.0.388