JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, iplik embolizasyon yöntemiyle üstün sagittal sinüs (SSS) trombozunun Sprague-Dawley (SD) sıçan modeli romanı kurduk ve modelin stabilitesi ve güvenilirliği doğrulandı.

Özet

Serebral venöz sinüs trombozunun (CVST) doğal başlangıcına katkıda bulunan mekanizmalar çoğunlukla bilinmemektedir ve hastalığın seyrinde kontrol edilemeyen çeşitli faktörler söz konusudur ve bu da klinik araştırmalarda büyük sınırlamalara neden olur. Bu nedenle, çeşitli kontrol edilemeyen kafa karıştırıcı faktörleri standartlaştırabilecek istikrarlı CVST hayvan modellerinin kurulması, klinik araştırmalardaki eksikliklerin giderilmesine yardımcı oldu. Son yıllarda, çeşitli CVST hayvan modelleri inşa edilmiştir, ancak bu modellere dayanan sonuçlar tutarsız ve eksik olmuştur. Bu nedenle, CVST'nin patofizyolojik mekanizmalarını daha fazla araştırmak için, CVST'nin tanı ve tedavisi için önemli pratik değere ve bilimsel öneme sahip yeni ve son derece uyumlu bir hayvan modeli oluşturmak gerekir. Bu çalışmada, iplik embolizasyon yöntemi ile üstün sagittal sinüs (SSS) trombozunun Sprague-Dawley (SD) sıçan modeli adlı bir roman kurulmuş ve modelin stabilitesi ve güvenilirliği doğrulanmıştır. Ek olarak, CVST oluşumundan sonra sıçanlarda serebral venöz kan akışındaki değişiklikleri değerlendirdik. Toplu olarak, SD-rat SSS-tromboz modeli kolayca kurulan, travmayı en aza indiren, iyi stabilite sağlayan ve iskemik zamanlama ve konumu doğru bir şekilde kontrol etmeyi sağlayan yeni bir CVST hayvan modelini temsil eder.

Giriş

Serebral venöz sinüs trombozu (CVST), tüm inme nedenlerinin sadece% 0.5-1.0'ini oluşturan ancak çocuklarda ve genç yetişkinlerde nispeten yüksek bir oluşum oranına sahip olan serebral venöz sistemin nadir bir hastalığıdır1. Otopsi sırasında SEREBROVASKÜLER hastalık ölümlerinin %10'unun nedeni CVST bulunmuştur2. Tromboz intrakraniyal venöz sistemin herhangi bir bölümünde ortaya çıkabilir. Üstün sagittal sinüs (SSS), CVST'de en sık etkilenen bölgelerden biridir ve birden fazla kan damarını içerebilir. Venöz sinüslerin darlığı veya tıkanması nedeniyle, genellikle artan intrakraniyal basınç3ile birlikte intrakraniyal venöz geri dönüş engellenir. CVST'nin klinik bulguları karmaşıktır ve zamanla değişir; semptomların özgüllüğü eksikliği olmasına rağmen, en sık görülen semptomlar baş ağrısı (%77,2), nöbetler (%42,7) ve nörolojik eksiklikler (%39,9) arasındadır. Ciddi vakalarda koma ve hatta ölüm meydana gelebilir4,5. Son yıllarda, tıp ve sağlık standartlarının genel olarak iyileştirilmesi ve halk sağlığı farkındalığı nedeniyle, ilgili risk faktörlerinin oranı değişmiş, travma ve enfeksiyon oranı azalmış ve hamilelik, puerperium, oral kontraseptifler ve diğer nedenlerden kaynaklanan CVST oranı giderek artmıştır5.

Şu anda, CVST patogenez hala iyi anlaşılamamıştır. CVST'yi derinlemesine keşfetmek için daha fazla patofizyolojik araştırmaya ihtiyaç vardır. Bununla birlikte, bu araştırma yöntemlerinin çoğu invazivdir ve bu nedenle klinik olarak uygulanması zordur. Klinik araştırmaların birçok sınırlaması nedeniyle, hayvan modelleri temel ve çevirisel araştırmalar açısından yeri doldurulamaz avantajlara sahiptir.

CVST'nin nedeni karmaşıktır, çünkü ilk başlangıcı genellikle tanınmaz ve trombüs oluşumunun yeri oldukça değişkendir. Neyse ki, hayvan modelleri bu faktörlerin daha iyi kontrolünü sağlayabilir. Son birkaç on yılda, çeşitli CVST hayvan modelleri kuruldu ve her modelin kendi dezavantajları var. Farklı üretim yöntemlerine göre, kabaca aşağıdaki kategorilere ayrılabilirler: basit SSS-ligasyon modeli6,7; SSS dahili enjeksiyon hızlandırıcı modeli8; ferrik-klorür kaynaklı SSS tromboz modeli9; fotokimyasal kaynaklı SSS tromboz modeli10; ve kendi kendine yapılan emboli-tıkanıklık SSS model11. Bununla birlikte, bu modellerin çoğu hayvanın serebral korteksinde invaziv hasarı atlatamaz ve iskemik zamanı ve yeri doğru bir şekilde kontrol edemez. Bazı modellerde trombüs kendiliğinden yeniden canlanacaktır; diğer modellerde, SSS kalıcı olarak tıkanır. Ayrıca bu modellerde komplike operasyonlar ve/veya ciddi yaralanmalar sonraki patofizyolojik bulguları etkileyebilir.

Bu çalışmada, hasarı en aza indiren, hassas kontrol edilebilirliği sağlayan ve iyi stabilite sağlayan bir CVST modelini başarıyla oluşturmak için Sprague-Dawley (SD) sıçanlarının SSS'sine bir diş fişi yerleştirilmiştir. Ayrıca, modelin etkinliğini doğrulamak için küçük hayvan manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ve lazer benekli kan akışı görüntülemesi birleştirildi. Modelimizin kurulmasından önce ve sonra serebral kan akışındaki değişiklikleri değerlendirdik ve modelimizin stabilitesini değerlendirdik, CVST'nin oluşumunu, gelişimini ve ilgili patofizyolojik mekanizmalarını araştıran daha fazla çalışma için bir temel attık.

Protokol

Hayvan konularını içeren prosedürler Wenzhou Tıp Üniversitesi Tıbbi Normlar ve Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı ve bakımı ile ilgili Çin mevzuatına uygundur.

1. Diş fişinin, SD sıçanların ve deneysel ekipmanın hazırlanması

  1. Diş fişinin ana gövdesi olarak 0,28 mm çapında bir naylon iplik kullanın.
    NOT: Naylon ipliğin yumuşaklığı ve sertliği orta olmalıdır.
  2. Naylon ipliğin bir ucunu silikon malzeme ile örtün. Diş fişinin silikon kısmının uzunluğu yaklaşık 1,2 cm ve çapı yaklaşık 1,2 mm'dir. Baş ucu koniktir ve silikon kısmı silindiriktir. 5-7 cm daha ayır. Naylon ipliğin kelepçelenmesi kolaydır ve operasyondan sonra özel ihtiyaçlara göre kesilebilir.
  3. İplik fişini operasyondan önce 3 dakika bekletmek için% 75 etanol kullanın ve takmadan önce normal salin ile kalan etanolleri durulayın.
  4. 280 ila 320 g ağırlığında 12 erkek SD sıçan seçin ve rastgele bir sahte gruba ve deneysel gruba bölün (grup başına n = 6). Bir haftalık çevresel adaptasyondan sonra, sıçanları 12 saat boyunca oruçlayın ve operasyondan önce 4 saat boyunca susızlaştırın.
  5. Deney için gerekli olan aşağıdaki deneysel ekipmanı hazırlayın: küçük bir hayvan anestezi makinesi, beyin stereotaksik aleti, bir diseksiyon mikroskobu, yüksek hızlı kafatası matkabı, makas, cımbız, damar forsepsleri, iğne tutucu, iğne ipliği, 2 mL şırınga, lazer benekli kan akışı görüntüleme sistemi ve küçük hayvan MRI tarayıcısı.

2. Diş Embolizasyonu ile SD-Rat SSS-Embolizasyon Modelinin yapımı

  1. SD sıçanı anestezi indüksiyon kutusuna yerleştirin ve anesteziyi teşvik etmek için% 4 izofluran vermek için küçük bir hayvan anestezi makinesi kullanın. Bundan sonra, SD sıçanın arka uzuvlarının ve ayak parmaklarının orta derecede sıkışmaya yanıt vermediğini doğrulamak için tokmak kullanın.
  2. SD sıçanı, beyin stereotaksik cihazında eğilimli pozisyonda tıraş edilmiş üst saçlarla hızlı bir şekilde sabitleyin. %1,5-2,0 izofluran ile anesteziyi koruyun (0,5 L/dk hızında) ve solunum hızını 40-60 nefes/dak'ta stabilize edin. Sıçanın vücut sıcaklığını 37±0±2 ° C'de bir ısıtma yastığı ile stabilize edin.
    1. Anestezi sırasında korneaların kurumasını korumak için sıçan stereotaksik çerçeveye yerleştirildikten sonra steril oftalmik göz yağı uygulayın.
  3. Sıçanın başının üstündeki yüzeyi% 75 etanol ile üç kez değişen% 5 povidon iyot ile sterilize edin. Başın ortasında bir cilt kesisi (2,0 cm uzunluğunda) yapın ve ardından kafatasını tamamen ortaya çıkarmak için üst fasya ve periosteumu dikkatlice soyun.
    1. Ön fontanelle, posterior fontanelle, koronal dikiş, sagittal dikiş ve balıksırtı dikişinin pozisyonlarını onaylayın.
  4. Koronal dikiş ile herringbone dikişi arasındaki bölgeyi kan akışı gözlem alanı olarak kullanın. Lazer benekli kan akışı görüntüleme sırasında kafatasının gözlemi etkilemesini önlemek için, kan damarları açıkça görünene kadar kafatasını gözlem alanında inceltir. İncelen kafatasının büyüklüğü yaklaşık 1,0 cm × 1,0 cm olmalıdır. Bu adım ve aşağıdakiler diseksiyon mikroskobu altında gerçekleştirilir.
    1. Kafatası taşlama sırasında, serebral korteksteki yüksek sıcaklık yanıklarını önlemek için matkabı tekrar tekrar durulamak için normal sıcaklık salin kullanın.
  5. Bregma bölgesinin SSS'lerini ortaya çıkarmak için kafatasını bregma merkezli 6,0 mm x 4,0 mm kemik pencere içinde öğütmek için yüksek hızlı bir matkap kullanın.
    1. Taşlama sırasında kafatasını soğutmak için normal salin kullanın. Kafatası inceldiğinde, SSS'nin yırtılmasını önlemek için kalan kemik parçalarını dikkatlice çıkarmak için cımbız kullanın.
  6. Uygun bir diş fişi seçin, fiş noktası olarak SSS bregma noktasını kullanın, 2 mL şırınga iğnesi ile dikkatlice delin ve diş fiş kafasını hızlı bir şekilde fiş noktasına takın.
    1. Şu anda, diş fişi kafasının ucu ile SSS arasındaki açı yaklaşık 30-45 ° olmalıdır; ardından diş fişinin ucu ile SSS arasındaki açıyı 0-10 dereceye ayarlayın ve kafa sinüs confluence'ın arka kenarına ulaşana kadar SSS'yi yavaşça merkeze yerleştirin. Daha sonra kuyruğun fazla kısmını kesin.
      NOT: SSS delindiğinde hızlı kanama meydana gelebilir. Diş fişinin ucu bir kerede fiş noktasına hızlı bir şekilde takılamıyorsa, fiş noktasını dikkatlice göstermek için yavaşça aşağı kayarken fiş noktasına hafifçe basmak için küçük bir gazlı bez veya pamuk topu kullanın ve ardından tel cıvatanın ucunun ucunun SSS'ye hızlı bir şekilde yerleştirilmesini isteyin. Diş fişi takıldıktan sonra, fiş noktasında kanama varsa, kanamayı durdurmak için jelatin süngeri gibi hemostatik malzemeler kullanılabilir.

3. SD Sıçanların Beyin YüzeyindeKi Kan Akışının Tespiti

  1. Kan akışı gözlem alanını düzgün bir şekilde aydınlatmak için bir lazer ışık kaynağı kullanın. Yansıyan ışık bir kamera tarafından toplanır ve analiz için bir bilgisayara iletilir. Lazer benekli kan akışı görüntüleme sistemi için aşağıdaki parametre ayarlarını kullanın: dalga boyu: φ = 785 nm; ve görüntü pozlama süresi: T = 10 ms.
  2. SD-sıçan kan akışı gözlem alanını lazer benekli kan akışı görüntüleme sisteminin görüş alanına ortalayın ve beyin yüzeyindeki kan akışını 2 dakika boyunca sürekli olarak takip edin. Her SD sıçanı için embolizasyondan önce ve sonra kan akışı verilerini toplayın ve işleyin ve gözlemlenen bölgenin lazer benekli kan akışı haritasını elde edin.
  3. Kemik kalıntılarını ve kalıntılarını yıkamak için ameliyat edilen bölgeyi normal salinle tekrar tekrar durulayın. Cildi dikin (0# iplik) ve iodophor ile dezenfekte edin.
  4. Ameliyattan sonra sıçan uyanana kadar vücut sıcaklığını koruyun ve daha sonra yiyecek ve su sağlanan ad libitumile tek bir kafeste barındırın. Sham grubu takılamıyor.
  5. Veri toplama tamamlandıktan sonra, işlem sonrası gerçekleştirin.
    1. Lazer benekli kan akışı görüntüleme sistemi yazılımı tarafından sağlanan araçlarla ilgi çekici bölgenin (ROI) tam seçimi. Elde edilen değerler, yatırım getirislerindeki ortalama kan akışı değeri ve embolizasyon öncesi ve sonrası lokal serebral kan akışı değerleridir. Embolizasyondan önce kan akışı değerini temel değer olarak kullanın.
    2. Dört ROI seçin ve her yatırım getirisinde serebral kan akışındaki göreli değişimi ölçün, temel değerden yüzde değişimi olarak ifade edilir.

4. Küçük hayvanların MRI'ında iplik konumunun tespiti

  1. MRI görüntüleme sistemi için aşağıdaki T2 ağırlıklı görüntüleme (T2WI) parametrelerini kullanın: yankı süresi (TE) = 33 ms, tekrarlama süresi (TR) = 3000 ms, ekscitasyon sayısı (NEX) = 4, Dilimler = 28, dilim kalınlığı = 0,8 mm, matris boyutu = 256 * 256 mm2, çevirme açısı = 80°, görüş alanı (FOV) = 30 *30 mm2, tarama süresi = 6 dk 24 s; manyetik rezonans anjiyografi (MRA) parametreleri aşağıdaki gibi ayarlanmıştır: TE = 4.4 ms, TR = 12 ms, NEX = 4, dilimler = 80, dilim kalınlığı = 0,4 mm, matris boyutu = 256 * 256 mm2, çevirme açısı = 80 °, FOV = 30 * 30 mm2, tarama süresi = 16 dk 23 sn 40 ms.
  2. Hayvanı MRI tarama masasına sabitlayın, taramayı konumlandırarak beyin pozisyonunu kalibre edin ve pozisyonu onayladıktan sonra T2WI ve MRA sıralı tarama gerçekleştirin.
  3. Tespit sırasında hayvan anestezi makinesi üzerinden sürekli anestezi kullanın. Daha sonra, aşırı pentobarbital intraperitoneal enjeksiyon ile SD sıçanları ötenazi.
  4. Görüntü alma ve işlem sonrası: Görüntü verilerini topladıktan sonra, SSS'deki diş fişinin durumunu daha net gözlemlemek için, sıçan beyninin T2WI görüntüsünü görüntülemek için sahte renk geliştirme yöntemini kullanın.

Sonuçlar

Dikiş yöntemi ile SD-sıçan SSS-tromboz modelini kurmak için dikiş önceden hazırlanmalıdır (Şekil 1A) ve deney için gerekli ekipman (Şekil 1B) hazırlanmalıdır. Operasyonun hassas doğası nedeniyle, modelin hazırlanmasının bir diseksiyon mikroskobu altında tamamlanması gerekir. Ana adımlar Şekil 2'de gösterilmiştir. Modelin kan akışı gözleminin belirli ayrıntılarının açıklamasını kolaylaştırmak ...

Tartışmalar

Bu çalışmada, SD sıçanların SSS'sine kendi kendine yapılmış bir diş fişi takılarak yeni bir CVST modeli türü başarıyla oluşturulmuştur. Ayrıca, lazer benekli kan akışı görüntüleme ve küçük hayvan MRG'si, iskemik zamanlama ve konumu standartlaştırmak için embolizasyondan önce ve sonra SD sıçanlarının beyin yüzeyindeki kan akışındaki değişiklikleri izlemek için birleştirildi.

1989 yılında Longa ve arkadaşları, sıçanların dış karotis arterine k...

Açıklamalar

Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Fujian Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi (X2019002-talents) Üst Düzey Yetenekler için Grant Bilimsel Araştırma Vakfı tarafından desteklendi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
2 mL syringeBecton,Dickinson and Company301940
brain stereotaxic instrumentShenzhen RWD Life Technology Co., Ltd68025
dissecting microscopeWuhan SIM Opto-technology Co.SIM BFI-HR PRO
high-speed skull drillShenzhen RWD Life Technology Co., Ltd78046
laser-speckle blood-flow imaging systemWuhan SIM Opto-technology Co.SIM BFI-HR PRO
needle holderShenzhen RWD Life Technology Co., LtdF31022-12
needle threadShenzhen RWD Life Technology Co., LtdF33303-08
scissorsShenzhen RWD Life Technology Co., LtdS13029-14
silica gelHeraeus Kulzer302785
small animal anesthesia machineShenzhen RWD Life Technology Co., LtdR540
small-animal MRIBruker Medical GmbHBiospec 94/30 USR
tweezersShenzhen RWD Life Technology Co., LtdF11029-11
vascular forcepsShenzhen RWD Life Technology Co., LtdF22003-09

Referanslar

  1. Bousser, M. G., Ferro, J. M. Cerebral venous thrombosis: an update. Lancet Neurology. 6 (2), 162-170 (2007).
  2. Guenther, G., Arauz, A. Cerebral venous thrombosis: A diagnostic and treatment update. Neurologia. 26 (8), 488-498 (2011).
  3. Stam, J. Thrombosis of the cerebral veins and sinuses. New England Journal of Medicine. 352 (17), 1791-1798 (2005).
  4. Einhäupl, K., et al. EFNS guideline on the treatment of cerebral venous and sinus thrombosis in adult patients. European Journal of Neurology. 17 (10), 1229-1235 (2010).
  5. Coutinho, J. M., Zuurbier, S. M., Stam, J. Declining mortality in cerebral venous thrombosis: a systematic review. Stroke. 45 (5), 1338-1341 (2014).
  6. Gotoh, M., Ohmoto, T., Kuyama, H. Experimental study of venous circulatory disturbance by dural sinus occlusion. Acta Neurochir (Wien). 124 (2-4), 120-126 (1993).
  7. Miyamoto, K., Heimann, A., Kempski, O. Microcirculatory alterations in a mongolian gerbil sinus-vein thrombosis model. Journal of Clinical Neuroscience. 8 (4), (2001).
  8. Ungersböck, K., Heimann, A., Kempski, a. O. Cerebral Blood Flow Alterations in a Rat Model of Cerebral Sinus Thrombosis. Stroke. 24 (4), (1993).
  9. Röttger, C., et al. A new model of reversible sinus sagittalis superior thrombosis in the rat: magnetic resonance imaging changes. Neurosurgery. 57 (3), 573-580 (2005).
  10. Chen, C., et al. Photothrombosis combined with thrombin injection establishes a rat model of cerebral venous sinus thrombosis. Neuroscience. 306, 39-49 (2015).
  11. Yang, H., Meng, Z., Zhang, C., Zhang, P., Wang, Q. Establishing a new rat model of central venous sinus thrombosis and analyzing its pathophysiological and apoptotic changes. Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 130-135 (2012).
  12. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  13. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
  14. Wang, E., et al. Mapping tissue pH in an experimental model of acute stroke - Determination of graded regional tissue pH changes with non-invasive quantitative amide proton transfer MRI. Neuroimage. 191, (2019).
  15. Liu, C., et al. Identification of Vigilin as a Potential Ischemia Biomarker by Brain Slice-Based Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment. Analytical Chemistry. 91 (10), 6675-6681 (2019).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 173serebral ven z sin s trombozuhayvan modeliSprague Dawley s andi fi ist n sagittal sin slazer benekli kan ak g r nt lemekan akk k hayvanmanyetik rezonans g r nt leme

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır