JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu makalede, canlı, hastaya bağlı, preklinik bir model sisteminde tümör ilaç yanıtlarının değerlendirilmesi için hasta kaynaklı eksplantların üretimi, ilaç tedavisi ve analizi için yöntemler açıklanmaktadır.

Özet

İlaç direncinin anlaşılması ve yüksek dirençli kanserleri duyarlı hale getirmek için yeni stratejilerin geliştirilmesi, hasta yanıtlarını doğru bir şekilde tahmin edebilen uygun preklinik modellerin mevcudiyetine bağlıdır. Mevcut preklinik modellerin dezavantajlarından biri, insan tümör mikroçevrimini (TME) bağlamsal olarak koruyamaması ve intratümoral heterojenliği doğru bir şekilde temsil edememesi ve böylece verilerin klinik çevirisini sınırlamasıdır. Buna karşılık, insan tümörlerinin canlı parçalarının kültürünü temsil ederek, hasta kaynaklı eksplant (PDE) platformu, ilaç yanıtlarının orijinal tümörlerin patolojik ve mimari özelliklerini mümkün olduğunca yakından yansıtan üç boyutlu (3D) bir bağlamda incelenmesini sağlar. PDE'lerle yapılan önceki raporlar, platformun kemosentetifi chemore dirençli tümörlerden ayırt etme yeteneğini belgelemiş ve bu ayrımın aynı kemoterapilere verilen hasta yanıtlarını öngördüğü gösterilmiştir. Aynı zamanda, PDE'ler ilaç yanıtlarını tahmin eden tümörlerin moleküler, genetik ve histolojik özelliklerini sorgulama fırsatı verir, böylece hasta tabakalaşması için biyobelirteçlerin yanı sıra dirençli tümörleri duyarlı hale getirmek için yeni girişimsel yaklaşımlar tanımlanır. Bu makalede, hasta örneklerinin toplanmasından uç nokta analizine kadar PDE metodolojisi ayrıntılı olarak raporlandırilmektedir. Uygun olduğunda belirli tümörler için ısmarlama durumları vurgulayarak eksplant derivasyon ve kültür yöntemlerinin ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Uç nokta analizi için, hem tümöral hem de stromal bölgelerdeki anahtar biyobelirteçlerin mekansal profillerinin uzamsal profillemesi için çok katlı immünofluoresans ve multispektral görüntülemeye odaklanmaktadır. Bu yöntemleri birleştirerek, çeşitli klinikopatolojik parametrelerle ilişkili olabilecek ve böylece biyobelirteç tanımlaması için potansiyel olarak kullanılabilecek nicel ve nitel ilaç yanıt verileri üretmek mümkündür.

Giriş

Etkili ve güvenli antikanser ajanların geliştirilmesi, tahmine dayalı ve farmakodinamik biyobelirteçlerin tanımlanmasını kolaylaştırabilecek etki mekanizmaları hakkında da fikir verebilecek uygun preklinik modeller gerektirir. Inter- ve intratumor heterojenlik1,2,3,4,5 ve TME6,7,8,9,10,11,12'nin antikanser ilaç yanıtlarını etkilediği bilinmektedir ve hücre hatları, organoidler ve fare modelleri gibi mevcut birçok preklinik kanser modeli bu önemli özellikleri tam olarak karşılayamaz. Özellik. "İdeal" bir model, tümörlerdeki kötü huylu olmayan hücrelerle malignün karmaşık mekansal etkileşimlerini yeniden yakalayabilen ve tümörlerdeki bölgesel farklılıkları yansıtabilen modeldir. Bu makale, bu gereksinimlerin çoğunu yerine getirebilecek gelişmekte olan bir platform olarak PDE'lere odaklanır13.

Histokültür olarak da bilinen insan PDE'lerinin kullanımının ilk örneği, Hoffman ve arkadaşlarının yeni resected insan tümörlerinden oluşan dilimler oluşturduğu ve bunları kollajen matrisi14,15'tekültüre ettiği 1980'lerin sonlarına kadar uzanır. Bu, doku mimarisini koruyan, TME içindeki stromal bileşenlerin ve hücre etkileşimlerinin sürdürülmesini sağlayan bir 3D kültür sistemi kurmayı içeriyordu. Orijinal tümörün yapısızlaştırmadan, Hoffman ve ark.16 çevirisel araştırmanın yeni bir yaklaşımını müjdeledi ve bu zamandan beri, birçok grup doku bütünlüğünü korumak ve doğru ilaç yanıt verileri oluşturmak amacıyla farklı eksplant yöntemlerini optimize etti17 , 18,19,20,21,22,23,24 , protokoller arasındaki bazı farklılıklar belirgin olsa da. Butler ve ark. jelatin süngerlerindeki eksplantları,20 , 21,25örneği aracılığıyla besinlerin ve ilaçların yayılmasına yardımcı olmak için kültürlü, Majumder ve ark. ise aynı hastadan elde edilen otolog serumun varlığında tümör ve stromal proteinlerden oluşan bir matrisin üzerine eksplantlar oluşturarak bir tümör ekosistemi yarattı22, 23.

Daha yakın zamanda, grubumuz, tümörlerin 2 - 3 mm3boyutlu parçalara bölünerek eksplantların üretildiği ve daha sonra bir kültür sisteminin hava sıvısı arayüzünde geçirgen membranlara ek bileşenler olmadan yerleştirilen bir protokol kurdu24. Birlikte ele alındığında, bu çok sayıda çalışma, PDE'lerin orijinal tümörlerin mekansal mimarisini ve bölgesel heterojenliğini koruyan insan tümörlerinin sağlam, canlı parçalarının kültürüne izin verdiğini göstermiştir. Orijinal deneylerde eksplantlar veya histokültürler genellikle ilaç tedavisinden sonra homojenizasyona maruz kalmış, Bundan sonra histokültür ilaç yanıt tahlil 20,21 , MTT (3-(6)-2,5-difeniltetrazolium bromür) tahlil, laktat dehidrogenaz tahlil veya resazurin bazlı tahlil 26 ,27,28 gibi homojenize örneklere çeşitli canlılık tahlilleri uygulanmıştır. . Uç nokta analiz tekniklerinde, özellikle dijital patolojide son zamanlarda kaydedilen ilerleme, eksplantlar29,30üzerinde gerçekleştirilebilecek uç nokta testlerinin ve testlerinin repertuarını genişletti. Bu yeni teknolojileri uygulamak için, homojenizasyon yerine, eksplantlar formalin olarak sabitlenir, parafin (FFPE) içine gömülür ve daha sonra immünostaining teknikleri kullanılarak analiz edilir ve mekansal profilleme sağlar. Bu yaklaşımın örnekleri küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC), meme kanseri, kolorektal kanser ve mezotelioma eksplantları, çoğalma belirteci için immünohistokimyasal lekelenme, Ki67 ve apoptotik belirteç, fermuarlı poli-ADP riboz polimeraz (cPARP), hücre çoğalması ve hücre ölümündeki değişiklikleri izlemek için kullanılmıştır24,31,32,33,34.

Çoklayıcılı immünofluoresans, özellikle uç nokta35'tekieksplantlarda ilaç yanıtlarının mekansal profillenilmesi için elverişlidir. Örneğin, ilaç tedavisi 13 ,36,37,38ve terapötik bir ajanın "soğuk tümörden" "sıcak tümöre" geçişi destekleyip destekleyemeyeceği araştırılarak, makrofajlar veya T hücreleri gibi belirli bağışıklık hücreleri sınıflarının TME içinde relokalizasyonunu ve mekansal dağılımını ölçmek mümkündür39 . Son yıllarda, bu grup farklı tümör tiplerinden (NSCLC, renal kanser, meme kanseri, kolorektal kanser, melanom) PDE'lerin türetlenmesine ve kemoterapiler, küçük molekül inhibitörleri ve immün kontrol noktası inhibitörleri (ICI'ler) dahil olmak üzere bir dizi antikanser ajanın test edilmesine odaklanmıştır. Uç nokta analiz yöntemleri, canlılık için biyobelirteçlerin yanı sıra TME'nin farklı bileşenleri için biyobelirteçlerin mekansal profillemesine izin vermek için çok yönlü immünofluoresansı içerecek şekilde optimize edilmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Doku toplama

  1. Ameliyattan sonra, yeni resected insan tümörü örneklerini 25 mL taze kültür ortamı içeren bir tüpe aktarın (Dulbecco'nun modifiye Kartal ortamı 4.5 g/L glikoz ve L-glutamin + %1 (v/v) fetal baldır serumu + %1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiştir) ve buz üzerinde saklanır. Explant'ı steril sınıf II davlumbazda ameliyattan 2 saat içinde işleyin.

2. Explant hazırlığı

  1. Tüm cerrahi ekipmanları (greft bıçakları/diş balmumu yüzeyi/cımbız) %70 endüstriyel metillenmiş ruh (IMS) çözeltisi ile temizleyin.
  2. 10 cm'lik bir kültür yemeğini (Malzeme Masasınabakın) ~25 mL taze ortamla doldurun ve bir buz yatağının üzerine yerleştirin.
  3. Cımbız kullanarak, numuneyi bir diş cilası yüzeyine aktarın (Malzeme Tablosunabakın) ve iki deri greft bıçağı kullanarak dokuyu yaklaşık 2-3 mm3'lük parçalar halinde dilimleyin.
    NOT: En iyi performans için, 2-3 mm kalınlığında ayrı bir şerit elde etmek için dokuyu dilimlemeye başlayın ve ardından son eksplantları elde etmek için şeridi uzunluk boyunca kesin. Tüm numune doğranana kadar işlemi tekrarlayın.
  4. Eksplantları derhal 10 cm'lik tabaktaki buz gibi kültür ortamına aktarın. Eksplantların bir oranını (6-9 adet) alın, tamponlanmamış formalin çözeltisinin% 10'unu içeren 1 mL'lik bir tüpe yerleştirin ve 24 saat boyunca oda sıcaklığında (RT) bırakın.
    NOT: Bu parçalar "kültürsüz" koşulun denetim eksplantlarını temsil eder.
  5. 6 kuyulu plakaların istenen kuyu sayısını kuyu başına 1,5 mL taze ortamla doldurun ve her kuyuya bir organotipik kültür yerleştirme diski (Malzeme Tablosunabakın) yerleştirin, böylece ortamın üstünde yüzer ve ortam ekleme arabiriminde hava kabarcıklarından dikkatlice kaçının.
  6. Eksplantları rastgele seçin ve kesici uç diskin üzerine teker teker yerleştirin. "Kültürsüz" durumuyla tutarlı olmak için kuyu başına 6-9 eksplant kullanın. Multiwell plakasını 37 °C ve% 5 CO2'de bir CO2inkübatörüne yerleştirin ve eksplantların 16 saat boyunca iyileşmesine izin verin.
    NOT: Dokunun ezilmemesi için cımbızın nazik bir şekilde kullanılması şiddetle tavsiye edilir.

3. İlaç tedavisi

  1. 16 saat sonra, yeni 6 kuyu plakaları alın, her kuyuya 1,5 mL taze orta ekleyin, ilgili ilaçları istenen konsantrasyonlarda ekleyin ve araç kontrolü için bir kuyu ekleyin. Cımbızı kullanarak, eksplantları içeren her kesici ucu, ilaçları içeren yeni hazırlanmış 6 kuyulu plakalara taşıyın. Plakaları37 °C'de CO 2 inkübatörüne ve24-48 saat boyunca %5 CO 2'ye yerleştirin.
  2. Formalin'de daha önce sabitlenen kültürsüz eksplantları bir histoloji kasetine aktarın (aşağıdaki bölüm 4'e bakın) ve deneyin sonuna kadar% 70 IMS'de saklayın.

4. Histolojik işleme

  1. Doku fiksasyonu
    1. İlaç tedavisinden sonra, eksplantları içeren kesici uç diskleri% 10 formalin içeren yeni 6 kuyulu plakalara aktarın ve sabitleyici ile tam kapsama sağlamak için eksplantların üstüne birkaç damla% 10 formalin ekleyin.
      DİkKAT: Formalin tehlikelidir. Ciltle herhangi bir temastan kaçının ve solumayı önlemek için dumanlı bir yiyeceğin içine alın.
    2. Eksplantların %10 formalinde gece (20-24 saat) kalmasına izin verin.
    3. Ertesi gün, ilgili sayıda küçük histoloji süngerini% 70 IMS'ye batırın ve histoloji kasetlerinin içine yerleştirin. Belirli bir ilaç tedavi durumundaki tüm eksplantları tek bir süngere hafifçe aktarın (eksplantların uç disklerle temas eden taraflarının ve dolayısıyla ilaçla tedavi edilen alanların süngerle temas halinde yerleştirilmeleri için eksplantların yönünü koruyun). Eksplantların üzerine başka bir önceden soslanmış sünger yerleştirin ve bir histoloji kaseti içinde sabitleyin (kuyu / tedavi başına bir kaset).
    4. Kasetleri %70 IMS'ye batırın ve RT'de 24 saat bekletin.
  2. Parafin gömme ve doku kesitleme
    1. Ertesi gün, eksplantları içeren histoloji kasetlerini doku işlemcisinin örnek sepetine aktarın (Bkz. Malzeme Tablosu)ve kapağı sabitleyin. Sepeti retort içine yerleştirin ve yavaşça kapatın. İstediğiniz programı seçin ve işlemciyi başlatın. Retort'ı boşaltın, sepeti çıkarmak için açın ve sepeti gömme merkezi balmumu banyosuna aktarın.
    2. Gömdkten sonra, metal kaset kapaklarını sepete aktarın ve temizleme programı için doku işlemcisinin retortuna geri dönün. Sensörü kuru bir dokuyla silin, retort kapağındaki fazla balmumunu çıkarın ve temizleme programına devam edin.
    3. Döner mikrotomda bir parafin bloğu yerleştirin, 4 μm'de birkaç bölüm kesin ve bloğu buza geri döndürün. Bloğu yeniden konumlandırın ve daha fazla 4 μm kesit kesin. Kırışıklıkları ve kabarcıkları gidermek için bölümleri küçük bir boya fırçası ve tokalarla bir su banyosuna aktarın.
    4. Bölümleri mikroskop slaytlarına merkezi olarak yerleştirin, slaytları birkaç dakika boşaltın ve 37 °C'de bir inkübatörde bir gecede kuruması için bir slayt rafına yerleştirin. Bölümler kuru olduğunda, tozdan korunmak için bunları RT'de bir slayt klasöründe veya kutusunda saklayın.

5. Hematoksilin ve eozin (H&E) boyama

  1. Boyayı doldurun (Malzeme Tablosunabakın) reaktiflerle ve H&E boyama için gerekli programı ayarlayın: hematoksilin inkübasyon süresi: 5 dk; eozin kuluçka süresi: 3 dk.
  2. Slayt rafını taşıyıcıya takın, ksilenli ilk kaba yerleştirin ve programı başlatın. Slayt taşıyıcısını raftan çıkarın ve slayt rafı olan kabı montaj alanına götürün.
  3. Slaytları ekstraksiyon başlığının altına dibutil fitalat ksilen (DPX) ile monte edin. DPX'i her kapak altlıklarına yerleştirin ve kaydırağı bölüm aşağı doğru olacak şekilde kapak altlarına indirerek DPX'in yayılmasını sağlar.
    NOT: DPX tehlikelidir. Ciltle temastan kaçının ve belirlenmiş bir duman başlığında kullanın.

6. İmmünasyon

NOT: Aksi belirtilmedikçe aşağıdaki adımlar RT'de gerçekleştirilmelidir.

  1. Deparaffinizasyon ve rehidrasyon
    1. Slaytları bir slayt rafı içine yerleştirin ve xylene'deki bölümleri 3 dakika (2x) deparaffinize etmeden önce 10 dakika boyunca 65 °C'de ısıtın. Taşıma çözümü miktarını en aza indirin.
      NOT: Ksilen yanıcı, tehlikeli ve tahriş edicidir. Çift katmanlı eldiven kullanırken duman kaputunun içini kullanın. Cilt ve göz temasından kaçının. Atıkları kapalı bir kapta atın.
    2. Bir alkol gradyanındaki slaytları aşağıdaki gibi yeniden sula: 1 dakika (2x) için% 99 IMS ve 1 dakika boyunca% 95 IMS. Taşıma çözümü miktarını en aza indirin.
      NOT: IMS son derece yanıcı, uçucu ve tahriş edicidir. Duman kaputunun içini ele alın ve cilt ve göz temasından kaçının.
    3. Slayt rafını 5 dakika boyunca ultra saf (UP) suya tamamen batırın.
  2. Antijen alma
    1. Kullanılan antikor için üreticinin yönergelerine göre antijen alma tamponu hazırlayın.
      NOT: Sitrat tampon 0.2 M, pH 6 veya tris(hidroksimetil)aminomethane (Tris)-etilenediamin tetraasetik asit (EDTA) 0.1 M, pH 9, asidik veya alkali durumlar için kullanılan yaygın tamponlardır. Sitrik asit monohidrat ve Tris tahriş edici ajanlardır. Duman kaputunda tüm stok çözümlerini hazırlayın. Cilt ve gözlerle temastan kaçının.
    2. Slaytları içeren rafı antijen alma tamponuna ve mikrodalga fırına (Malzeme Tablosunabakın) 20 dakika boyunca tam güçte (800 W) batırın.
      NOT: Tüm işlem sırasında slaytları arabelleğe tamamen batırmış tutun. Tampon hacminin aşırı azalmasını önlemek için, kullanılan kabın üzerine bir kapak yerleştirin.
  3. Multipleks immünofluoresans (mIF)
    NOT: Bu işlem 1-2 gün sürer.
    1. Temiz bir kabı 250 mL UP su ile doldurun ve slayt rafını 2 dakika (2x) boyunca tamamen batırın. Her slaydı bir slayt kapak plakasına monte ederek devam edin (Bkz. Malzeme Tablosu).
      1. Bir slaytı bir kapak plakasına monte etmek için su ile bir cam oluk hazırlayın. Hem kapak plakasını batırın hem de doku bölümünün tarafını örtüye bakacak şekilde suya kaydırın.
      2. Slaydın alt kenarını, kapak plakasının altındaki çıkıntıların üzerine yerleştirin ve son olarak slaydı kapak plakasına hizalayın, böylece suyun aradaki boşluğu hava sıkışmadan doldurmasını sağlar. Kapak plakasını tutun ve birlikte kaydırın ve bir kapak rafına yerleştirin.
    2. Kapak plakasını fosfat tamponlu salin (PBS) ile doldurun ve tamponun yer çekimiyle (2x) dışarı akan slaytları yıkamasını bekleyin. Pipet 110 μL blokaj tamponu (Malzeme Tablosunabakın) her bir kapak plakasına ve 10 dakika kuluçkaya yatırın.
    3. İstenilen birincil antikor seyreltmesini PBS'de veya üreticinin önerilerine göre bloke tamponunda hazırlayın. Slaytları 30 dakika boyunca birincil antikorla (her slaytta 110 μL) kuluçkaya yatırın. Slaytları 6,3,2'de açıklandığı gibi 5 mL PBS (2x) ile yıkayın.
    4. Slaytları 30 dakika boyunca 110 μL yaban turpu peroksidaz polimer ile kuluçkaya bırakın. Slaytları 6,3,2'de açıklandığı gibi 5 mL PBS (2x) ile yıkayın.
    5. 1:100 (v/v) amplifikasyon seyreltmesinde florofor seyreltme hazırlayın ve slaytları 10 dakika boyunca floroforla (her slaytta 110 μL) kuluçkaya yatırın. Slaytları 6,3,2'de açıklandığı gibi 5 mL PBS (2x) ile yıkayın.
      NOT: Florofor 780'in kullanımı için üreticinin yönergelerine uyun. Slaytlar PBS'nin son yıkamasında inkübe edilirse ve bir gecede 4 °C'de saklanırsa deney burada duraklatılabilir.
    6. Kapak plakalarından slaytları kapatın ve lekelenmeye farklı bir antikorla başlamak için antijen alma adımına geri dönün. Test edilecek istenen antikor sayısı için lekeyi tekrarlayın.
    7. Kullanımdaki son florofor için 6.3.5 adımını izleyerek, slaytları kapak plakalarında tutun, UP suyuyla seyreltin 4'-6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) 6 μM çözelti hazırlayın ve slaytları 5 dakika boyunca (her slaytta 110 μL) karşı tutun. Slaytları UP suyuyla (2x) yıkayın ve slaytların kenarlarını kurutarak fazla suyu çıkarın. Kapakları montaj ortamını kullanarak slaytlara monte edin ve karanlıkta RT'de saklayın.

7. Tarama

NOT: Slayt taraması multispektral otomatik görüntüleme sistemi kullanılarak gerçekleştirilmiştir (Bkz. Malzeme Tablosu).

  1. Slaytları taşıyıcıya monte edin ve istediğiniz sırayla tarayıcıya yükleyin.
    NOT: İmmünohistokimyasal boyama sırasında florofor veya DAPI kullanılmayan bir kontrol kaydırağı dahil edilmesi önerilir. Bu slayt, dokunun iç florescence (otofluoresans (AF)) kontrolü olarak kullanılacaktır.
  2. Slayt tarayıcı yazılımını başlattıktan sonra, Giriş sayfasından Protokolü Düzenle'yi seçin. Adı, görüntüleme modunu, gerçekleştirilecek multispektral tarama türünü (4-7 kanal)ve çalışmayı (dizin)ele alan yeni bir protokol oluşturun.
    NOT: Analiz edilen bantların varsayılan ayarlarını değiştirmek için Bantları Tara seç işlevini kullanarak istediğiniz filtreleri seçin/seçimini kaldırın
  3. TaramaYa Maruz Kalma ve Yük taşıyıcısıile devam edin ve son olarak protokol kurulumu için taşıyıcıyı seçin. Slayttaki dokuyu algılamak için Genel Bakışı Al'ı seçin. Taşıyıcıdagörüntülenen bir slayt seçin ve ekranın sol penceresinde canlı görüntüye getirmek için kırmızı imleçli dokunun belirli bir alanını seçin.
  4. DAPI filtresiniseçin ve Otomatik Netleme'yi tıklatın veya ilgi alanını odaklamak için Sahne Alanı Yüksekliği kaydırıcısını el ile ayarlayın. Sistemin bu filtre/bant için en iyi pozlamayı bulmasını sağlamak için Otomatik Açıkla'ya tıklayın.
    NOT: Her filtre için pozlama süresi 12 ms olarak ayarlanır. Sistemi otomatik olarak pozlamadan sonra, pozlama süresini daha iyi bir tahmine göre daraltın. Vurgulanan hücreye el ile bir değer yazarak otomatik pozlama değerini geçersiz kılmak da mümkündür.
  5. Protokoldeki tüm filtreler için yukarıdaki adımları yineleyin. Gerekirse, pozlamaları ayarlamak için en iyi sinyalleri bulmak için konumları ve/veya slaytları değiştirin.
    NOT: Canlı görüntüde doku kırmızı ile vurgulanırsa, analiz edilen filtrenin floresan sinyali doygunluğa sahiptir ve otomatik pozlama tekrarlanmalıdır.
  6. Pozlama ayarları oluşturulduktan sonra Geri düğmesine tıklayın ve Protokolü kaydet' i tıklatın. Yazılım giriş sayfasından (Bkz. Malzeme Tablosu), Slaytları Tara 'yıseçin.
  7. Taranacak tüm taşıyıcıları Slide Carrier Hotel'e yığın ve kimliklerini sisteme atamak için slaytların sırasını not alın.
    NOT: Yazılım ekranında, her taşıyıcı 4 slayt içeren bir yuva ile ilişkili olacaktır.
  8. Aynı parametrelere sahip birden çok slayt yapılandırmak için Görevleri Yapılandır'ı tıklatın ve aynıslaytlar için aynı kuralları SingU seçeneğine sahip bir veya daha fazla Yuva seçin. Slaytları Düzenle açıldıktan sonra, yapılandırın: Görevler, Çalışmave protokolve Tamam'ı tıklatın.
  9. Yuva simgesini tıklatarak her slaydı etiketleyin ve Slayt Kimliği hücresine bir ad yazın. Taramaya başlamak için Tara'yı tıklatın.
    NOT: Yuva simgesi maviye döndüğünde ve slaytlar mavi bir okla işaretlendikten sonra, taşıyıcı tüm kurallara sahiptir ve taranmaya hazırdır. Slayt kimliklerini, etütleri, protokolleri ve görevleri Kurulumu Kaydet düğmesine tıklayarak kaydetmek mümkündür.

8. Analiz

NOT: Aşağıdaki protokol fenotip analizi yöntemini göstermektedir.

  1. Görüntü hazırlama
    1. Görüntüleri analize hazırlamak için görüntüleyici yazılımını açın (Malzeme Tablosunabakın) ve Slaytları yükle 'yiseçin. Ekranın sağ tarafındaki eğitim projesi için istediğiniz taramaları seçin.
    2. Her tarama için Damga 'yıtıklatın ve Seç kutusunda Proje'yi seçin: Daha sonra eğitim analizi için şablon olarak kullanılacak görüntü alanında 1 x 1 boyutunda bir damga tanımlayın. Bu damganın kırmızı kare olarak işaretlenmiş olacağını gözlemleyin.
      NOT: Proje için damga ek açıklamalarının sayısı rasgeledir. İç floresan taraması için bir tane ve genellikle doku içindeki sinyal dağılımını temsil eden birkaç tane daha oluşturulması önerilir.
    3. Son olarak, deneyin tüm taramalarını açın. Her biri için Damga 'yıtıklatın ve bu kez, Seç: Her eksplantı çevreleyen bir damga yerleştir kutusunda Toplu İş seçeneğini belirleyin.
      NOT: Bu kez, pullar yeşil kareler olarak işaretlenecek ve toplu analiz başlatıldıktan sonra gerekli olacaktır. Damgalar için uygun boyutu seçin (1 x 1, 2 x 2, 3 x 3) ve dışa aktarılan dosyada yinelenen veriler oluşturacak pulların çakışmasını önleyin.
  2. Eğitim analizi
  3. Analiz için yazılımı başlatın (Malzeme Tablosunabakın) ve yeni bir proje oluşturun: Dosya | Yeni | Proje.
  4. Proje Adı kutusuna bir ad yazın ve proje türünü yapılandırın.
    NOT: Deneyler aşağıdaki özellikler kullanılarak gerçekleştirildi: eğitilebilir doku segmentasyonu; uyarlanabilir hücre segmentasyonu; fenotipleme.
  5. Eğitim için pulları içeren taramaları yükleyin: Dosya | | Aç Resim. Tek modlu görünümde,görüntülerde gezinin ve iç floresan içeren taramaları seçin.
  6. Autofluorescence (AF) düğmesine tıklayın ve Autofluorescence seçiciile dokunun yersiz bir kısmını çizin. Yazılımın eğitim için yüklenen tüm görüntülerden iç floresan yoğunluğunu çıkarmasını sağlamak için Görüntüleri hazırla'ya tıklayın.
  7. İşaretçileri ve Renkleri Düzenle düğmesine tıklayın ve floroforlarıyla ilişkili kutuya işaret adlarını girin. Doku Segmentasyon Eğitimi penceresini açmak için ekranın üstündeki Segment Dokusu adımına tıklayın.
  8. Doku Kategorileri penceresinde, görüntüleri (örneğin, Tümör, Stroma, Arka Plan, Nekroz)bölümlere ayıracak doku kategorilerinin adını yazın.
  9. Doku Segmentasyon Eğitimi penceresinde, Çiz düğmesine tıklayın ve ilgi çekici bir doku kategorisi tanımlamak için hücre gruplarının etrafına bölgeler çizin. Örneğin, bir Tümör alanı tanımlamak için, bir grup tümör hücresinin etrafına bir bölge çizin. Bir sonraki kategoriye geçin ve çizim işlemini tekrarlayın.
    NOT: Eğitim için yüklenen görüntülerin çoğunda bölge çizmeniz önerilir. Ayrıca, ayrıntıları kullanım kılavuzunda daha iyi açıklanan Desen Ölçeğini ve Segmentasyon Çözünürlüğünü düzenleyerek eğitimi iyileştirmek de mümkündür.
  10. Eğitim bölgelerini tanımladıktan sonra, Doku Segmenterini Eğit iledevam edin.
    NOT: Eğitim sürecinde, yazılım doku segmentasyonunun doğruluk yüzdesini görüntüler. Optimal sonuçlar için doku segmentasyonunun en az %90 doğru olması önerilir. Segmenter sabitlendikten sonra Bitti düğmesine tıklayın.
  11. Tüm görüntülerde Doku Kategorisi maskesini görmek için Tüm parçaları segment düğmesine tıklayın.
  12. Doku segmentasyonunun kalitesini doğruladıktan sonra, yanlış sınıflandırılan alanların etrafındaki eğitim bölgelerini yeniden çizin ve süreç başarılı olana kadar Doku Segmenterini yeniden eğitin.
  13. Analize devam etmek için pencerenin üst kısmındaki Adım Çubuğu'ndaki Hücre Segmentasyonu adımına tıklayın.
  14. Segmentlere ayıracak hücresel bölmeleri seçin: Çekirdek, Sitoplazmave/veya Membran.
    NOT: Uyarlanabilir hücre segmentasyonu yalnızca nükleer sinyale sahip hücreleri algılayabildiği için Çekirdek 'i seçmeyin. Sitoplazma ve/veya membran segmentine etmek de mümkün olsa da, önce en güçlü, en bol nükleer bileşenin (örneğin, DAPI) seçilmesi önerilir.
  15. Nükleer pikselleri algılamak için kullanılan eşiği ayarlamak için Tipik Yoğunluk kaydırıcısını kullanarak nükleer bileşeni yapılandırın. Eşik ayarlanırken açılan ve canlı geri bildirim sağlayan önizleme penceresini not alın.
    NOT: Bu eşik uyarlanabilir ve çevreleyen arka plana göre ölçülür. Nükleer olarak çok fazla arka plan algılanırsa bu değeri artırın. Zayıf çekirdekler kaçırılıyorsa bu değeri düşürin. Segmentasyon maskelerini açıp kapatmak için Bölgeleri Göster/Gizle düğmesini kullanın ve doğru piksellerin nükleer olarak algılanıp algılanmadığını kontrol edin.
  16. Nükleer piksel kümelerini bölmek için Nükleer Bileşen Bölme panelini kullanın. Çekirdeğin boyama kalitesini en iyi açıklayan düğmeyi seçin. Ardından, bölme duyarlılığınıayarlamak için kaydırıcı çubuğunu kullanın, daha düşük değerlerin daha fazla bölünmeye neden olacağını unutmayın.
  17. Tüm görüntüleri segmentlere ayır düğmesine tıklayın. Sonuç doğru değilse, ayarları değiştirin ve tatmin edici bir segmentasyon elde edilene kadar yazılımı yeniden eğitin.
  18. Analizin son adımına geçin: Fenotipleme. Fenotipler panelinde, algılanacak fenotiplerin listesini ekleyin ve adı ilgili metin kutusuna yazın. Fenotipleri Düzenle düğmesine tıklayın, açılır menüyü açmak için belirli bir hücreyi seçin ve ilgili fenotipi seçin.
    NOT: Sınıflandırıcıyı eğitmek için her fenotip için en az beş hücre gereklidir. Çekirdeğin görselleştirilmesini kapatmak, atanması gereken hücre fenotipinin daha iyi görselleştirilmesini sağlar.
  19. Eğitim seçimi tamamlandıktan sonra Sınıflandırıcıyı Eğit düğmesine tıklayın.
    NOT: Yazılım görüntüdeki her bir hücreyi sınıflandırır ve sınıflandırmada hatalar oluştuğunda, hücrelerin fenotipini düzenlemek ve sınıflandırıcının eğitimini tekrarlamak mümkündür. Toplu işleme çözümleme işlemine geçmeden önce projeyi kaydedin ve ekranın üst kısmındaki araç çubuğunda Dışa Aktar'ı tıklatın.
  20. Sol menüde Banyo Analizi sekmesini seçin ve projeyi Toplu İş Algoritması veya Proje kutusuna yükleyin.
  21. Her görüntü için ayrı dizinler oluşturmak üzere Dışa Aktarma Seçenekleri'ni tıklatın ve Gözat düğmesiyle verileri dışa aktaracak konumu bulmak için gidin. Dışa aktaracak resim ve tabloların tüm seçeneklerine tıklayın.
  22. Ekranın sağ tarafında Slayt Ekle'ye tıklayın ve daha önce hazırlanmış partiler için pul içeren tüm görüntüleri yükleyin (adım 7.3). Toplu iş çözümlemesi başlatmak ve karşılık gelen verileri dışa aktararak her seferinde bir damga işlemek için Çalıştır düğmesini tıklatın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

MIF lekeli histolojik bölümlerin multispektral görüntülemesi, tek tek hücre popülasyonlarının tanımlanmasına ve fenotipilmesine ve eksizyon TME'deki tümör ve stromal bileşenlerin tanımlanmasına izin eder (Şekil 2). Multispektral görüntüleme, otofluoresans sinyalinin diğer sinyallerden arındırılmasına ve sonraki analizlerden dışlandırılmasına izin verdiği için kollajen içeriği yüksek dokular gibi içsel otoflüoresansı yüksek dokuların analizi için özel...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu makalede PDE'lerin üretimi, ilaç tedavisi ve analizine yönelik yöntemler açıklanmaktadır ve platformun preklinik bir model sistemi olarak avantajları vurgulanmaktadır. Yapısızlaştırmasını içermeyen yeni resected bir tümörün ex vivo kültürü, tümör mimarisi13,24'ün tutulmasını ve böylece TME'deki hücresel bileşenlerin mekansal etkileşimlerinin yanı sıra intratümoral heterojeniteye izin verir. Bu yöntem, tümöre özgü bir beli...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Açıklayacak bir şey yok

Teşekkürler

Leicester NHS Trust Üniversite Hastaneleri'ndeki cerrahlara ve patologlara cerrahi resekre tümör dokusu sağladıkları için teşekkür ederiz. Ayrıca Core Biotechnology Services bünyesindeki Histoloji tesisine FFPE doku bloklarının doku işleme ve bölümleme konusundaki yardımları için ve Kees Straatman'a Vectra Polaris kullanımına destek için teşekkür ediyoruz. Bu araştırma, Leicester Üniversitesi, MRC Toksikoloji Birimi, Kanser Araştırmaları İngiltere Terapötik Keşif Laboratuvarları ve LifeArc olmak üzere dört ortaktan oluşan Explant Konsorsiyumu tarafından desteklendi ve finanse edildi. CRUK-NIHR Leicester Deneysel Kanser Tıbbı Merkezi (C10604/A25151) tarafından ek destek sağlanmıştır. GM, CD ve NA için fon, Pfizer'dan sağlanan finansmanla desteklenen Breast Cancer Now's Catalyst Programı (2017NOVPCC1066) tarafından sağlandı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidSigma320099Staining reagent
Antibody Diluent / Block, 1xPerkin ElmerARD1001EAAntibody diluent/blocking buffer
Barnstead NANOpure DiamondBarnsteadUltra Pure (UP) H2O machine
Citric Acid MonohydrateSigma-AldrichC7129Reagent for citrate buffer
Costar Multiple Well Cell Culture PlatesCorning Incorporated35166 multiwell plate
DAPI DilactateLife TechnologiesD3571
100 x 17 mm Dish, Nunclon DeltaThermoFisher Scientific150350100 mm diameter dish for tissue culture
DMEM (1x) Dubelcco's Modified Eagle Medium + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/mL Sodium PyruvateGibco (Life Technologies)10569-010Tissue culture medium (500 mL)
DPX mountantVWR360294HMounting medium
DPX mountantMerck6522Mounting medium
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma-Aldrich3609Reagent for TE buffer
EosinCellPathRBC-0100-00AStaining reagent
Foetal Bovine SerumGibco10500-064For use in tissue culture medium
37% FormaldehydeFisher (Acros)11969001010% Formalin
iGenix, microwave oven IG2095iGenixIG2095Microwave used for antigen retreival
Industrial methylated spirit (IMS)Genta Medical19905099% Industrial Denatured Alcohol (IDA)
InForm Advanced Image Analysis SoftwareAkoya BiosciencesInForm
Leica ASP3000 Tissue ProcessorLeica BiosystemsAutomated Vacuum Tissue Processor
Leica Arcadia H and CLeica BiosystemsEmbedding wax bath
Leica RM2125RTLeica BiosystemsRotary microtome
Leica ST4040 Linear StainerLeica BiosystemsH&E stainer
Mayer's HaematoxylinSigmaGHS132-1LStaining reagent
Millicell Cell Culture Inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µmMerck MiliporePICMORG50Organotypic culture insert disc
Novolink Polymer Detection SystemLeica BiosystemsRE7150-KDAB staining kit
OPAL 480Akoya BiosciencesFP1500001KTFluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 520Akoya BiosciencesFP1487001KTFluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 570Akoya BiosciencesFP1488001KTFluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 620Akoya BiosciencesFP1495001KTFluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 650Akoya BiosciencesFP1496001KTFluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 690Akoya BiosciencesFP1497001KTFluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 780 / OPAL TSA-DIG ReagentAkoya BiosciencesFP1501001KTFluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent and TSA-DIG reagent
Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1xPerkin ElmerARH1001EAHRP polymer
Penicillin/streptomycin solutionFisher Scientific11548876For use in tissue culture medium
PhenoChart Whole Slide Contextual ViewerAkoya BiosciencesPhenoChartViewer software for scanned images
Phosphate Buffered Saline TabletsThermo Scientific OxoidBR0014GPBS
1x Plus Amplification DiluentPerkin ElmerFP1498Fluorophore diluent
Prolong Diamond Antifade MountantInvitrogenP36961Mounting medium
Slide CarrierPerkin ElmerTo load slides into Slide Carrier Hotel for scanning with Vectra Polaris
Sodium ChlorideFisher ScientificS/3160/6310% Formalin
Sodium Hydroxide pelletsFisher ScientificS/4920/53Reagent for citrate buffer
Tenatex Toughened Wax - Pink (500 g)KEMDENT1-601Dental wax surface
Thermo Scientific Shandon Sequenza Slide Rack for Immunostaining CenterFisher Scientific10098889Holder for slides and slide clips
Thermo Scientific Shandon Plastic CoverplatesFisher Scientific11927774Slide clips
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)Sigma-Aldrich252859Reagent for TE buffer
VectaShieldVecta LaboratoriesH-1000-10Mounting medium
Vectra Polaris Slide ScannerPerkin ElmerVectra PolarisSlide scanner
XyleneGenta MedicalXYL050De-waxing agent

Referanslar

  1. Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. The New England Journal of Medicine. 366 (10), 883-892 (2012).
  2. Jamal-Hanjani, M., et al. Tracking the evolution of non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 376 (22), 2109-2121 (2017).
  3. McGranahan, N., Swanton, C. Biological and therapeutic impact of intratumor heterogeneity in cancer evolution. Cancer Cell. 27 (1), 15-26 (2015).
  4. Casey, T., et al. Molecular signatures suggest a major role for stromal cells in development of invasive breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 114 (1), 47-62 (2009).
  5. Gerdes, M. J., et al. Emerging understanding of multiscale tumor heterogeneity. Frontiers in Oncology. 4, 366(2014).
  6. Komohara, Y., Takeya, M. CAFs and TAMs: maestros of the tumour microenvironment. The Journal of Pathology. 241 (3), 313-315 (2017).
  7. Miyake, M., et al. CXCL1-mediated interaction of cancer cells with tumor-associated macrophages and cancer-associated fibroblasts promotes tumor progression in human bladder cancer. Neoplasia. 18 (10), 636-646 (2016).
  8. Hisamitsu, S., et al. Interaction between cancer cells and cancer-associated fibroblasts after cisplatin treatment promotes cancer cell regrowth. Human Cell. 32 (4), 453-464 (2019).
  9. Witz, I. P. The tumor microenvironment: the making of a paradigm. Cancer Microenvironment. 2, Suppl 1 9-17 (2009).
  10. Fu, X. T., et al. Tumor-associated macrophages modulate resistance to oxaliplatin via inducing autophagy in hepatocellular carcinoma. Cancer Cell International. 19, 71(2019).
  11. Chen, D., Zhang, X. Tipping tumor microenvironment against drug resistance. Journal of Oncology Translational Research. 1 (1), 106(2015).
  12. Roma-Rodrigues, C., Mendes, R., Baptista, P. V., Fernandes, A. R. Targeting tumor microenvironment for cancer therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (4), 840(2019).
  13. Powley, I. R., et al. Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery. British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).
  14. Freeman, A. E., Hoffman, R. M. In vivo-like growth of human tumors in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 83 (8), 2694-2698 (1986).
  15. Vescio, R., et al. A. al. In vivo-like drug responses of human tumors growing in three-dimensional gel-supported primary culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 84 (14), 5029-5033 (1987).
  16. Hoffman, R. M. 3D Sponge-matrix histoculture: an overview. Methods in Molecular Biology. 1760, 11-17 (2018).
  17. Vescio, R. A., Connors, K. M., Kubota, T., Hoffman, R. M. Correlation of histology and drug response of human tumors grown in native-state three-dimensional histoculture and in nude mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 88 (12), 5163-5166 (1991).
  18. Furukawa, T., Kubota, T., Hoffman, R. M. Clinical applications of the histoculture drug response assay. Clinical Cancer Research. 1 (3), 305-311 (1995).
  19. Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nature Reviews Urology. 10 (8), 483-487 (2013).
  20. Centenera, M. M., et al. Evidence for efficacy of new Hsp90 inhibitors revealed by ex vivo culture of human prostate tumors. Clinical Cancer Research. 18 (13), 3562-3570 (2012).
  21. Dean, J. L., et al. Therapeutic response to CDK4/6 inhibition in breast cancer defined by ex vivo analyses of human tumors. Cell Cycle. 11 (14), 2756-2761 (2012).
  22. Majumder, B., et al. Predicting clinical response to anticancer drugs using an ex vivo platform that captures tumour heterogeneity. Nature Communications. 6, 6169(2015).
  23. Goldman, A., et al. Temporally sequenced anticancer drugs overcome adaptive resistance by targeting a vulnerable chemotherapy-induced phenotypic transition. Nature Communications. 6, 6139(2015).
  24. Karekla, E., et al. Ex vivo explant cultures of non-small cell lung carcinoma enable evaluation of primary tumor responses to anticancer therapy. Cancer Research. 77 (8), 2029-2039 (2017).
  25. Ricciardelli, C., et al. Novel ex vivo ovarian cancer tissue explant assay for prediction of chemosensitivity and response to novel therapeutics. Cancer Letters. 421, 51-58 (2018).
  26. Yoshimasu, T., et al. Histoculture drug response assay (HDRA) guided induction concurrent chemoradiotherapy for mediastinal node-positive non-small cell lung cancer. Gan To Kagaku Ryoho. Cancer and chemotherapy. 30 (2), 231-235 (2003).
  27. Pirnia, F., et al. Ex vivo assessment of chemotherapy-induced apoptosis and associated molecular changes in patient tumor samples. Anticancer Research. 26, 1765-1772 (2006).
  28. Maund, S. L., Nolley, R., Peehl, D. M. Optimization and comprehensive characterization of a faithful tissue culture model of the benign and malignant human prostate. Laboratory Investigation. 94 (2), 208-221 (2014).
  29. Vasaturo, A., Galon, J. Multiplexed immunohistochemistry for immune cell phenotyping, quantification and spatial distribution in situ. Methods in Enzymology. 635, 51-66 (2020).
  30. Fuhrman, K., et al. Molecularly guided digital spatial profiling for multiplexed analysis of gene expression with spatial and single cell resolution. Journal of Biomolecular Techniques. 31, 14-15 (2020).
  31. Twiddy, D., et al. A TRAIL-R1-specific ligand in combination with doxorubicin selectively targets primary breast tumour cells for apoptosis. Breast Cancer Research. 12 (1), 58(2010).
  32. Cai, H., et al. Cancer chemoprevention: Evidence of a nonlinear dose response for the protective effects of resveratrol in humans and mice. Science Translational Medicine. 7 (298), (2015).
  33. Busacca, S., et al. Resistance to HSP90 inhibition involving loss of MCL1 addiction. Oncogene. 35 (12), 1483-1492 (2016).
  34. Kolluri, K. K., et al. Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells. Elife. 7, 30224(2018).
  35. Toki, M. I., et al. High-plex predictive marker discovery for melanoma immunotherapy-treated patients using digital spatial profiling. Clinical Cancer Research. 25 (18), 5503-5512 (2019).
  36. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).
  37. Park, I. J., et al. Prediction of radio-responsiveness with immune-profiling in patients with rectal cancer. Oncotarget. 8 (45), 79793-79802 (2017).
  38. Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244 (4), 421-431 (2018).
  39. Kather, J. N., et al. Topography of cancer-associated immune cells in human solid tumors. Elife. 7, 36967(2018).
  40. Zollinger, D. R., Lingle, S. E., Sorg, K., Beechem, J. M., Merritt, C. R. GeoMx™ RNA assay: high multiplex, digital, spatial analysis of RNA in FFPE tissue. Methods in Molecular Biology. 2148, 331-345 (2020).
  41. Zugazagoitia, J., et al. Biomarkers associated with beneficial PD-1 checkpoint blockade in non-small cell lung cancer (NSCLC) identified using high-plex digital spatial profiling. Clinical Cancer Research. 26 (16), 4360-4368 (2020).
  42. Allo, B., Lou, X., Bouzekri, A., Ornatsky, O. Clickable and high-sensitivity metal-containing tags for mass cytometry. Bioconjugate Chemistry. 29 (6), 2028-2038 (2018).
  43. Gerdtsson, E., et al. Multiplex protein detection on circulating tumor cells from liquid biopsies using imaging mass cytometry. Convergent Science Physical Oncology. 4 (1), 015002(2018).
  44. Reck, M., et al. Pembrolizumab versus chemotherapy for PD-L1-positive non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1823-1833 (2016).
  45. Le, D. T., et al. KEYNOTE-164: Phase 2 study of pembrolizumab for patients with previously treated, microsatellite instability-high advanced colorectal carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 34, 15_suppl 3631(2016).
  46. Diaz, L. A., et al. KEYNOTE-177: Randomized phase III study of pembrolizumab versus investigator-choice chemotherapy for mismatch repair-deficient or microsatellite instability-high metastatic colorectal carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 35, 4_suppl 815(2017).
  47. Long, G. V., et al. Impact of baseline serum lactate dehydrogenase concentration on the efficacy of pembrolizumab and ipilimumab in patients with advanced melanoma: data from KEYNOTE-006. European Journal of Cancer. 72, 122-123 (2017).
  48. Voong, K. R., Feliciano, J., Becker, D., Levy, B. Beyond PD-L1 testing-emerging biomarkers for immunotherapy in non-small cell lung cancer. Annals of Translational Medicine. 5 (18), 376(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser Ara t rmalarSay 168eksplantlart m rpreklinik modellerhistolojidijital patolojioklu imm nofluoresans

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır