JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, zebra balığı embriyolarının parçalanmış kalplerinde PM2.5kaynaklı DNA hasarını tespit etmek için bir immünofluoresans testi kullanır.

Özet

Ortam ince partikül madde (PM2.5)maruziyeti kardiyak gelişimsel toksisiteye yol açabilir, ancak altta yatan moleküler mekanizmalar hala belirsizdir. 8-hidroksi-2'deoksijenaz (8-OHdG) oksidatif DNA hasarının bir belirtecidir ve φH2AX DNA çift iplikçik kırılmaları için hassas bir belirteçtir. Bu çalışmada zebra balığı embriyolarının kalbindeki PM2.5kaynaklı 8-OHdG ve φH2AX değişikliklerinin immünofluoresans tahlilini kullanarak tespit edilmesi amaçlanmıştır. Zebra balığı embriyoları,2 saat sonra döllenme (hpf) sırasında antioksidan N-asetil-L-sistein (NAC, 0.25 μM) varlığında veya yokluğunda PM 2.5'ten 5 μg/mL'de çıkarılabilir organik konularla (EOM) tedavi edildi. DMSO araç kontrolü olarak kullanıldı. 72 hpf'de kalpler şırınga iğnesi kullanılarak embriyolardan parçalandı ve sabitlendi ve permeabilize edildi. Bloke edildikten sonra, örnekler 8-OHdG ve φH2AX'a karşı primer antikorlarla araştırıldı. Numuneler daha sonra ikincil antikorlarla yıkandı ve inkübe edildi. Elde edilen görüntüler floresan mikroskopisi altında gözlemlendi ve ImageJ kullanılarak ölçülmedi. Sonuçlar, PM2.5'ten EOM'nin zebra balığı embriyolarının kalbinde 8-OHdG ve φH2AX sinyallerini önemli ölçüde artırdığını göstermektedir. Bununla birlikte, reaktif bir oksijen türü (ROS) çöpçü olarak hareket eden NAC, EOM kaynaklı DNA hasarına kısmen karşı koydu. Burada, zebra balığı embriyolarının kalplerindeki çevresel kimyasal kaynaklı protein ekspresyon değişikliklerinin tespitine uygulanabilecek PM2.5kaynaklı kalp kusurlarında DNA hasarının rolünü araştırmak için bir immünofluoresans protokolü sunuyoruz.

Giriş

Hava kirliliği artık dünyanın karşı karşıya olduğu ciddi bir çevre sorunudur. Hava kalitesinin en önemli göstergelerinden biri olan ortam ince partikül maddesi (PM2.5),çok sayıda zararlı madde taşıyabilir ve kan dolaşım sistemine girerek insan sağlığına ciddi zararlar verebilir1. Epidemiyoloji çalışmaları PM2.5 maruziyetinin doğumsal kalp kusurları (CHD)2,3riskinin artmasına yol açabileceğini göstermiştir. Hayvan deneylerinden elde edilen kanıtlar, PM2.5'in zebra balığı embriyolarında ve farelerin yavrularında anormal kardiyak gelişime neden olabileceğini göstermiştir, ancak PM2.5'in kardiyak gelişimsel toksisitesinin moleküler mekanizmaları hala büyük ölçüde bilinmemektedir4,5,6.

DNA hasarı hücre döngüsünün tutuklanmasına neden olabilir ve apoptoza neden olabilir, bu da progenitör hücrelerin potansiyelini büyük ölçüde yok edebilir ve sonuç olarak kalp gelişimini bozabilir7). PM2.5de dahil olmak üzere çevresel kirleticilerinoksidatifstres mekanizmaları 8,9aracılığıyla DNA'ya saldırma potansiyeline sahip olduğu iyi belgelenmiştir. Hem insan hem de zebra balığı kardiyak gelişimi oksidatif strese karşı hassastır10,11,12. 8-OHdG oksidatif bir DNA hasar belirtecidir ve φH2AX sinyali DNA çift iplikçik kırılmalarının bir işaretidir. Hücre içi sistein ve glutatyonun sentetik öncüsü olan N-asetil-L-sistein (NAC), yaygın olarak anti-oksidatif bileşik olarak kullanılmaktadır. Bu çalışmada, PM2.5'teoksidatif stresin rolünü araştırmak için NAC kullanıyoruz - indüklenmiş DNA hasarı13.

Zebra balığı bir model omurgalı olarak kardiyak gelişimi ve insan kardiyovasküler hastalıklarını incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır, çünkü kardiyak gelişim mekanizmaları omurgalılar arasında yüksek oranda korunmaktadır14,15. Zebra balıklarını model olarak kullanmanın avantajları arasında küçük boyutları, güçlü üreme yetenekleri ve düşük beslenme maliyeti bulunur. Bu çalışmaların özellikle ilgisini çeken zebra balığı embriyoları erken gelişim sırasında dolaşım sistemine bağlı değildir ve şiddetli kalp malformasyonunda hayatta kalabilir14. Ayrıca, saydamlıkları tüm vücudun doğrudan mikroskop altında gözlemlenmesine izin verir. Bu nedenle, zebra balığı embriyoları, çeşitli çevresel kimyasallara maruz kalmanın bir sonucu olarak kardiyak gelişimsel toksisitenin indüksiyonunda yer alan moleküler mekanizmaları değerlendirmek için olağanüstü bir fırsat sağlar5,16,17. Daha önce PM2.5kaynaklı oksidatif stresin DNA hasarına ve apoptoza yol açtığını ve zebra balıklarında kalp malformasyonlarına neden olduğunu bildirmiştik18. Bu çalışmada zebra balığı embriyolarının kalbinde pm2.5kaynaklı DNA hasarının araştırılması için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan yabani tip zebra balığı (AB), Çin'in Wuhan kentindeki Ulusal Zebra Balığı Kaynak Merkezi'nden elde edilmiştir. Burada özetlenen tüm hayvan prosedürleri Soochow Üniversitesi Etik Kurulu Hayvan Bakım Kurumu tarafından incelenmiş ve onaylanmıştır.

1. PM2.5 örnekleme ve organik bileşik ekstraksiyon

NOT: PM2.5, daha önce açıklandığı gibi 1-7 Ağustos 2015 tarihleri arasında Suzhou, Çin'de kentsel bir alandatoplanmıştı.

  1. Organik bileşenleri çıkarmak için 47 mm kuvars membran filtrelerini 500 °C'lik bir susturma fırınında 2 saat pişirin.
  2. 24 saat kesintisiz örnekleme için PM2.5 örnekleyiciye filtre yerleştirin.
  3. Filtreyi çıkarın ve oda sıcaklığında 24 saat kurutun.
  4. Filtreyi analitik bir terazi ile ölçün.
  5. Solvent olarak dikloromethane kullanarak Soxhlet ekstraksiyonu ile filtreden organik bileşenleri çıkarın19.
  6. EOM'yi 60 °C su banyosunda ve azot akışında döner buharlaşma ile kurutun. EOM'yi DMSO'da çözün ve -20 °C'de saklayın.

2. Zebra balığı embriyo toplama ve tedavi

  1. Zebra balığını 28,5 ± 0,5 °C'de, 14 saat açık ve 10 saat koyu fotoperiyod döngüsüne sahip yeniden dolaşımdaki bir su ürünleri sisteminde sakla.
  2. Sağlıklı yetişkin zebra balıklarını 2:1 erkek-dişi oranında bir tanka yerleştirin.
  3. Ertesi gün embriyoları toplayın ve sistem suyuyla (yani zebra balığı üreme suyu) yıkayın.
  4. Normal bir gelişme gösteren zebra balığı embriyolarını (tek tip boyut, tam tahıllar ve yumurta pıhtılaşması yok) 7 cm çapında (tabak başına yaklaşık 50 embriyo) tek tek cam Petri kaplarında 4 gruba ayırın ve rastgele bölün.
  5. EMBRIYOLARI 2 hpf'den72 hpf'ye kadar 0,25 μM'de NAC varlığında veya yokluğunda PM 2,5 (5 mg/L) ile tedavi edin. DMSO'yu %0,1 (v/v) nihai konsantrasyona araç kontrolü olarak kullanın.

3. Zebra balığı embriyolarının morfolojik gözlemi ve kardiyak diseksiyon

  1. 72 hpf'de embriyoları cam slaytlara aktarın ve stereo mikroskop altında gözlemleyin. Perikardiyal ödem, değiştirilmiş döngü ve küçülme boyutu gibi kalp malformasyonlarını kaydedin.
  2. Malformasyon oranlarını hesaplayın (toplam canlı embriyolardan kalp kusuru olan embriyoların yüzdesi) ve tek yönlü ANOVA kullanan gruplar arasındaki farklılıkları analiz etmek ve ardından Türkiye'nin Çoklu Karşılaştırma Testi (s < 0.05 = istatistiksel olarak anlamlı).
  3. Embriyoları cam slaytlarda hareketsiz hale getirmek için 0,6 mg/mL MS-222 ile uyuşturun.
  4. 30 s için kalp atışlarını kaydedin ve ImageJ yazılımı5,20kullanarak kalp atışlarını ölçün.
  5. Zebra balığı embriyolarındaki kalpleri stereo mikroskop altında tek kullanımlık şırınga iğnesiyle parçalara ayrıştırın. Dikkat: Kalp şeklini tahrip etmekten kaçının.

4. İmmünofluoresans Tahlil

  1. Zebra balığı embriyolarının kalbinde PM2.5 indüklenen DNA hasarını tespit etmek için bir immünofluoresans testi kullanmak için, temiz bir cam tarafına daire çizmek için hidrofobik bir bariyer kalemi kullanın.
  2. Fiksatif bir çözüm yapmak için 1,25 mL Fosfat Tamponlu Saline (PBS) 50 μL% 4 paraformaldehit ekleyin.
  3. 3 parçalanmış kalbi bir hidrofobik bariyer kalem dairesine yerleştirin ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatır.
  4. Çözeltiyi mikroskop altında kurutun ve numuneleri oda sıcaklığında en az 5 dakika kurutun, böylece kalpler cam slaytlara tamamen yapışır.
  5. Slaytları PBS'de üç kez% 0,1 Ara 20 (PBST) ile yıkama başına 5 dakika boyunca yıkayın.
  6. %5 BSA çözeltisi elde etmek için 1000 μL PBST'ye 50 μL sığır serum albümini (BSA) ekleyin ve spesifik olmayan antikor bağlamasını engellemek için slaytları nemli bir odada 1 saat kuluçkaya yatırın.
  7. Çözeltiyi dekante edin ve numuneleri PBST ile üç kez yıkama başına 5 dakika yıkayın.
  8. Çalışan bir birincil antikor kokteyl çözeltisi elde etmek için 296 μL PBST'de 8-OHdG'ye karşı 2 μL fare monoklonal antikorunu ve φH2AX'a karşı 2 μL tavşan poliklonal antikorunu seyreltin.
  9. Kalp örneklerini 8-OHdG ve φH2AX'a karşı birincil antikor kokteyl çözeltisinin 50 μL'si ile oda sıcaklığında veya gece boyunca 4 °C'de en az bir saat boyunca nemlendirici bir odada kuluçkaya bırakın (Gecelik inkübasyon sinyal yoğunluğunu artırabilir).
  10. Çözeltiyi dekante edin ve numuneleri PBST ile üç kez yıkama başına 5 dakika yıkayın.
  11. Çalışan ikincil antikor kokteyl çözeltisi elde etmek için 498 μL PBST'de 1 μL FITC etiketli keçi anti-fare ikincil antikor ve 1 μL cy3 keçi anti-tavşan ikincil antikor seyreltin ve örnekleri karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat boyunca ikincil antikorlarla (PBST'de 1:500) kuluçkaya bırakın.
  12. Çözeltiyi dekantlayın ve numuneleri pbs ile üç kez ışıktan korunan yıkama başına 5 dakika yıkayın.
  13. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca nükleer boyama için örneklere 20 μL DAPI (4',6-diamidino-2-fenilol) ekleyin.
  14. Kurumasını ve hareket etmesini önlemek için oje ile kaydırmak ve mühürlemek için bir kapak kılıfı uygulayın. Ardından örnekleri floresan mikroskop altında görüntüleyin ve ImageJ yazılımını kullanarak kalp bölgesinin floresan sinyalini ölçün. Göreli değişiklikleri DMSO denetim örneklerinin ortalamasıyla hesaplayın. Verilerin istatistiksel önemini adım 3.2'deki gibi belirleyin.

Sonuçlar

Bu immünoresans tahlili, çevresel kimyasallara maruz kalan zebra balığı embriyolarının kalplerindeki protein ekspresyon değişikliklerini ölçmek için hassas ve spesifik bir yöntemdir.

Bu temsili analizde, antioksidan NAC'nin yokluğunda veya varlığında PM2.5'e maruz kalan embriyolar kalp malformasyonlarının varlığı açısından değerlendirildi (Şekil 1). Gözlendiği...

Tartışmalar

Zebra balığı, embriyo kalbinin küçük boyutu nedeniyle çevresel kimyasalların kardiyak gelişimsel toksisitesini incelemek için mükemmel bir omurgalı modeli olmasına rağmen, batı leke analizi için yeterli protein elde etmek zordur. Bu nedenle, PM2.5'emaruz kalan zebra balığı embriyolarının kalplerindeki DNA hasarı biyobelirteçlerinin protein ekspresyon seviyelerini ölçmek için hassas bir immünofluoresans yöntemi sunuyoruz.

Diseksiyon sırasında kalbin büt...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe numarası: 81870239, 81741005, 81972999) ve Jiangsu Yükseköğretim Kurumlarının Öncelikli Akademik Program Geliştirilmesi tarafından desteklendi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
8-OHdG AntibodySanta Cruz Biotechnology, USAsc-66036Primary antibody
Analytical balanceSartorius,ChinaBSA124S
BSASolarbio,Beijing,ChinaSW3015For blocking
DAPIAbcam, USAab104139For nuclear counterstain.
DMSOSolarbio,Beijing,ChinaD8371
Fluorescence microscopeOlympus, JapanIX73For imaging fluorescence signals/
Goat Anti-Rabbit IgG Cy3Carlsbad,USACW0159Secondary antibody
Goat Anti-Rabbit IgG FITCCarlsbad,USARS0003Secondary antibody
N-Acetyl-L-cysteine(NAC)Adamas-Beta, Shanghai, China616-91-1
Orbital shakerQILINBEIER,ChinaTS-1
ParaformaldehydeSigma,ChinaP6148Make 4% paraformaldehyde for fixation.
Phosphate Buffered SalineHyClone,USASH30256.01Prepare 0.1% Tween in PBS for washing.
PM2.5 samplerTianHong,Wuhan, ChinaTH-150CFor 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling.
Re-circulating aquaculture systemHaiSheng,Shanghai,ChinaThe zebrafish was maintained in it.
Soxhlet extractorZhengQiao,Shanghai, ChinaBSXT-02For organic components extraction.
StereomicroscopeNikon,CanadaSMZ645For heart dissection from zebrafish embryos.
Tricaine methanesulfonate (MS222)Sigma,ChinaE10521To anesthetize zebrafish embryos
Tween 20Sigma,ChinaP1379
γH2AX AntibodyAbcam, USAab26350Primary antibody

Referanslar

  1. Zhang, B., et al. Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects. European Journal of Pediatrics. 175, 1520 (2016).
  2. Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan. The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).
  3. Mesquita, S. R., et al. Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain). Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).
  4. Zhang, H., et al. Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).
  5. Duan, J., et al. Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model. Chemosphere. 180, 24-32 (2017).
  6. Lorda-Diez, C. I., et al. Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis. Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).
  7. Kouassi, K. S., et al. Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d'Ivoire. Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).
  8. Gualtieri, M., et al. Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5. Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).
  9. Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes. Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).
  10. Yamashita, M. Apoptosis in zebrafish development. Comparative biochemistry and physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 136, 731-742 (2003).
  11. Moazzen, H., et al. N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes. Cardiovascular Diabetology. 13, 46 (2014).
  12. Sun, S. Y. N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond. Cancer Biology & Therapy. 9, 109-110 (2010).
  13. Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
  14. Asnani, A., Peterson, R. T. The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease. Disease Models & Mechanisms. 7, 763-767 (2014).
  15. Li, M., et al. Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish. Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).
  16. Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio). Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).
  17. Ren, F., et al. AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. The Science of the Total Environment. 719, 135097 (2020).
  18. van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. An emerging consensus on cardiac regeneration. Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).
  19. Yue, C., et al. Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways. Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).
  20. Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).
  21. Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
  22. Zhu, L., et al. DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio). Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli imsel BiyolojiSay 168mm nofluoresans PM2 5DNA hasarkalpembriyozebra bal

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır