3D Sferoid Modelinde Zaman Çözülen Floresan Görüntüleme ve Kanser Hücre İstilasının Analizi

Özet

Burada bir küresel görüntüleme cihazının üretimi için bir protokol sunulmaktadır. Bu cihaz kanser hücre sferoidlerinin dinamik veya boyuna floresan görüntülemesini sağlar. Protokol ayrıca kanser hücre invazyonunun analizi için basit bir görüntü işleme prosedürü sunmaktadır.

Özet

Birincil tümörden kanser hücrelerinin bitişik sağlıklı dokulara istilası metastazda erken bir adımdır. İnvaziv kanser hücreleri büyük bir klinik zorluk oluşturur, çünkü yayılmaları başladıktan sonra ortadan kaldırılması için etkili bir yöntem yoktur. Kanser hücre invazyonunu düzenleyen mekanizmaların daha iyi anlaşılması, yeni güçlü tedavilerin gelişmesine yol açabilir. Tümörlere fizyolojik benzerlikleri nedeniyle, kollajene gömülü sferoidler, kanser hücresi istilasını hücre dışı matrise (ECM) yöneten mekanizmaları incelemek için araştırmacılar tarafından yaygın olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu test (1) küresellerin ECM'ye gömülmesi üzerinde kontrol eksikliği ile sınırlıdır; (2) kollajen I ve cam alt yemeklerin yüksek maliyeti, (3) antikorların ve floresan boyaların verimsiz penetrasyonu ve (4) verilerin zaman alıcı görüntü işlemesi ve nicelemesi nedeniyle güvenilmez immünofluoresan etiketleme. Bu zorlukları ele almak için, üç boyutlu (3D) küresel protokolü, kollajen I'e gömülü floresan etiketli kanser hücrelerini zaman atlamalı videolar veya boyuna görüntüleme kullanarak görüntülemek ve kanser hücresi istilasını analiz etmek için optimize ettik. İlk olarak, sferoidleri güvenilir bir şekilde ve minimal bir kollajen I hacmine gömmek için bir küresel görüntüleme cihazının (SID) imalatını tarif ediyoruz ve test maliyetini azaltıyoruz. Daha sonra, canlı ve sabit küresellerin sağlam floresan etiketlemesi için adımları tanımlamaktadır. Son olarak, görüntü işleme ve veri nicelemesi için kullanımı kolay bir Fiji makrosu sunuyoruz. Tamamen, bu basit metodoloji kollajen I'de kanser hücresi invazyonunu izlemek için güvenilir ve uygun fiyatlı bir platform sağlar. Ayrıca, bu protokol kullanıcıların ihtiyaçlarına uyacak şekilde kolayca değiştirilebilir.

Giriş

Kanserin ilerlemesi sırasında, kanser hücreleri hareketli ve invaziv bir fenotip elde edebilir, tümör kütlesinden kaçmalarını ve çevre dokulara istila etmelerini sağlar¹. Sonunda, bu invaziv kanser hücreleri ikincil organların içine ulaşabilir ve büyüyebilir, kanser metastazı¹. Metastaz kansere bağlı ölümlerin% 90'ından fazla neden olur². Bunun bir nedeni, lokalize tümörler klinik olarak yönetilebilir olsa da, metastatik yayılma meydana geldikten sonra invaziv kanser hücrelerinin ortadan kaldırılması için etkili bir yöntem bulunmamasıdır. Bu nedenle, invaziv kanser hücrelerinin ortaya çıkması ve lokalize bir hastalıktan invaziv bir hastalığa geçiş büyük bir klinik zorluk oluşturmaktadır. Kanser hücrelerinin invaziv bir davranışı nasıl başlattığını ve sürdürdüğünü belirlemek, yeni güçlü tedavilerin gelişmesine neden olabilir.

3D küresel model, kontrollü, ancak fizyolojik olarak ilgili koşullar altında kanser hücrelerinin hareketli davranışlarını araştırmak için ideal bir platformdur³. Gerçekten de, bu testte, kanser hücrelerinin küreselleri hücre dışı matrisin (ECM), örneğin basitleştirilmiş bir tümörü taklit eden kollajen I'in içine gömülür. Daha sonra, görüntüleme, kanser hücrelerinin sferoidden kollajen matrisine invazyonunun görselleştirilmesi için kullanılır. Ancak, birden çok zorluk bu yordamı sınırlar.

İlk zorluk, sıvı kollajen matrisinin çanak yüzeyine yayılabileceği ve küreselin yemeğin dibine dokunmasına neden olan gömme adımında gerçekleşir. Sonuç olarak, küreselden gelen hücreler iki boyutlu (2D) yüzeye yayılır ve üç boyutlu (3D) küresel morfolojiyi kırır. Kollajen hacmini artırmak verimli, ancak maliyetli bir çözümdür. Hücrelerin 2D yüzeye yayılmasını önlemek için, minimum miktarda kollajen korurken, 1 mm kalınlığında, 3 delikli bir polidimetilsiloksan (PDMS) kesici ucu cam bir alt kabın üzerine bağlayarak bir küresel görüntüleme cihazı (SID) geliştirdik.

Küresel testin ikinci zorluğu, sferoid boyutu ile artan bir etki olan antikorların ve floresan boyaların zayıf penetrasyonu ile sınırlı olan sferoidlerdeki kanser hücrelerinin etiketlenilmesidir. Hücreleri etiketlemek için ideal çözüm, floresan proteinleri(leri) kasten ifade eden hücre hatlarının kurulması olsa da, bu seçenek çoğunlukla ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarıyla sınırlıdır ve floresan protein chimeras mevcudiyeti ile sınırlıdır. Burada, sabit sferoidlerin immünofluoresans boyanmasının yanı sıra, küreseli gömmeden hemen önce hücreleri etiketlemek için sitoplazmik bir boyanın verimli kullanımı için optimize edilmiş bir protokol açıklıyoruz.

Küresel testlerin üçüncü zorluğu, zaman içinde hücre istilasının yarı otomatik ölçülmesi için basit Fiji makrolarının olmamasıdır. Bu zorluğu ele almak için, zaman içinde küresel alanı analiz etmek için basit bir metodoloji açıklıyoruz. Örnek olarak 4T1 ve 67NR hücre çizgilerini kullanarak bu protokolün avantajlarını gösteriyoruz.

Protokol

1. Küresel gömmeyi optimize etmek için bir Küresel Görüntüleme Cihazının (SID) imalatı (Süre 1 gün)

1. Aralayıcıyı bir 3D yazıcı kullanarak oluşturun (Şekil 1A, B ve Tamamlayıcı Dosya 1).
2. Polidimetilsiloksan (PDMS) oluşturmak için plastik bir kapta 10:1 (wt/wt) taban polimer:çapraz bağlantı oranını [örneğin, 20 g etilbenzen baz polimer ve 2 g silikon reçine çaprazlayıcı] tartın.
3. PDMS çözeltisini tek kullanımlık pipet kullanarak plastik bardakta iyice karıştırın.
4. Hava kabarcıklarını karışımdan çıkarmak için plastik kabı bir vakum odasına yerleştirin. Karışımın yüzeyine sıkışan az miktarda havayı çıkarmak ve kalan hava kabarcıklarını dağıtmak için vakum basıncını hızla serbest bırakın.
5. Esnekliğini artırmak için 3D baskılı ara çubuğu 100 °C'de 5 dakika kuluçkaya yaslanın.
6. PDMS kalıbını inşa etmek için kullanılacak iki cam plakayı % 100 izopropanol ile silerek iyice temizleyin. Cam plakalar daha önce PDMS dökmek için kullanılmışsa, cam plakaları jiletle hafifçe kazıyarak ve% 100 izopropanol ile silerek kalan eski PDMS'leri çıkardığınızdan emin olun.
7. 3D baskılı ara çubuğu iki temiz cam plakanın arasına yerleştirerek kalıbı oluşturun.
8. Cam plakaların dış kenarlarında büyük bağlayıcı klipsler kullanarak kalıbı kapatın. Alt kenara iki cilt klipsi ve üst köşeye bir tane yerleştirin.
9. Ara parçanın cam plakalarla yıkandığından emin olmak için kalıbın üst kısmını inceleyin. Bu, herhangi bir deformasyon olmayacağını ve eşit bir PDMS sayfası oluşturulacağını garanti eder.
   NOT: Elde edilen levha düzgün kalınlıkta değilse, klipslerin hafifçe ayarlanması gerekir.
10. Tek kullanımlık pipet ucunu kesin (uçtan ~ 2 cm) ve PDMS karışımını kalıbın sol üst köşesine yavaş ve sabit bir hızda ekleyin. Büyük hava ceplerinin oluşturulmasını önlemek için karışımı yavaşça dökün.
11. Dökme sırasında oluşan hava kabarcıklarını çıkarmak için kalıbı bir vakum odasına yerleştirin.
12. Kalıbı 1 saat boyunca 100 °C'de kuluçkaya yatırarak PDMS'yi tedavi edin.
13. Kalıbı inkübatörden alın ve dokunmak için soğumasını bekleyin.
14. Cilt klipslerini ve cam plakaları kürlenmiş PDMS'yi içeren aralayıcıdan çıkarın.
15. Aralayıcı ve cam plaka arasındaki kalıbın dört tarafında oluşturulan contayı kesmek için bir jilet kullanın. Dört tarafı da kesilmişken, ara parçadaki PDMS levhasını ortaya çıkarmak için kalıbı ayırmaya başlayın.
16. Yeni PDMS sayfasını cımbız kullanarak aralayıcıdan dikkatlice soyun.
17. Bir kesme paspasında, tabakadan 17,5 mm çapında PDMS diskleri delme ve ardından farklı boyutlarda biyopsi zımbaları kullanarak eşit dağıtılmış üç adet 5,5 mm çapında delik açın. Burada bu 3 delikli PDMS diskleri "ekler" (Şekil 1C) olarak adlandırılır.
    NOT: PDMS'ye yapılan nonuniform kesimler veya plazma tedavisi yoluyla hatalı bir bağlama, gelecekteki sızıntılara neden olabilir.
18. Bant kullanarak toz parçacıklarını nazikçe çıkararak her kesici ucu temizleyin.
19. Kesici uçları çift taraflı bir bant parçasına yapıştırın ve bandı 10 cm'lik bir Petri kabının kapağına sarın.
20. Petri kabının kapağını, açık 35 mm cam alt tabaklarla birlikte plazma makinesine yerleştirin.
21. 300 mTorr'da 1 dakika plazma tedavisi ile kesici uçların ve camın yüzeyini etkinleştirin. Elde tutulan plazma değneği kullanılabilir.
22. Cımbız kullanarak, bir kesici ucun(Şekil 1D)ters tarafını, yani işlenmiş tarafını bir cam alt kabın cam kısmına(Şekil 1E)hızla takın. Tüm yemekler için tekrarlayın.
23. Cam alt kabı döndürürken eşit basınç uygulamak için işaretçi parmağınızı ve başparmağı kullanın. Bu, kesici ucun cam alt çanağa sabit bir şekilde sabitlenmesini sağlayacaktır.
24. Cam ve PDMS arasındaki yapışkanı güçlendirmek için SID'leri (Şekil 1F) 60 °C'de 20 dakika kuluçkaya yatırın.
25. 1.21. adımdakiyle aynı ayarları kullanarak veya elde tutulan değnekle SID'lerde ikinci bir plazma tedavisi gerçekleştirin. Bu, serbest PDMS yüzeyinin kaplama çözeltisinde poli-L lizine yapışmasını sağlayacaktır (bkz. 1.26).
26. Aşağıdaki çözümleri yeni hazırlayın.
    1. Kaplama çözeltisi: %0,01 (vol/vol) poli-L-Lizin içeren 1x PBS [örneğin, 1x PBS'nin 90 μL'sine %0,1 (vol/vol) poli-L-Lizin'in 10 μL'sini ekleyin].
    2. Çapraz bağlama çözeltisi: 1x (vol/vol) glutaraldehit içeren damıtılmış su [örneğin, 90 μL damıtılmış suya 10 μL 10x glutaraldehit ekleyin].
    3. Depolama çözümü: 10x (vol/vol) Penisilin-Streptomisin içeren 1x PBS [örneğin, 1x PBS'nin 9 mL'sine 100x Penisilin-Streptomisin 1 mL ekleyin].
27. Her delik başına 35 μL kaplama çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın.
28. Poli-L-Lizin'i epire edin ve tüm SID'yi damıtılmış suyla 3 kez durulayın.
29. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kuluçkaya yatırarak her delik başına 35 μL çapraz bağlama çözeltisi ekleyin.
30. Çapraz bağlama çözeltisini epire edin ve tüm SID'yi damıtılmış suyla 3 kez durulayın.
31. Her SID'ye %70 etanol ekleyin ve 30 dakika boyunca ultraviyole (UV) ışığın altına yerleştirin.
32. Kaputun altında etanol epire edin ve SID'yi damıtılmış suyla 3 kez durulayın.
33. Her SID başına 2,5 mL depolama çözümü ekleyin.
    NOT: Bu aşamada, SID'ler bir hafta boyunca 4 °C'de saklanabilir. PDMS ile cam arasındaki bağlama mukavemetinin zamanla azaldığı gözlendi. Bir haftadan sonra, kullanıcıların kullanımdan önce SID'leri olası sızıntılara karşı test etmeleri önerilir. Bunu yapmak için, depolama çözümünü epire edin ve her deliğe 35 μL 1x PBS ekleyin. Kullanımdan sonra, PDMS kesici uçları cam alt tabaklardan soyulabilir. Cam alt tabakların optimum temizliğini sağlamak için, PDMS kalıntılarını gidermek için izopropanol ve hidroklorik asit ile çeşitli yıkamalar kullanılmalıdır.

2. Küresel oluşum ve kollajene gömme (Süre 4 gün)

NOT: Sferoidlerin uzunlamasına veya hızlandırılmış videolarda canlı görüntülenmesi için sitoplazmik ve/veya nükleer floresan proteini ifade eden bir hücre hattı kullanın. Böyle bir hücre satırı varsa, bu bölümde açıklanan adımları izleyin. Alternatif olarak, bölüm 3'te, sitoplazmik bir boya kullanarak küresellerdeki kanser hücrelerini etiketlemek için bir protokol önerilmiştir.

1. 3.000 hücre/40 μL damlacık ve 3 günlük kuluçka süresi ile daha önce^{açıklandığı}gibi, asılı bırakma tekniğini kullanarak 4T1 ve/veya^67NRhücrelerinin küresellerini oluşturur. Sığır atelocollagen I çözeltisini en son ekleyin ve tüm çözeltileri her zaman buz üzerinde koruyun.
2. Parlak alan mikroskobu kullanarak doğru oluşturulmuş küreselleri tanımlayın.
3. 15 mL konik bir tüpü önceden ısıtılmış 8 mL komple ortamla doldurun.
4. Bir P1000 pipet ile küreselleri toplayın ve 15 mL konik tüpe aktarın. Pipet ucunun iç duvarlarına sferoidlerin yapışmasını önlemek ve küresel kaybı sınırlamak için pipet ucunu tam bir ortam içine ve dışına pipetleyerek ıslatın.
5. Küresellerin tüpün dibine batmasına izin verin ve ortamı değiştirerek küreselleri dikkatlice yıkayın. İki kez tekrarlayın.
6. Üreticinin önerilerine göre 5 mg/ mL kolajen I çözeltisi hazırlayın (alternatif jelasyon prosedürü, aşağıdaki örnek hesaplamaya bakın). Damıtılmış suyu tam orta ile değiştirin. Kullanılacak ortamın hacmini hesaplarken, küresellerin 20 μL tam ortamda ekleneceklerini dikkate alın [örneğin, bir SID için, 3 x 30 + (3 x 30) x % 20 = 108 μL 5 mg/ mL kollajen I gereklidir (viskoz sıvıları işlerken pipet kaybını hesaba katmak için% 20 ekstra hazırlayın); 22 μL komple orta + 10,8 μL 10x PBS + 1,2 μL 1 M NaOH + 54 μL 10 mg/mL kollajen I stok].
7. Tüm küreselleri bir P200 pipet kullanarak 20 μL orta miktarda toplayın ve 2.6 adımda hazırlanan kollajen I çözeltisine ekleyin.
8. Kollajen I konsantrasyonunda heterojenliği önlemek için çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleyerek yavaşça karıştırın, kabarcık oluşumunu sınırlayın. Çözeltiyi buzda tut.
9. Depolama çözümünü SID'lerden çıkarın ve 3 mL 1x PBS ile 3 kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, kollajen I çözeltisini seyreltmemek için SID'leri kuru bırakın.
10. Bir zamanlayıcı başlatın ve bir küresel içeren kollajen I çözeltisinin 30 μL'lik kısmını SID'nin üç deliğinden birine dağıtın. Görsel olarak 30 μL'de tek bir küreselin bulunduğundan emin olun.
11. Sid'in 3 deliğini doldurmak için 2.10.
12. PDMS sınırına yakın bir konumdaysa küreseli yeniden ortalamak için 10 μL pipet ucu kullanın. Deliklerden birinde iki veya üç sferoid dağıtılırsa, küreselleri birbirinden ayırmak için aynı pipet ucu kullanılabilir. Zamanlayıcıyı durdurun.
    NOT: Kollajen I polimerizasyonu ve katılaşma süresi boyunca SID'nin sık sık baş aşağı ve baş aşağı çevrilmesi, küreselin ECM tabakasının dikey merkezine yerleştirilmesini sağlar ve hücrelerin 2D olarak istilasını önler. Ters çevirme (çevirme) sıklığı en üst düzeye çıkarılmalıdır. Çevirme frekansı 2.10-2.12 olarak ölçülen küresel "dağıtım süresi" ile kontrol edildikçe, dağıtım süresi en aza indirilmelidir. Laboratuvarımızda dağıtım süresi ortalama 2 dakikadır.
13. Sferoidi kollajen tabakasında dikey olarak ortalamak için SID'yi ters çevirin ve dağıtım süresi için 37 °C'de kuluçkaya yaslayın.
14. SID'yi ters çevirin ve dağıtım süresi için 37 °C'de kuluçkaya yaslanın.
    NOT: Küresellerin baş aşağı yönelimde geçirdikleri süre, baş aşağı yönelimde harcanan zamana eşit olmalıdır.
15. Kollajen I polimerize olana kadar 30 dakika boyunca 2.13 ve 2.14 adımlarını tekrarlayın.
16. 2,5 mL tam orta/SID ekleyin ve gerekirse ilk zaman noktası için küresellerin bir görüntüsünü alın.
17. Birden çok SID kullanılıyorsa 2.10-2.16 arası adımları yineleyin.

3. Küresellerin floresan etiketlemesi

1. Canlı görüntüleme (Süre 6-7 gün)
   NOT: Sitoplazmik ve/veya nükleer floresan proteini ifade eden bir hücre hattı varsa, bölüm 2'de açıklanan adımları izleyin. Alternatif olarak, sitoplazmik etiketleme için aşağıdaki protokol önerilmiştir.
   1. Bölüm 2'de açıklanan protokolün 2.1-2.5 adımlarını izleyin.
   2. Sitoplazmik boyayı serumsuz ortamda 200 μL'de 25 μM'ye seyreltin.
      NOT: Bu deneyde kırmızı sitoplazmik boya kullanılırken, mevcut diğer renklerin uygun olması gerekir. Kanser hücreleri, serumsuz ortamın 200 μL'sinde 20 μM'ye seyreltilmiş nükleer boyalar kullanılarak küresellerin içinde etiketlenmiştir (bkz. Malzeme Tablosu).
   3. Son yıkamadan sonra, sitoplazmik veya nükleer boya çözeltisinde sferoidleri yeniden depolayın ve ışıktan korunarak oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatın.
      NOT: Bu yaklaşımla, küresel merkezdeki hücrelerin etiketlenmesi verimli olmayacaktır. Tüm hücrelerin etiketlenmesine ulaşmak için, tabağı bir rocker üzerine yerleştirerek kuluçka bir gecede uzatılabilir. Alternatifler Tartışma'da açıklanmıştır.
   4. Küreselleri tam ortamda 3 kez yıkayın.
   5. Bölüm 2'de açıklanan protokolün 2.6-2.17.
   6. Görüntü sferoidleri 24-72 saat boyunca her 10 dakikada bir zaman atlamalı görüntüleme yoluyla(Şekil 2) veya boylamsal görüntüleme yoluyla, günlük, 7 güne kadar(Şekil 3). Lazer tarama konfokal mikroskobu, 10x hava hedefi (0,4 sayısal diyafram ve 3,1 mm çalışma mesafesi), 1024 x 1024 piksel, pozlama süresi 8 μs/piksel, iğne deliği 90 μm, 6 x 15 μm z-adımlar ve her biri bir küreseloid içeren 3 görüş alanı kullanın.
      NOT: Hızlandırılmış görüntüleme için minimum lazer gücü kullanın ve mikroskobu sıcaklık, nem ve gaz kontrolü ile çevresel bir oda ile donatın. Mikroskop üzerindeki süreyi en aza indirmek için gömülü küreselleri görüntülemeden önce 37 °C'de > 8 saat veya gece boyunca kültüre edin.
2. Sferoidlerin immünofluoresans lekesi (Süre 2 gün)
   NOT: Burada açıklanan yordam, daha önce yayınlanan^8,9 protokollerinden uyarlanmış ve optimize^edilmiştir. Bu yöntem, bölüm 2 ve 3.1'de özetlenen protokolden sonra kullanılabilir.
   1. Aşağıdaki çözümleri yeni hazırlayın.
      1. Sabitleme çözümü: %4 PFA (vol/vol) içeren 1x PBS [örneğin, 1x PBS'nin 15 mL'sine %16 (vol/vol) PFA'nın 5 mL'sini ekleyin].
      2. Sabitleme ve permeabilizasyon çözümü: %4 PFA (vol/vol) ve %0,5 Triton X-100 (vol/vol) içeren 1x PBS [örneğin, 50 μL Triton X-100 ila 10 mL sabitleme çözümü ekleyin].
      3. Engelleme çözümü: %1 FBS (vol/vol) ve %1 BSA (wt/vol) içeren 1x PBS [örneğin, 10 mg BSA'yı 10 mL 1x PBS'de çözün, ardından 100 μL FBS ekleyin].
      4. Yıkama çözeltisi: %0,05 Ara 20 (vol/vol) içeren 1x PBS [örneğin, 1x PBS'nin 20 ila 50 mL arası 25 μL ekleyin].
   2. Kültür ortamını SID'lerden çıkarın ve ılık 1x PBS ile bir kez yıkayın.
   3. SID başına 2 mL sabitleme ve permeabilizasyon çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
   4. Sabitleme ve permeabilizasyon çözeltisini çıkarın ve SID başına 2 mL sabitleme çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın.
   5. Yıkama solüsyonu ile 3 kez yıkayın.
   6. SID başına 2 mL blokaj çözeltisi ekleyin ve hafif sallama ile 24 saat boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
      NOT: Bu adımda, numuneler hafta sonu boyunca 4 °C'de inkübe edilebilir. Daha uzun bir engelleme süresinin immünoresans etiketleme prosedürünü engelleyebileceğini lütfen unutmayın.
   7. Blokaj çözeltisinde birincil antikorları seyreltin.
   8. 48 kuyulu bir plakaya birincil antikorlar / kuyu ile 150 μL blokaj çözeltisi ekleyin.
   9. İnce cımbız kullanarak, bir küresel içeren kollajen fişini dikkatlice ayırın ve bir kuyuya aktarın. Birden çok küresel etiketlenmişse tekrarlayın. Kontaminasyonu önlemek için farklı antikorlarla çalışırken cımbızda kalabilecek sıvıları silin.
   10. Hafif titreme ile 4 °C'de gece boyunca kuluçkaya yatırın.
   11. Boş ve tam kuyulara 300 μL yıkama çözeltisi ekleyin.
   12. Bir küresel içeren kollajen fişini dikkatlice bir "yıkama" kuyusuna aktarın.
   13. 2 saat boyunca yıkama çözeltisi ile oda sıcaklığında ve hafif sallanarak 3 kez yıkayın.
       NOT: Bir küresel içeren kollajen fişlerinin aktarılması, çözümleri arzu etmek yerine, numune kaybını ve numune hasarını azaltmaya yardımcı olabilir.
   14. Sekonder antikorları seyreltin, blokaj çözeltisinde 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) ve/veya phalloidin.
   15. Kuyu başına ikincil antikorlar, DAPI ve/veya phalloidin ile 150 μL blokaj çözeltisi ekleyin.
   16. Cımbız kullanarak, küreselleri içeren kollajen fişini dikkatlice kuyuya aktarın. Birden çok küresel etiketlenmişse tekrarlayın.
   17. Hafif sallama ile oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın.
   18. 3.2.11 ve 3.2.12 adımlarını yineleyin.
   19. 30 dakika boyunca yıkama çözeltisi ile 3 kez, hafif sallama ile oda sıcaklığında yıkayın.
   20. Jilet kullanarak, her parçanın bir delik içermesi için 3 delikli bir PDMS kesici ucu üç parçaya bölün.
   21. Mikroskop slaydına iki parça PDMS yerleştirin.
   22. Ucu kesilmiş bir P200 ucu kullanarak bir damla montaj çözümü ekleyin. Kabarcık oluşumunu önleyin.
   23. Her deliğe taktığım bir kolajeni dikkatlice aktarın.
       NOT: Sferoid kollajen fişinin üstüne yerleştirilmişse, kollajen fişini ters çevirin, böylece sferoid cam kapak ucuna daha yakın olur.
   24. Üzerine bir kapak kılıfı yerleştirin ve bant kullanarak kapatın.
   25. Numunenin oda sıcaklığında 10 dakika kurumasına izin verin, ışıktan korunun.
   26. Numuneleri görüntülemeye kadar ışıktan korunarak 4 °C'de saklayın.

4. Zaman içinde kanser istilasını analiz etmek için görüntü işleme

NOT: Bu makro için gereken biçim, .tiff dosyası olarak kaydedilen tek kanallı x,y,t görüntüsüdür.

1. Birden çok z dilimi (x,y,z,t görüntü) edinilmişse, görüntüyü Fiji'de açın ve Görüntü | Yığınlar | Z Projesi. Maksimum Yoğunluk seçeneğini kullanmanız önerilir. Alternatif olarak, makroyu çalıştırmak için tek bir z dilimi kullanılabilir. Görüntüyü .tiff dosyası olarak kaydedin.
2. Masaüstünde ayrı bir "İşleme" klasörü oluşturun.
3. Dosya | Seç Farklı Kaydet | Görüntü Sırası. TIFF biçimini kullanın, kare sayısına göre basamak numarasını güncelleştirin, dilim etiketini dosya adı olarak kullanmak için kutuyu işaretleyin ve Tamam 'ıseçin. 2. adımda oluşturulan "İşleme" klasörünü seçin.
4. "İşleme" klasöründen bir resim açın. Tek bir zaman noktasına karşılık gelen bir x,y görüntüsü olmalıdır.
5. Görüntü | Seç | ayarlama Otomatik Eşik. Açılır menüde Tümünün dene yöntemini seçin ve siyah arka plandaki beyaz nesneler kutusunu işaretleyin.
6. Her otomatik eşikleme yönteminin sonucunu gösteren bir montaj görüntüsü görüntülenir.
7. En iyi otomatik eşik yöntemini tanımlayın, örneğin RenyIEntropy.
8. Otomatik eşikleme yönteminin seçimini onaylamak için, "İşleme" klasöründen başka bir görüntüyü açın ve Image | kullanarak seçilen eşik yöntemini sınayın | ayarlama Otomatik Eşik.
9. Tüm görüntüleri kapatın.
10. SpheroidAreaTime makrosunu indirin (Tamamlayıcı Dosya 2).
11. Sürükle ve bırak ile Fiji makrosunu açın.
12. Satır 58'de, otomatik eşikleme yöntemini gerektiği gibi güncelleştirin.
13. Satır 62'de, boyut aralığını hücre boyutlarına göre güncelleştirin.
14. Çalıştır 'ıseçin.
15. "İşleme" klasörünü seçin ve Üst klasör olarak "İşleme" yazın, sonra Tamam 'ıseçin.
16. Çalıştırma bittikten sonra "Özet" tablosunu kaydedin. İlk sütun görüntünün adını gösterir; üçüncü sütun küresel alanı gösterir; altıncı, yedinci ve sekiz sütun, küresel üzerine takılan bir elips için parametreleri belirtir.
17. "İşleme" klasörü artık her zaman noktası için _SpheroidArea uzantılı işlenmiş bir görüntü içeriyor.
    NOT: Küresel merkez soluksa, tüm zaman noktaları için seçim araçlarını kullanarak beyazla doldurun ve 3. Benzer şekilde, görüntüyü "temizlemek" için küreselin etrafındaki boşluk siyahla doldurulabilir. Görüntü temizse, çalıştırmayı hızlandırmak için satır 61'i yorumla.

Sonuçlar

Biyouyumluluğu nedeniyle PDMS, mikropatterning ve mikroakışkan cihazlarda devrim yapan hapsedici kuyuların, pulların ve kalıpların mikrofabrikasyonu için yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada açıklanan yöntemde, Sferoid gömme ve görüntüleme prosedürünü optimize eden SID'ler, özelleştirilebilir kuyular oluşturmak için kullanılır. Şekil 1, SID'lerin imalatında kullanılan ana bileşenleri göstermektedir. PDMS kalıbını dökmek için, 1 mm kalınlığında bir a...

Tartışmalar

3D baskılı aralayıcı, deneysel uygulamaların gerektirdiği şekilde, pdms'nin çeşitli şekillerini kolayca oluşturmak için kullanılabilecek 1 mm kalınlığında PDMS sayfaları oluşturmak için tasarlanmıştır. İmalatının basitliği ve tasarımı değiştirme özgürlüğü nedeniyle, SID'nin ilk tasarımı için bu PDMS döküm yöntemi seçildi. Yüksek hacimli SID'ler gerekiyorsa, zaten üç eşit aralıklı deliği olan PDMS diskleri içeren 3D baskılı bir kalıp oluşturularak ve işlem tek adıma...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 N NaOH	Honeywell Fluka	60-014-44
10X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	SH30028.LS
16% paraformaldehyde (PFA)	Alfa Aesar	43368-9M
1X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	20012027
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Invitrogen	D1306
48-well plate	Falcon	T1048
Alexa Fluor 647 phalloidin	Life Technologies	A20006
Anti cortactin antibody	Abcam	ab33333	1 to 200 dilution
Anti E-cadherin antibody	Invitrogen	13-1900	1 to 100 dilution
Bovine atelocollagen I solution (Nutragen)	Advanced Biomatrix	501050ML
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A4503-50G
CellTracker Red CMTPX Dye	Invitrogen	C34552
Conical tubes	Falcon	352095
Coverslips	FisherBrand	12-548-5E
Disposable container	Staples		Plastic cups
Disposable transfer pipette	Thermo Scientific	202
DMEM	Fisher Scientific	11965118
Double-faced tape	Scotch
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023-500ML
Fetal bovine serum (FBS)	Bio-Techne	S11550
Fluoromount-G	eBioscience	00-4958-02
Glutaraldehyde	Sigma Aldrich	G5882-100mL
Hoescht nuclear stain	Thermo Fischer	62249
Isopropanol	Thermo Fischer	S25371A
MatTek dish (glass bottom dish)	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Methyl cellulose	Sigma Aldrich	M6385-100G
MilliQ water
Penicilin/streptomycin solution	Thermo Fischer	15140122
Petri dish	Corning	353003
Pipet tips	Fisherbrand	02-707
Pipets	Gilson	F167300
Poly-L-Lysine	Sigma	P8920
Primary antibodies, user specific
Rat Tail Collagen I	Corning	47747-218
Razor Blade	Personna	74-0001
Secondary antibodies, user specific
Slides	Globe Scientific	1354W-72
Sylgard 184 Silicone	Dow Corning	4019862
Tape	Scotch
Triton X100	Sigma Aldrich	10789704001
Tween 20	Sigma Aldrich	655204-100ML