Klonal Hematopoez Çalışması İçin Farelerde Kemik İliği Nakli İşlemleri

Özet

Kemik iliği naklinin (BMT) üç yöntemini tarif ediyoruz: toplam vücut ışınlamalı BMT, korumalı ışınlamalı BMT ve fare modellerinde klonal hematopoez çalışması için ön koşullandırması olmayan BMT yöntemi (benimseyen BMT).

Özet

Klonal hematopoez, hematopoetik kök ve progenitör hücrelerde (HSPC) somatik mutasyonların birikmesinden kaynaklanan yaygın bir yaşla ilişkili durumdur. Sürücü genlerindeki mutasyonlar, hücresel zindelik sağlayan, somatik mutasyonu barındıran progeny lökositlere giderek daha fazla yol açan genişleyen HSPC klonlarının gelişmesine yol açabilir. Klonal hematopoez kalp hastalığı, inme ve mortalite ile ilişkili olduğundan, bu süreçleri modelleyen deneysel sistemlerin geliştirilmesi, bu yeni risk faktörünün altında yer alan mekanizmaları anlamanın anahtarıdır. Toplam vücut ışınlama (TBI) gibi farelerde miyeloablatif koşullandırmayı içeren kemik iliği nakli prosedürleri, bağışıklık hücrelerinin kardiyovasküler hastalıklardaki rolünü incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, kemik iliği nişine ve kalp ve beyin gibi diğer ilgi alanlarına eşzamanlı hasar, bu prosedürlerle kaçınılmazdır. Bu nedenle laboratuvarımız TBI'ın neden olduğu olası yan etkileri en aza indirmek veya önlemek için iki alternatif yöntem geliştirmiştir: 1) ışınlama kalkanı ile kemik iliği nakli ve 2) koşulsuz farelere benimseyen BMT. Korumalı organlarda, lokal çevre korunarak klonal hematopoez analizine izin verirken, yerleşik bağışıklık hücrelerinin işlevi bozulmamıştır. Buna karşılık, koşullanmamış farelere benimseyen BMT, hem organların yerel ortamlarının hem de hematopoetik nişinin korunması ek avantaja sahiptir. Burada, üç farklı hematopoetik hücre rekonstrüt yaklaşımını karşılaştırıyoruz ve kardiyovasküler hastalıkta klonal hematopoez çalışmaları için güçlü yönlerini ve sınırlamalarını tartışıyoruz.

Giriş

Klonal hematopoez (CH), yaşlı bireylerde sıklıkla gözlenen ve genetik mutasyon taşıyan genişletilmiş hematopoetik kök ve progenitör hücre (HSPC) klonunun bir sonucu olarak ortaya çıkan bir durumdur^1. 50 yaşına kadar, çoğu bireyin her HSPC^2'deortalama beş eksonik mutasyon elde etmiş olacağı ileri sürülmektedir , ancak bu mutasyonların çoğu birey için çok az fenotipik sonuçlara neden olacaktır. Bununla birlikte, bu mutasyonlardan biri HSPC'ye rekabet avantajı sağlıyorsa (örneğin, çoğalmasını, kendini yenilemesini, hayatta kalmasını veya bunların bir kombinasyonunu teşvik ederek), bu mutant klonun diğer HSPC'lere göre terci....

Protokol

Hayvan konularını içeren tüm prosedürler Virginia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Ön koşuldan önce

1. Alıcı fareleri ışınlamadan önce antibiyotik takviyeli suya (5 mM sülfamethoxazole, 0.86 mM trimethoprim) ~24 saat yerleştirin. Bu, enfeksiyonu önlemek için gereklidir, çünkü bağışıklık sistemi ışınlamadan sonra baskılanacak ve ışınlamadan sonra 2 hafta boyunca korunacaktır. Bu noktada, beslenmeyi teşvik etmek ve ışınlamadan sonra kilo kaybını ve dehidratasyonu önlemek için fareleri bir beslenme / hidrasyon jeli ile destekleyin.

Sonuçlar

Üç BMT/pre-conditioning yönteminin donör hücre engraftmenti üzerindeki etkisini karşılaştırmak için, donör hücrelerin periferik kan ve kalp dokusundaki fraksiyonları BMT sonrası 1 aylık akış sitometrisi ile analiz edildi. İzole hücreler, lökositlerin farklı alt kümelerini tanımlamak için spesifik lökosit belirteçleri için lekelendi. Bu deneylerde WT B6'ya yabani tip(WT) C57BL/6 (CD45.2) donör kemik iliği hücreleri teslim edildi. SJL-Ptprc^a.......

Tartışmalar

Klonal hematopoez çalışmaları için üç BMT yöntemi tanımladık: total vücut ışınlamalı BMT, kısmi kalkanlı ışınlamalı BMT ve ön koşullandırma içermeyen daha az yaygın olarak kullanılan bir BMT yöntemi (benimsenen BMT). Bu yöntemler klonal hematopoezin kardiyovasküler hastalık üzerindeki etkisini değerlendirmek için kullanılmıştır. Araştırmacılar bu yöntemleri çalışmalarının özel amacına uyacak şekilde değiştirebilirler.

Klonal hematopoe.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5ml microcentrifuge	Fisher Scientific	05-408-121	general supply
1.5ml microcentrifuge	Fisher Scientific	05-408-129	general supply
1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE	EXELINT	26028	general supply
Absolute Ethanol (200 prfof)	Fisher chemical	200559	general supply
BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle	Becton Dickinson	309626	general supply
BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm)	Becton Dickinson	395195	general supply
Cesium-137 Irradiator	J. L. Shepherd	Mark IV	equipment
DietGel 76A	Clear H2O	70-01-5022	general supply
Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish	Life Sciences	353003	general supply
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	352098	general supply
Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm	Fisher Scientific	22363548	general supply
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11051-10	general supply
Hardened Fine Scissors	Fine Science Tools	14090-09	general supply
Isothesia (Isoflurane) solution	Henry Schein	29404	Solution
Ketamine	Zoetis	043-304	injection
Kimwipes Delicate Task Wipers	Kimtech Science	KCC34155	general supply
PBS pH7.4 (1X)	Gibco	10010023	Solution
RadDisk – Rodent Irradiator Disk	Braintree Scientific	IRD-P M	general supply
RPMI Medium 1640 (1X)	Gibco	11875-093	Medium
Sulfamethoxazole and Trimethoprim	TEVA	0703-9526-01	injection
Xylazine	Akorn	139-236	injection
X-ray irradiator	Rad source	RS-2000	equipment