Sıçanlarda Tekrarlanabilir Yoğun Bakım Ünitesi Odaklı Bir Endotoksin Modeli

Özet

Burada, sıçanlarda tekrarlanabilir bir yoğun bakım ünitesi odaklı endotoksin modeli sunuyoruz.

Özet

Sepsis ve septik şok, yoğun bakım ünitelerinde önde gelen ölüm nedeni olmaya devam etmektedir. Sepsis yönetiminde önemli iyileşmelere rağmen, mortalite hala %20-30 arasında değişmektedir. Sepsise bağlı çoklu organ yetmezliğini ve ölümünü azaltmak için yeni tedavi yaklaşımlarına acilen ihtiyaç vardır. Sağlam hayvan modelleri, bir veya daha fazla tedavi yaklaşımının yanı sıra fizyolojik ve moleküler parametreler üzerindeki etkilerini test etmeye izin verir. Bu yazıda basit bir hayvan modeli sunulmuştur.

İlk olarak, hayvanlarda uçucu madde kullanımı ile veya intraperitoneal anestezi ile genel anestezi indüklenir. İntravenöz kateter (kuyruk veni), trakeostomi yerleştirildikten ve intraarteriyel kateter (kuyruk arteri) yerleştirildikten sonra mekanik ventilasyona başlanır. Ortalama arteriyel kan basıncı, arteriyel kan oksijen doygunluğu ve kalp atış hızının temel değerleri kaydedilir.

Fosfat tamponlu salin içinde çözünmüş lipopolisakkaritlerin (1 miligram / kilogram vücut ağırlığı) enjeksiyonu, toll benzeri reseptör 4 aracılığıyla güçlü ve tekrarlanabilir bir enflamatuar yanıtı indükler. Sıvı düzeltmeleri ve norepinefrin uygulaması iyi kurulmuş protokollere dayanarak gerçekleştirilir.

Bu makalede sunulan hayvan modelinin öğrenilmesi kolaydır ve sedasyon, mekanik ventilasyon, sürekli kan basıncı monitörizasyonu ve tekrarlayan kan örneklemesi ile yoğun bakım ünitesinde klinik sepsis tedavisine yöneliktir. Ayrıca, model güvenilirdir ve hayvan araştırmalarının 3R (azaltma, değiştirme, rafine etme) ilkelerine uygun olarak sınırlı sayıda hayvanla tekrarlanabilir verilere izin verir. Sepsis araştırmalarındaki hayvan deneyleri kolayca değiştirilemezken, tekrarlayan ölçümler hayvanların azaltılmasına izin verir ve septik hayvanların anestezi altında tutulması acıyı azaltır.

Giriş

Sepsis ve daha şiddetli formu olan septik şok, bir enfeksiyonun zeminindeki sendromlardır, sitokinlerin salınımı ile aşırı inflamatuar reaksiyonla sonuçlanır, baskılanmış bir bağışıklık savunması ve ölümcül sonuçlarla fizyolojik ve biyokimyasal değişikliklere yol açar ^1,2. Bu dengesiz inflamatuar reaksiyon, akciğer, böbrek ve karaciğer gibi çeşitli hayati organlarda organ disfonksiyonu ve organ yetmezliği ile sonuçlanır. Sepsis, %³⁷³ ile bir hastanın yoğun bakım ünitesine (YBÜ) kabul edilmesinin en yaygın nedenlerinden biridir. Sepsisin mortalitesi günümüzde %20-30 civarında ^{değişmektedir4}. Erken ve etkili antibiyotik tedavisi son derece önemlidir⁵. Sıvı ve vazopressör resüsitasyonunun erken kurulması gerekir, bunun dışında tedavi tamamen destekleyicidir⁶.

Sepsis, organ disfonksiyonunun eşlik ettiği bakteri, mantar, virüs veya parazitlerle kanıtlanmış veya şüphelenilen bir enfeksiyon olarak tanımlanır. Septik şok kriterleri, tek başına sıvı tedavisine yanıt vermeyen başka bir kardiyovasküler kollaps olduğunda ve 2 milimol / litreden fazla laktat seviyesi mevcut olduğunda karşılanır². Sepsise bağlı organ yetmezliği herhangi bir organda ortaya çıkabilir, ancak kardiyovasküler sistemde, beyinde, böbrekte, karaciğerde ve akciğerde çok yaygındır. Sepsis hastalarının çoğu, hastanın hava yolunu güvence altına almak, aspirasyondan korumak ve hipoksiyi önlemek veya üstesinden gelmek için yüksek oranda ilham verici oksijen ile pozitif son ekspiratuar ventilasyon uygulamak için endotrakeal entübasyona ihtiyaç duyar. Bir trakea tüpünü ve mekanik ventilasyonu tolere etmek için, hastalar genellikle sedasyona ihtiyaç duyarlar.

Gram negatif bakterilerin zarının bir bileşeni olarak lipopolisakkaritler (LPS) gibi endotoksinler, toll benzeri reseptör (TLR) 4⁷ yoluyla güçlü bir enflamatuar reaksiyona neden olur. Tanımlanmış bir yolun aktivasyonu stabil bir inflamatuar reaksiyon sağlar. Sitokine bağlı nötrofil kemoattractant protein 1 (CINC-1), monosit kemoattractant protein 1 (MCP-1) ve interlökin 6 (IL-6) gibi sitokinler, bu model^8'de şiddet ve sonuç için prognostik faktörler olarak bilinir. İntravenöz LPS uygulaması, sıçanlarda sepsisin çeşitli yönlerini incelemek için başarıyla kullanılmıştır ^8,9.

Sepsisin tedavisi, özellikle öngörücü hayvan modellerinin eksikliği nedeniyle hala bir zorluktur. Sistemik inflamasyonun aktivasyonu ile endotokseminin farmakolojik tedavilerin geliştirilmesi için yeterli bir model olup olmadığı tartışmalıdır. Bununla birlikte, iyi bilinen LPS kaynaklı TLR 4 yolu ile önemli bilgiler edinilebilir.

Protokol

Bu protokolde sunulan tüm deneyler İsviçre'nin Zürih Kantonu Veterinerlik Otoriteleri tarafından onaylanmıştır (onay numaraları 134/2014 ve ZH088/19). Ayrıca, bu deneyde gerçekleştirilen tüm adımlar, İsviçre Tıp Bilimleri Akademisi (SAMS) tarafından Hayvanlarla Deneyler Kılavuzu ve Avrupa Laboratuvar Hayvanları Bilim Dernekleri Federasyonu (FELASA) Kılavuzlarına uygundur.

1. Anestezi indüksiyonu ve hayvan izleme

1. 250-300 gram (g) ağırlığındaki erkek Wistar sıçanlarını patojensiz koşullar altında havalandırılan kafeslerde tutun. 22 ± 1 °C ortam sıcaklığında 12-12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsü ve yiyecek ve suya serbest erişim sağlayın.
2. Genel anesteziyi, 30 saniye boyunca bir anestezi indüksiyon kutusunda izofluran (% 3-5 konsantrasyonu) ile uçucu indüksiyonla (Şekil 1A) veya alternatif olarak, tek atışlık ketamin / ksilazin (100 g vücut ağırlığı başına 10/1 miligram (mg) enjeksiyonu ile anesteziyi indükleyin.
3. Hayvanı bir çalışma yerine aktarın ve tüm deney boyunca hayvanı bir ısıtma paspasına koyun. Vücut ısısını 36,5 ila 37 °C arasında tutun.
4. Oksijen sağlamak için bir burun konisi kullanın (600 mL / dakika). Anestezi idamesi için uçucu anestezi seçilmişse %2-3 oranında izofluran ekleyin. Hayvanın kendiliğinden nefes aldığından emin olun.
5. Trakeostomi ve arteriyel ve venöz kateterlerin yerleştirilmesinden önce ayak parmağı sıkışma refleksinin yokluğu ile anestezi seviyesini doğrulayın.
6. Periferik oksijen doygunluğu izleme ile yeterli oksijenasyonu doğrulayın (normal oksijen doygunluğu% 98 - 100).
7. Gözleri korumak için bir merhem (A vitamini merhemi) kullanın.
8. Steril cerrahi aletleri ve kateterleri Şekil 1B'de gösterildiği gibi bir yan masada hazırlayın.
9. Ek olarak, basınç ve oksijen doygunluğu izlemeyi Şekil 1C'de gösterildiği gibi hazırlayın.

2. İntravenöz erişim

1. Venöz erişimi kolaylaştırmak için sıçanın proksimal kuyruğuna bir turnike uygulayın (Şekil 2A).
2. Kuyruğu alkolle 3 kez dezenfekte edin.
3. İki lateral kuyruk damarından birine bir G26 intravenöz kateteri indükleyin.
   NOT: Deneyimlerimize göre, intravenöz erişimi sıçanın kuyruğunun distal kısmına yerleştirmek daha kolaydır, çünkü buradaki damar cilde daha yakındır. Ek olarak, başarısız bir kanülasyon durumunda, yakından hareket etmek için yeterli alan vardır.
4. Hava enjeksiyonundan kesinlikle kaçının.
5. İntravenöz kateteri yerleştirdikten sonra turnikeyi çözün.
6. İntravenöz kateteri yapışkan bantla yerine sabitleyin (Şekil 2B).
7. Sürekli sıvı ve ilaç uygulaması için şırınga pompalarını intravenöz erişime bağlayın.
8. Bolus sıvısı, ilaç uygulaması ve venöz kan örneklemesi için 3 yönlü stopcocklar kullanın.

3. Trakeostomi

1. Hayvanın ön boyun bölgesini tıraş edin.
2. Tıraş edilen cildi providon-iyot çözeltisi ile 3 kez dezenfekte edin.
3. Bir neşter kullanarak yaklaşık 2 cm uzunlamasına bir kesi yapın (10 numaralı bir bıçakla).
4. Cildi 2-0 ipek dikişle geri çekin.
5. Gırtlak ve trakeayı cerrahi makasla açıkça hazırlayın (Şekil 3A).
6. Trakeayı 3-5^. trakea tokasında cerrahi mikro makasla açtığınızdan emin olun.
7. Trakeaya steril bir trakeal kanül yerleştirin. Dikkatli olun, tek taraflı havalandırmayı önlemek için kanülü çok derine sokmayın.
8. Kanülü 2-0 ipek dikiş kullanarak yerine sabitleyin.
9. Basınç veya hacim kontrollü ventilasyon için kanülü bir vantilatöre bağlayın (Şekil 3B).

4. Arteriyel erişim

1. Sıçan kuyruğunu povidon-iyot çözeltisi ile 3 kez dezenfekte edin.
2. Ventral tarafta yaklaşık 1 cm uzunlamasına bir neşter (10 numaralı bıçak ile) kullanarak cildi kesin.
3. Dikkatli olun, kuyruk arterinin yaralanmasını önlemek için çok derin kesmeyin.
4. Arteri dikkatlice ortaya çıkarmak için cerrahi bir mikroskop kullanın. Arteri çevreleyen fasyayı cerrahi mikro makasla kesin.
5. Arterin distal kısmını 6-0 ipek sütür kullanarak bağlayın.
6. Proksimal 6-0 ipek dikiş hazırlayın, ancak ipeği sıkmayın (Şekil 4A).
7. Distal ve proksimal ipek sütür arasındaki artere bir G-26 kateteri sokuldu.
8. Kateter artere girdikten sonra, proksimal ipek sütürü sıkın ve kateteri yerine sabitleyin (Şekil 4B).
9. Sürekli arteriyel basınç ölçümü (normal ortalama arteriyel basınç: 60 - 100 mmHg) sağlamak için kateteri bir basınç dönüştürücüsüne bağlayın (Şekil 4C).
10. Ek olarak, basınç dönüştürücüsüne bağlı kateter ile arteriyel kan örneklemesi için G-26 kateteri arasına 3 yönlü bir stopcock yerleştirin.

5. Temel ölçüm, sepsis indüksiyonu ve takip ölçümleri

1. Hayvan sabit bir duruma ulaştıktan sonra, LPS'yi enjekte edin.
2. Sabit bir duruma ulaşıldığında kan örnekleri toplayın (genellikle 15-30 dakika sonra).
3. Kan örneklerinden sıvı kaybını 1:4 oranında Ringer çözeltisi ile değiştirin.
4. Sepsisi indüklemek için, LPS'yi bir bolus veya sürekli bir LPS uygulaması olarak enjekte edin.
5. Bolus uygulaması için, 1 mg / mL'lik bir konsantrasyonda fosfat tamponlu salin (PBS) içinde çözünmüş 1 mg LPS / kilogram vücut ağırlığı (kg) enjekte edin.
6. Sürekli uygulama için, bir şırınga pompası kullanarak tüm deney boyunca 300 μg LPS / kg / saat enjekte edin (LPS'nin stok çözeltisi: PBS'de 1 mg / mL).
7. Hava embolisini önlemek için her zaman hava enjeksiyonundan kaçının.
8. Deneyi yapmadan önce sıvı replasman protokollerini, vazokonstriktör uygulama protokollerini ve kürtaj kriterlerini (örneğin, sıvı replasmanına rağmen 30 dakikadan fazla bir süre boyunca 50 mmHg'nin altındaki ortalama arteriyel kan basıncı olarak tanımlanan hipotansiyon) tanımlayın.
   NOT: Ringer çözeltisinin 10 mL / kg / saat hızında sürekli infüzyonunu öneriyoruz.
9. Sıvıların herhangi bir sürekli uygulamasını (örneğin, sürekli LPS uygulaması için) infüze edilen miktardan çıkarın, böylece sonuçlar kontrol gruplarınınkilerle karşılaştırılabilir.
   NOT: Deneyin sonunda ve karaciğer, böbrek veya dalak gibi herhangi bir organın toplanmasından önce, histolojik veya biyokimyasal inceleme gibi daha ileri analizler için hayvanlar, inferior kava damarının bir kesisi ile ötenazi yapılabilir. Önerilen ötenazi yöntemi, özellikle organlardaki enflamatuar belirteçler değerlendirilecekse, inferior vena kavanın kesilmesinden ve sol kalbe buz gibi soğuk salin enjeksiyonundan önce hayvanları cerrahi bir anestezi düzlemine getirmektir. Yasal gerekliliklere ve yerel yönergelere uyduğunuzdan emin olun. Sepsis ile ilişkili organ yetmezliğini doğrulamak için, böbreklerdeki tübüler hasarı doğrulamak için kaspaz-3 gibi pro-apoptoz belirteçleri ve α1-mikroglobulin analiz edilebilir. CINC-1, MCP-1 ve IL-6 gibi belirteçlerin organa özgü analizi de organa özgü inflamatuar yanıt hakkında bilgi sağlayabilir.

Sonuçlar

Sunulan sistem, daha önce bildirildiği gibi hemodinamik olarak stabil hayvanlarla endotoksemiye izin verir⁹. LPS stimülasyonu olan ve LPS stimülasyonu olmayan hayvanlarda ortalama arteriyel basınç sabit kalırken, LPS ile tedavi edilen hayvan, negatif baz fazlalığı ve CINC-1 (867 ng / mL), MCP-1 (5027 ng / mL) ve IL-6 (867 ng / mL)⁸ gibi plazma sitokinleri (uygulamadan 6 saat sonra) ile ölçülen güçlü bir enflamatuar reaksiyon gibi sepsis özellikleri gelişti...

Tartışmalar

Burada açıklanan protokol, araştırma sorusuna göre uyarlanabilen, yüksek oranda tekrarlanabilir, ancak öğrenmesi basit bir sepsis modeline izin verir. Kalp atış hızı, kan basıncı ve periferik arteriyel oksijen satürasyonu gibi organ fonksiyonlarına atıfta bulunan temel in vivo veriler sürekli olarak toplanabilir ve deney boyunca kan örneklemesi tekrar tekrar yapılabilir. Ek olarak, sıvı replasman protokolleri ve vazopressör desteği ile ilgili değişiklikler yapılabilir. Hayvanların hemodinamik ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-0 silk sutures	Ethicon, Sommerville, NJ	K833	Standard surgical
26 intravenous catheter	Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ	391349	Standard anesthesia equipment
6-0 LOOK black braided silk	Surgical Specalities Corporation, Wyomissing, PA	SP114	Standard surgical
Alaris Syringe Pump	Bencton Dickinson
Betadine	Mundipharma, Basel, Switzerland	7.68034E+12	GTIN-number
Curved fine tips microforceps	World precision instruments (WPI), Sarasota, FL	504513	Facilitates vascular preparation
Fine tips microforceps	World precision instruments (WPI), Sarasota, FL	501976	Tips need to be polished regularly
Infinity Delta XL Anesthesia monitoring	Draeger, Lübeck, Germany
Isoflurane, 250 mL bottles	Attane, Piramal, Mumbai, India	LDNI 22098	Standard vet. equipment
Ketamine (Ketalar)	Pfitzer, New York, NY
Lipopolysaccharide (LPS) from Escherichia coli, serotype 055:B5	Sigma, Buchs, Switzerland
Q-tips small	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	EH11.1	Standard surgical
Ringerfundin	Bbraun, Melsungen, Germany
Tec-3 Isofluorane Vaporizer	Ohmeda, GE-Healthcare, Chicago, IL	not available anymore	Standard vet. equipment
Xylazine (Xylazin Streuli)	Streuli AG, Uznach, Switzerland