Telomerlerde Kimyasal Dimerizasyona Bağlı Protein Kondensatları

Özet

Bu protokol, kromatin üzerinde kondensatlar oluşturmak için kimyasal olarak indüklenmiş bir protein dimerizasyon sistemini göstermektedir.  Kimyasal dimerizatörlü telomerler üzerinde promiyelositik lösemi (PML) nükleer gövdesinin oluşumu gösterilmiştir. Damlacık büyümesi, çözünmesi, lokalizasyonu ve bileşimi canlı hücre görüntüleme, immünofluoresans (IF) ve floresan in situ hibridizasyon (FISH) ile izlenir.

Özet

Kromatinle ilişkili kondensatlar birçok nükleer proseste dahil edilir, ancak alttaki mekanizmalar zor bulunur. Bu protokol, telomerler üzerinde kondensatlar oluşturmak için kimyasal olarak indüklenen bir protein dimerizasyon sistemini açıklar. Kimyasal dimerizer, her biri bir proteine bağlanabilen iki bağlı liganddan oluşur: Halo ligand Halo enzimine ve trimethoprim 'e (TMP) sırasıyla E. coli dihidrofolat redüktaz (eDHFR). Halo enziminin bir telomer proteinine füzyonu, dimerizatörleri katvalent Halo ligand enzim bağlama yoluyla telomerlere tuttur. TMP'nin eDHFR'ye bağlanması, proteinleri telomerlere ayıran eDHFR ile kaynaşmış fazı işe toplar ve yoğuşma oluşumunu teşvik eder. TMP-eDHFR etkileşimi kurvalent olmadığından, yoğunlaşma, eDHFR bağlama için dimerizer ile rekabet etmek için fazla boş TMP kullanılarak tersine çevrilebilir. Telomerler üzerinde promiyelositik lösemi (PML) nükleer vücut oluşumunun teşvik edilmesi ve yoğuşma büyümesi, çözünmesi, lokalizasyonu ve bileşiminin belirlenmesine örnek gösterilmiştir. Bu yöntem, Halo'yu doğrudan lokal kromatin veya bir kılavuz RNA ile genomik lokusa hedeflenen dCas9'a bağlayan bir proteine kaynaştırarak diğer genomik konumlardaki yoğuşmalara neden olmak için kolayca uyarlanabilir. Biyokimyasal tahliller için hücre popülasyonunda faz ayrımını korurken tek hücreli canlı görüntüleme için gereken zamansal çözünürlüğü sunarak, bu yöntem kromatin ilişkili kondensatların hem oluşumunu hem de işlevini yok etmek için uygundur.

Giriş

Birçok protein ve nükleik asit sıvı-sıvı faz ayrımına (LLPS) tabir edilir ve hücrelerde biyokimyayı düzenlemek için biyomoleküler kondensatlara kendiliğinden monte edilir^1,2. Kromatin bağlayıcı proteinlerin LLPS'si, spesifik genomik loci ile ilişkili ve çeşitli lokal kromatin fonksiyonlarına karışan kondensatların oluşumuna yol açar³. Örneğin, HP1 proteininin LLPS'si, transkripsiyon⁴,^5,TRANSKRipsiyon faktörlerinin LLPS'si transkripsiyon 6'yı düzenlemek için transkripsiyon merkezlerinin form transkripsiyon merkezlerini düzenlemek....

Protokol

1. Geçici hücre hatlarının üretimi

1. 6-6-D-lizin ile kaplanmış 22 x 22 mm cam kapaklar (canlı görüntüleme için) veya 12 mm çapında dairesel kapaklar (IF veya FISH için) üzerindeki Kültür U2OS kabul hücreleri büyüme ortamına sahip kuyu plakası (DMEM'de%10 fetal sığır serumu ve %1 Penisilin-Streptomisin çözeltisi) %60-70 izdiah edene kadar.
2. Transeksiyondan önce büyüme ortamını 1 mL transfeksiyon ortamı (Penisilin-Streptomisicin çözeltisi olmayan büyüme ortamı) ile değiştirin.
3. Her transfeksiyon kuyusu için, 150 μL azaltılmış serum ortamına 4 μL transfeksiyon reaktifi ekleyin, 10 saniye boyunca girdap ve ardından 5 dakika kuluç....

Sonuçlar

Telomer DNA FISH ve SUMO protein IF ile tanımlanan SUMO'nun telomer lokalizasyonunun temsili görüntüleri Şekil 2'degösterilmiştir. SIM işe alımı olan hücreler, SIM mutant işe alımı olan hücrelere kıyasla telomerler üzerinde SUMO1 ve SUMO 2/3'ü zenginleştirdi. Bu, telomerlerde SIM dimerizasyon kaynaklı SUMO zenginleştirmenin SUMO-SIM etkileşimlerine bağlı olduğunu gösterir.

Küçültme sonrası TRF1 ve SIM'in temsili bir zaman atlamalı fi.......

Tartışmalar

Bu protokol, telomerler üzerindeki kondensatların kimyasal bir dimerizasyon sistemi ile oluşumunu ve çözünmesini göstermiştir. Faz ayırma kinetiği ve damlacık füzyon kaynaklı telomer kümelenmesi canlı görüntüleme ile izlenir. Yoğuşma lokalizasyonu ve bileşimi DNA FISH ve protein IF ile belirlenir.

Bu protokolde iki kritik adım vardır. Birincisi protein ve dimerizer konsantrasyonunu belirlemektir. Genomik bir lokusta lokal faz ayrımını teşvik etmedeki başarı, faz ay.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate	Corning	MT25053CI
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free	Thermo Scientific	28906	Prepare 1% in 1x PBS
6 Well Culture Plate	VWR	10861-554
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-101
Anti-mCherry antibody	Abcam	Ab183628
Anti-PML antibody	Santa Cruz	sc966
Anti-SUMO1 antibody	Abcam	Ab32058
Anti-SUMO2/3 antibody	Cytoskeleton	Asm23
Blocking Reagent	Roche	11096176001
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP9706100
BTX Tube micro 1.5ML	VWR	89511-258
Circle Cover Slips	Thermo Scientific	3350
Confocal microscope	Nikon	MQS31000
DAPI	Fisher Scientific	D1306
Dimethyl Sulphoxide	Sigma-Aldrich	472301
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Corning	MT10017CV
EMCCD Camera	iXon Life	897
Ethanol	Fisher Scientific	4355221
Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions	Gibco	A4766801
Formamide, Deionized	MilliporeSigma	46-101-00ML
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A28181
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A32733
High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps	Fisher Scientific	12-000-122
Laser merge module	Nikon	NIIMHF47180
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco	21083027
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen	11668027
Figure plotting software, MATLAB	The MathWorks
Microscope Slide Box	Fisher Scientific	34487
Nail Polish	Fisher Scientific	50-949-071
Imaging software, NIS-Elements	Nikon
Opti-MEM Reduced Serum Media	Gibco	51985091
Parafilm	Bemis	13-374-12
PBS 10x, pH 7.4	Fisher Scientific	70-011-044
Penicillin-Streptomycin Solution,100X	Gibco	15140122
Piezo Z-Drive	Physik Instrumente (PI)	91985
Pipet Tips	VWR	10017
Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides	Fisher Scientific	22-037-246
Poly-D-Lysine solution	Sigma-Aldrich	A-003-E
Sodium Azide	Fisher Scientific	BP922I-500
Spinning disk	Yokogawa	CSU-X1
Square Cover Slips	Thermo Scientific	3305
TBS 10x solution	Fisher Scientific	BP2471500
TelC-Alexa488	PNA Bio	F1004
TMP	Synthesized by Chenoweth lab		Available upon request
TNH	Synthesized by Chenoweth lab		Available upon request
Tris Solution	Fisher Scientific	92-901-00ML
Triton X-100 10% Solution	MilliporeSigma	64-846-350ML	Prepare 0.5% in 1x PBS
U2Os cell line	From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore)	HTB-96
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	NC9524612