Geç Embriyonik Drosophila Gonad'ın Diseksiyonu ve Canlı Görüntülemesi

Özet

Burada, geç embriyonik Drosophila erkek gonadını canlı olarak görüntülemek için gerekli bir diseksiyon protokolü sunuyoruz. Bu protokol, normal koşullar altında veya transgenik veya farmakolojik manipülasyondan sonra dinamik hücresel süreçlerin gözlemlenmesine izin verecektir.

Özet

Drosophila melanogaster erkek embriyonik gonad, germ hücresi gelişimi, piRNA biyolojisi ve niş oluşumu dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere gelişim biyolojisinin çeşitli yönlerini incelemek için avantajlı bir modeldir. Burada, in vivo canlı görüntülemenin oldukça etkisiz olduğu bir dönemde gonad ex vivo'yu canlı olarak görüntülemek için bir diseksiyon tekniği sunuyoruz. Bu protokol, embriyoların bir görüntüleme kabına nasıl aktarılacağını, uygun şekilde evrelenmiş erkek embriyoların nasıl seçileceğini ve yapısal bütünlüğünü korurken gonadın çevresindeki dokudan nasıl diseke edileceğini özetlemektedir. Diseksiyonu takiben, gonadlar dinamik hücresel süreçleri görselleştirmek için konfokal mikroskop kullanılarak görüntülenebilir. Diseksiyon prosedürü kesin zamanlama ve el becerisi gerektirir, ancak yaygın hataların nasıl önleneceği ve bu zorlukların nasıl üstesinden gelineceği konusunda fikir veriyoruz. Bildiğimiz kadarıyla bu, Drosophila embriyonik gonad için ilk diseksiyon protokolüdür ve aksi takdirde erişilemeyen bir zaman penceresinde canlı görüntülemeye izin verecektir. Bu teknik, doğal gonadal ortamlarında hücrelerin içinde veya arasında meydana gelen dinamik süreçleri incelemek için farmakolojik veya hücre tipine özgü transgenik manipülasyonlarla birleştirilebilir.

Giriş

Drosophila melanogaster testis, birçok dinamik hücresel süreci anlamamız için bir paradigma olarak hizmet etmiştir. Bu modelin çalışmaları, kök hücre bölünme regülasyonu 1,2,3, germ hücresi gelişimi ^4,5, piRNA biyolojisi 6,7,8 ve niş-kök hücre sinyal olayları^{9,10,11,12,13'e} ışık tutmuştur. Bu model avantajlıdır çünkü genetik olarak izlenebilir 14,15'tir ve kök hücreleri doğal ortamlarında yaşayabileceğimiz birkaç yerden biridir 3,16,17,18. Bununla birlikte, bu modelin canlı görüntülemesi yetişkin doku ve erken embriyonik aşamalarla sınırlandırılmıştır, bu da geç embriyodaki gonadal dinamikler hakkındaki bilgimizde bir boşluk bırakarak, nişin ilk oluştuğu ve işlev görmeye başladığı kesin aşamadır.

Geç evre embriyonik gonad, anteriordaki somatik niş hücrelerden ve daha arka bölgeler boyunca somatik gonadal hücreler tarafından ensiklopedik germ hücrelerinden oluşan bir küredir¹⁹. Bu organ, erken embriyonik Aşama 17 ^17,20,21'e kadar in vivo olarak canlı olarak görüntülenebilir. Büyük ölçekli kas kasılmalarının başlaması nedeniyle daha fazla görüntüleme engellenir. Bu kasılmalar o kadar şiddetlidir ki, gonadı görüntüleme çerçevesinin dışına iter ve bu tür hareketler görüntüleme yazılımı ile düzeltilemez. Laboratuvarımız, canlı görüntüleme için bu zor dönemde meydana gelen niş oluşum mekanizmalarını ortaya çıkarmakla ilgilenmektedir. Bu nedenle, embriyonik Aşama 16'dan başlayarak gonadın canlı görüntüsüne ex vivo bir yaklaşım ürettik ve gonad gelişiminin bu önemli döneminde hücre dinamiklerinin incelenmesini kolaylaştırdık. Laboratuvarımızdan önceki çalışmalar, bu ex vivo görüntülemenin in vivo gonad gelişimi^17'yi sadık bir şekilde özetlediğini göstermektedir. Bu teknik, Drosophila embriyonik gonadı için türünün ilk ve tek örneğidir.

Burada, geç embriyonik evrelerde gonadın ex vivo canlı görüntülenmesi için gerekli diseksiyon protokolü sunulmuştur. Bu protokol, farmakolojik tedavilerle veya gonad içindeki spesifik hücre soylarının transgenik manipülasyonu ile birleştirilebilir. Bu tekniği kullanarak, kök hücre niş oluşumunun adımlarını başarıyla görüntüledik¹⁷. Bu görüntüleme yaklaşımı, kök hücre biyolojisi alanı için etkilidir, çünkü niş oluşumunun ilk aşamalarının doğal ortamında gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesini sağlayacaktır^15,17. Bu yöntem kök hücre biyolojisi alanı için faydalı olsa da, hücresel yeniden düzenlemeler 22,^{hücre yapışması 2,12,23} ve hücre göçü ²³ dahil olmak üzere bu gelişimsel zaman noktasında gonadda meydana gelen dinamik süreçleri görselleştirmek için de uygulanabilir. Bu diseksiyon protokolü böylece birçok temel hücre biyolojik süreci hakkındaki anlayışımızı geliştirecektir.

Protokol

1. Diseksiyondan bir gün önce hazırlık

1. Elektrolitik olarak bir tungsten iğnesini²⁴ keskinleştirin, böylece elde edilen çap yaklaşık 0.03 mm olur. Verilen voltajı yaklaşık 14 V'a ayarlayın ve 3,3 M NaOH kullanın. Keskinleştirme 1 veya 2 dakikadan fazla sürmemelidir.
   DİKKAT: NaOH oldukça aşındırıcıdır ve ciltle temas ettiğinde yanıklara neden olur. Kullanırken eldiven ve gözlük takın ve bir duman başlığının içinde çalışın.
   NOT: Kullandıktan sonra, NaOH'yi bir polipropilen Falcon tüpünde saklayın.
2. Hazırlanan görüntüleme ortamını yapın. 15 mL'lik bir konik tüpte, 4.25 mL Schneider ortamını 750 μL Fetal Sığır Serumu (FBS,% 15 nihai konsantrasyon) ve 27.5 μL Penisilin-Streptomisin (0.05 U / μL Penisilin, 0.05 μg / μL nihai konsantrasyon) ile birleştirin. Hazırlanan bu görüntüleme ortamını 4 °C'de saklayın.
3. Heptan-tutkal çözeltisi yapın. Yaklaşık 20 cm çift taraflı bantla doldurulmuş 20 mL sızdırmaz şişeye yaklaşık 0,5 mL heptan ekleyin. Bir nutatörde yaklaşık bir saat boyunca sallayın veya su ve gliserol arasında bir tutarlılık elde edilene kadar bir pipet ucuyla karıştırın. Bu çözünmüş tutkal çözeltisi, heptan buharlaşmadan önce birkaç gün sürecektir. Çözeltiyi tazelemek için, ilave bir 0,5 mL heptan ve kaya ekleyin.
   NOT: Etkili bir heptan-yapıştırıcı çözeltisi, çeşitli heptan-bant oranları ve ayrıca değişen sallanma / karıştırma süreleri kullanılarak hazırlanabilir. Yukarıdaki spesifikasyonlar sadece böyle bir yeterli çözeltinin hazırlanması veya tazelenmesi için önerilerdir.

2. Embriyo toplama – diseksiyondan 15-17 saat önce

1. Bir elma suyu agar tabağı^25'e taze maya ezmesi ekleyin. Küçük deliklerle delikli boş bir gıda şişesine yetişkin sinekler (10 günden az) ekleyerek bir embriyo toplama kafesi kurun²⁶. Mayalı agar plakasını kullanarak toplama kafesini kapatın, şişeye bantlayın ve kafesi plaka tarafı aşağı olacak şekilde 25 ° C'lik karanlık bir inkübatöre 1 saat boyunca yerleştirin.
   NOT: Sinekler, gonadı floresan olarak işaretleyecek bir transgeni ifade etmelidir, örneğin, six4-eGFP::Moesin²⁰, çünkü embriyoların diseksiyonu stereo-floresan mikroskop altında gerçekleşecektir. Gonadı işaretlemek için kullanılan genotiplerin listesi için Malzeme Tablosu'na bakınız.
2. Kafesi inkübatörden çıkarın ve bu ilk koleksiyonu atın. Taze mayalanmış bir agar plakası ile değiştirin ve kafesi 2 saat boyunca inkübatöre geri yerleştirin.
   NOT: İlk embriyo koleksiyonu, döllenmiş, gelişmekte olan embriyoların dişilerini temizlemek, sıkı bir şekilde zamanlanmış ikinci bir embriyo koleksiyonu elde etmek için kullanılır.
3. Agar plakasını kafesten çıkarın ve (mayalı tarafı yukarı bakacak şekilde) kapatılabilir plastik bir kabın içindeki nemli bir kağıt havluya yerleştirin. Embriyoları 14.5 saat yaşlandırmak için bu nemli odayı 25 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin (son yaşlar, yumurtlamadan sonra 14.5-16.5 saat).
   NOT: Adım 2.4'e başlamadan hemen önce, adım 3.1 ve 3.2'yi tamamlayın.
4. Agar plakasını inkübatörden çıkarın ve bir fışkırtma şişesi kullanarak, bir boya fırçasıyla hafifçe fırçalayarak maya macununu çözmek için agar plakasına yeterli su ekleyin. Embriyoları ve çözünmüş mayayı bir tartım teknesinin içinde oturan küçük bir ağ elek sepetinde durulayın. Sepette, çoğu maya macunu ağdan süzülene kadar su fışkırtma şişesiyle durulayın.
5. Tartım teknesindeki suyu çıkarın ve sepeti tekrar içine yerleştirin. Embriyoları, bir fışkırtma şişesi kullanarak% 50'lik bir ağartıcı çözeltisine batırarak dekoryonlayın. Ağartıcı çözeltisi 3-5 mm derinliğe sahip olmalıdır. Embriyoları ara sıra dönerek ~ 2 dakika boyunca çamaşır suyuna batırılmış halde tutun.
   DİKKAT: Çamaşır suyu aşındırıcıdır ve gözleri ve solunum yollarını tahriş edebilir veya zarar verebilir. Çamaşır suyunu kullanırken eldiven ve gözlük takın.
   NOT: Bu süre zarfında, adım 3.3'ü mümkün olduğunca tamamlayın. Dekoryonasyon ilerlemesi, sepeti stereo mikroskop altına yerleştirerek ve dorsal uzantıların yokluğunu kontrol ederek kontrol edilebilir. Gerekirse embriyoları ek süre için ağartıcı çözeltisine batırın.
6. Ağartıcıyı atın ve sepetin içindeki embriyoları bir fışkırtma şişesinden suyla iyice durulayın (~ 3 s için, ağ sepetini kağıt havlularla lekeleyin; 2-3 kez tekrarlayın).

3. Diseksiyon hazırlık günü

1. 1.5 mL'lik bir Eppendorf tüpüne (0.2 mg/mL nihai konsantrasyon) 1.500 μL hazırlanmış görüntüleme ortamına (bkz. adım 1.2) 30 μL insülin (10 mg/mL) ekleyin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığına dengelemek için tüpü tezgahın üzerinde bırakın.
2. Tutkalla kaplanmış kapak kayma şeritleri hazırlayın.
   1. 22 mm x 22 mm'lik bir kapak kaymasını eşit büyüklükte dört şerit halinde kesmek için elmas uçlu bir bıçak kullanın (Şekil 1A).
   2. Bir şeridi almak için forseps kullanın ve şeridin her iki tarafına toplam yaklaşık 30 μL heptan-yapıştırıcı çözeltisi yayın (Şekil 1B). Eşit bir tutkal kalıntısı tabakası elde etmek için, heptan buharlaşırken şeridi çeşitli açılarda eğin.
   3. Tutkal kaplı şeridi bir kapaklı kutunun boş bir yuvasında saklayın; yapışkanlığını korumak için, şeridi eğimli, ancak dik bir konumda, kutu yüzeyleriyle teması en aza indirmek için kutunun kenarlarına yaslanmış olarak yerleştirin (Şekil 1C). Kutuyu kapatın, böylece havadaki partiküller yapıştırıcıyı kaplamaz ve yapışkanlığını azaltır.
3. Tezgahın üstüne şu öğeleri yerleştirin: 6 inç cam Pasteur pipet, mikroskop slaytı, uygun pipet uçlarına sahip bir P200 ve bir P1000 pipetçi, Ringer çözeltisi²⁷ (NaOH ile pH 7,3'e ayarlanır) ve açık, Poli-D-Lizin kaplı 35 mm görüntüleme kabı.
4. Embriyoları ağ elek sepetinden 500-750 μL heptan ile doldurulmuş küçük bir saat camına aktarın.
   1. Sepetin kenarlarını ve altını bir mendil mendiliyle kurulayın. Hepattaki bir boya fırçasını nemlendirin, boya fırçasını embriyolara dokunun (hidrofobik vitelin zar kıllara yapışmalıdır) ve boya fırçasını saat camındaki heptana geri daldırın (embriyolar dibe batmalıdır).
      NOT: Embriyoların kurumasını önlemek için sonraki adımlar mümkün olduğunca çabuk gerçekleştirilmelidir. Embriyolar 20 saniyeden fazla havaya maruz bırakılmamalıdır.
5. Embriyoları bir Pasteur pipeti kullanarak mikroskop slaytına aktarın (Şekil 1D). Embriyoları yavaşça pipete çekin ve pipetin dar kısmıyla sınırlayın. Pipet embriyoları yavaşça slaytın üzerine dökülür, böylece kızağa akmadan önce pipetin ucunun hemen içinde toplanırlar. Bir mendil mendilinin köşesini ince bir uca çevirin ve heptanı slayttaki embriyolardan uzaklaştırın. Daha küçük bir alanı toplayacak ve kaplayacaklar, böylece bir sonraki adımda tutkal kaplı bir şeritte yakalanmalarını kolaylaştıracaklar.
6. Forsepsle, tutkal kaplı bir şerit alın ve embriyolara hafifçe dokunun (Şekil 1E). Şeridi görüntüleme kabına, embriyoyu yana doğru ve Poli-D-Lizin kaplı merkezin hemen dışına yerleştirin. Yerine sabitlendiğinden emin olmak için forseps kullanarak şeridi tabağa bastırın. Çanağı hemen 2–3,5 mL Ringer çözeltisi ile doldurun; kurumasını önlemek için embriyoları önce suya batırın (Şekil 1F).

4. Diseksiyon

NOT: Bu adımlar stereo-floresan mikroskop altında gerçekleştirilmelidir.

1. 10-15 embriyoyu devitellinize edin.
   NOT: Bu, yeni başlayanlar için iki embriyodan, uzmanlar için on beş embriyoya kadar değişebilir.
   1. Bağırsak morfolojisine göre Evre 16 embriyolarını seçin (Şekil 2). Bu aşamada, embriyolar dört yığılmış bağırsak segmenti oluşturan üç bağırsak daralmasına sahiptir (Şekil 2 B, B'). Devitelinizasyona başlamak için, seçilen embriyoyu bir uçta, tercihen ön tarafta, tungsten iğnesi ile delin. Embriyo vitelin zarından dışarı çıkabilir, ancak değilse, zarı embriyodan soyun.
      NOT: Diseksiyon için çok genç olan embriyolar bölgeselleşmemiş bağırsaklara sahiptir (Şekil 2C). Evre 17 embriyolarının diseksiyonu mümkündür, ancak Aşama 16 embriyolarının diseksiyonundan daha zordur, çünkü kütikül bu aşamada gelişmeye başlamaktadır. Erken Evre 17 embriyoları, birbirlerine göre kaydırılmış dört bağırsak segmenti ile birlikte bulunur (Şekil 2 D, D').
   2. İğneyi embriyo boyunca gonadlardan uzak bir bölgeye bağlayın. Kancalı embriyoyu çanağın Polilizin kaplı bölgesine aktarın (buradan itibaren basitçe "kapak kayması" olarak adlandırılır) ve yapışana kadar tabana doğru sürükleyin. Bu adımları tekrarlayın ve devitelinize embriyoları Polilizin kaplı kapak kaymasının üst kısmı boyunca üst üste yerleştirin (Şekil 3A), daha fazla diseksiyon için aşağıda bol miktarda alan bırakın.
      NOT: Gonadlar, kullanılan spesifik işaretleyiciye ve transgen kopya numarasına bağlı olarak parlak bir şekilde flüoresan olması gereken küçük küresel hücre agregaları olarak görünür. Bu aşamada, gonadlar lateral olarak A5 segmentinde, anteriordan embriyo uzunluğunun yaklaşık% 70-80'inde bulunur. Diseksiyon protokolü boyunca, doku iğneye yapışabilir. Enkazın iğnesinden kurtulmak için, Ringer çözeltisinin yüzeyinin hemen üzerine kaldırın. Devitellinizasyon, gonad uygun mümkün olduğunca az bozulduğu sürece düzensiz olabilir.
2. Gonadları embriyodan çıkarıp kabın üzerine yerleştirin (Şekil 3C,D).
   1. İlk olarak, embriyoyu içini açığa çıkarmak için törpülayın (Şekil 3C). Embriyoyu merkezinden dilimleyin, iğneyi arkadan, gonadlar arasında hareket ettirin. Bazı iç dokuları kızdırın, çünkü bu yemeğe dış kütikülden çok daha iyi yapışacaktır. Dokunun yapışkanlığı, bir sonraki manipülasyonların gonadı ortaya çıkarmasını ve kapak kaymasına yapışmasını sağlayacaktır.
      NOT: Doku çanağa yapışmıyorsa, kaplanmış kapak kaymasının kirlenmemiş bir bölgesine koaksiyel hale getirmeyi deneyin; kapak kaymasının dış bölgeleri özellikle yapışkan olacaktır. Adım 4.1.2'de belirtildiği gibi, diseksiyon manipülasyonlarının, gonadlar zarar görmediği sürece, parçalanmış bir embriyo karkası ile sonuçlanması önemli değildir.
   2. İğneyi, gonad da dahil olmak üzere bir doku parçası kalan karkastan ayrılana kadar bir gonadın etrafında dilimlemek için kullanın. İğne ile, bu dokuyu taze bir kaplanmış örtü kayması bölgesine çekin ve tabağa yapışana kadar tabana doğru koaksiyel hale getirin.
      NOT: En iyi görüntüleme, gonadın kendisinin üstteki doku yoluyla dolaylı olarak bağlanması yerine, doğrudan kapak kaymasına bağlandığı durumlarda elde edilecektir. Bu nedenle, doku karkastan uzağa yönlendirildikçe, gonadın yabancı doku yerine önce kapak kaymasına dokunmasını sağlayın.
   3. Yapışkan dokuyu iğne ile gonaddan nazikçe sürükleyerek gonaddan mümkün olduğunca fazla çevre dokusunu çıkarın (Şekil 3D). Gonada doğrudan dokunmaktan kaçının, bu da ona zarar verir (Şekil 4E). Gondanın çanağa yeterince yapışmasını sağlamak için, iğneyi gonadın etrafında yumuşak bir dairesel hareketle hareket ettirin - eğer hareket ederse, iğneyi kalan yapışkan dokuya dokunun ve gonadı taze bir yapışkan örtü kayması bölgesine yönlendirin. Gonadın tespit edilebilir bir hareketi kalmayana kadar bu işlemi tekrarlayın.
   4. Embriyo karkasına geri dönün ve ikinci gonadı diseke edin. Bu işlemi mümkün olduğunca çok sayıda embriyo üzerinde tekrarlayın, ancak 25 dakikayı geçmeyin. Doku canlılığı, ~ 40-45 dakikadan fazla bir süre sonra Ringer'ın çözeltisinde tehlikeye girecektir.
3. Diseksiyonlar tamamlandıktan sonra, diseksiyon sırasında yönünü kaydetmek üzere görüntüleme kabının dış kenarına kayıt işaretleri eklemek için silinmez bir işaretleyici kullanın.
4. Tutkal kaplı şeridi tabaktan çıkarın.
   1. Bir çift forsederin alt çatalını şeridin altına yavaşça yerleştirin, yapışmış gonadların bozulmasını en aza indirmek için Zil çözeltisinin mümkün olduğunca az dökülmesiyle çanaktan kurtarmak için şeridi yavaşça yukarı doğru eğin ve yavaşça yukarı doğru eğin.
      NOT: Şerit, disseke edilmiş gonadlardan uzağa eğilmelidir.
5. Çanağı, Ringer çözeltisinin dökülmesini önleyecek şekilde yavaşça görüntüleme mikroskobuna taşıyın.

5. Görüntüleme

1. Görüntüleme kabını, tabağı diseksiyon sırasında olduğu gibi yaklaşık yönde yerleştirmek için işaret işaretlerini kullanarak sahne tutucusuna yerleştirin. Parlak alan mikroskobu ve düşük güçlü (~ 10x) bir hedef kullanarak, kapak kaymasına yapışmış herhangi bir doku parçasını tanımlayın ve odaklayın. Floresanı ortaya çıkarmak için göz merceği ayarlarını değiştirin ve dürbün göz merceklerini kullanarak, görüntüleme yazılımı içindeki her bir gonadın konumunu işaretleyerek çanağı sistematik olarak tarayın (bkz.
   NOT: Konumları işaretlemeden önce gonadların görüş alanında ortalandığından emin olun.
2. Tüm sahne tutucu tertibatını, görüntüleme kabı tutucusunda olacak şekilde yavaşça çıkarın ve tertibatı çalışma tezgahına yerleştirin.
3. Ringer çözeltisini insülin içeren hazırlanmış görüntüleme ortamıyla değiştirin (bkz. adım 1.2 ve 3.1).
   1. Tüm Ringer solüsyonunu görüntüleme kabının iç üst çıkıntısından çıkarmak için bir P1000 kullanın (Ringer'ları merkezi kapak kayma bölgesinden pipet yapmayın). Ardından, bir P200'e geçin ve ucunu merkezi bölgede kalan Ringer'ın yüzeyinin hemen altına yerleştirin. 50-100 μL Ringer'ı dikkatlice çıkarın; çözümün tamamını ÇIKARMAYIN.
   2. ~200 μL görüntüleme ortamı hazırlayın ve P200 ucunu kalan Ringer'ın yüzeyinin hemen altına yerleştirerek yavaşça bu görüntüleme ortamını ekleyin. Ardından, kalan görüntüleme ortamını (~ 1.300 μL) üst çıkıntının en dış kenarından başlayarak çanağa ekleyin. Pipetleme sırasında, sıvının orta kubbesine doğru ilerleyin ve sonunda pipet ucunu her ikisinin de üzerinden fırçalayarak ikisini birleştirin. Kapağı tabağın üzerine yerleştirin.
      NOT: Görüntüleme ortamı, buharlaşmayı önlemek için çanağın tüm iç çapını yaklaşık 2 mm derinlikte kapsamalıdır (Şekil 4D).
4. Mikroskobu daha yüksek bir güç hedefine (63x, 1.2 NA) geçirin, kullanılan hedefe göre uygun daldırma sıvısını uygulayın (hedefin gerektirdiği daldırma sıvısı tipi ve kırılma indisi) ve ardından sahne tutucu tertibatını değiştirin. Görüntüleme kabının dibine yapıştırılmış dokuya odaklanmak için parlak alan mikroskobu kullanın.
   NOT: Aşama hareket ettirilmemişse, hedef odaklandıktan sonra son gonad görünmelidir.
5. İşaretli her gonad pozisyonunda adım adım ilerleyin ve bu pozisyonu gerektiği gibi ayarlayın. Görüntü netliğine, gonad cinsiyetine vb. bağlı olarak hangi gonadların görüntüleneceğini seçin. Görüntüleme ayarlarını özelleştirin (çok kanallı, pozlama süreleri, lazer yoğunlukları, Z serisi artışlar, uygun aralıklarla hızlandırılmış çekim vb.). Görüntülemeye başlayın.
   NOT: Erkek gonadlar, hem bir nişin hem de gonadın karşı ucunda, erkeğe özgü somatik gonadal öncüller (msSGP'ler) adı verilen küçük, oldukça dairesel somatik hücrelerden oluşan bir kümenin varlığı ile tanımlanabilir. Six4-eGFP::moesin floresan işaretleyici kullanılırsa, niş hücreler gonaddaki en parlak ikinci hücrelerdir, en parlak olanı msSGP'lerdir. Bu aşamada, dişi gonadların ne bir nişi ne de msSGP'leri vardır.

Sonuçlar

Görüntüleme kabının hazırlanışını Şekil 1'de, "Diseksiyon günü hazırlığı" nda açıklandığı gibi gösteriyoruz. Bu yöntemler nihayetinde, geçici olarak çanağın dibine sabitlenen ve Ringer'ın çözeltisine batırılmış bir kapak kayma şeridine yapıştırılmış iyi nemlendirilmiş embriyolarla sonuçlanmalıdır (Şekil 1F). Elmas uçlu bir bıçak, 22 x 22 mm'lik bir kapak kaymasını üç ila dört küçük şerit halinde temiz bi...

Tartışmalar

Gonadogenez sırasında, embriyonik gonad ve özellikle erkek gonad¹⁵ içindeki kök hücre nişi hızlı morfolojik değişikliklere uğrar. Bu dinamik değişikliklerin altında yatan gelişimsel mekanizmalar en iyi canlı görüntüleme teknikleriyle anlaşılır. Bununla birlikte, embriyonik Aşama 17'de, gonadın in vivo görüntülenmesi, büyük ölçekli kas kasılmalarının başlamasıyla imkansız hale getirilir¹⁷. Bu protokolle başarılı bir alternati...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alfa Aesar Tungsten wire	Fisher Scientific	AA10408G6	0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis)
D. melanogaster: His2Av::mRFP1	Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)	FBtp0056035	Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007
D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato	Gift from Ruth Lehmann Lab		Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3'
D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin		FBtp0083398	Sano et al., PLoS One, 2012
Diamond-tipped knife
Double-sided tape	Scotch	665
Fetal Bovine Serum	GIBCO	10082
Imaging dish	MatTek	P35GC-1.5-14-C
Imaging software	Molecular Devices		MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0
Insulin, bovine	Sigma	l0516	Store aliquots at 4 °C
Needle holder	Fisher Scientific	08-955
Nytex basket
Penicillin/streptomycin	Corning	30-002-Cl
Ringer's solution			2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved
Schneider's Insect Media	GIBCO	21720-024