JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu makalenin amacı, farelerde serebral arterlerde kan akışının in vivo görüntülenmesini sağlayan sonografi tabanlı bir yöntem sunmaktır. Subaraknoid kanamanın (SAH) murine modellerinde vazospazm ile ilişkili kan akışı hızlarındaki değişiklikleri belirlemek için uygulamasını gösteriyoruz.

Özet

Bir tür hemorajik inme olan subaraknoid kanamadan sonraki haftalarda ortaya çıkan serebral vazospazm, gecikmiş serebral iskemiye katkıda bulunur. SAH'ın murine modellerinin kullanılarak yapılan deneysel çalışmalarda karşılaşılan bir sorun, farelerde serebral vazospazm in vivo izleme yöntemlerinin eksik olmasıdır. Burada fareler üzerinde transkraniyal Dubleks sonografi muayeneleri yapmak için yüksek frekanslı ultrason uygulamasını gösteriyoruz. Yöntem kullanılarak, iç karotis arterler (ICA) tanımlanabilir. intrakraniyal ICA'lardaki kan akışı hızları SAH indüksiyonu sonrasında önemli ölçüde hızlanırken, ekstrakraniyal ICA'lardaki kan akışı hızları düşük kalarak serebral vazospazmı gösterdi. Sonuç olarak, burada gösterilen yöntem, bir murine SAH modelinde serebral vazospazm fonksiyonel, noninvaziv in vivo izlenmesine izin verir.

Giriş

Spontan subaraknoid kanama (SAH), çoğunlukla intrakraniyal anevrizma1'inyırtılmasından kaynaklanan hemorajik inme şeklidir. Nörolojik sonuç esas olarak iki faktörden etkilenir: kanamanın ve buna bağlı geçici küresel serebral iskeminin etkilerinden kaynaklanan erken beyin hasarı (EBI) ve kanamayı takip eden haftalarda ortaya çıkan gecikmiş serebral iskemi (DCI),2,3. DCI'nın SAH hastalarının %30'una kadar etkilediğibildirilmiştir 2. DCI'nın patofizyolojisi anjiyografik serebral vazospazm, mikrovazospaz ve mikrotemozun neden olduğu rahatsız bir mikrositülasyon, kortikal yayılır depresyonlar ve iltihabın tetiklediği etkileri içerir4. Ne yazık ki, tam patofizyoloji belirsizliğini koruyor ve DCI3'üetkili bir şekilde önleyen bir tedavi yok. Bu nedenle DCI birçok klinik ve deneysel çalışmada araştırılmaktadır.

Günümüzde, SAH ile ilgili çoğu deneysel çalışmada, özellikle farelerde5, 6 , 7,8,9,10,11,12,13küçük hayvan modellerikullanmaktadır. Bu tür çalışmalarda serebral vazospazm uç nokta olarak sıkça araştırılmaktadır. Vasospasm ex vivo derecesini belirlemek yaygındır. Bunun nedeni, kısa anestezi süresi gerektiren ve hayvanlara sadece az sıkıntı uygulayan serebral vazospazm in vivo muayenesi için noninvaziv yöntemlerin eksik olmasıdır. Bununla birlikte, serebral vazospazm in vivo muayenesi avantajlı olacaktır. Bunun nedeni, farelerde vazospazm üzerinde uzunlamasına in vivo çalışmalara izin vermesidir (yani, SAH'ın indüksiyondan sonraki günlerde farklı zaman noktalarında serebral vazospazm görüntüleme). Bu, farklı zaman noktalarında elde edilen verilerin karşılaştırıllanabilirliğini artıracaktır. Ayrıca, uzunlamasına bir çalışma tasarımı kullanmak hayvan sayılarını azaltmak için bir stratejidir.

Burada farelerde serebral arterlerdeki kan akışını belirlemek için yüksek frekanslı transkraniyal ultrasonun kullanımını gösteriyoruz. Klinik uygulama 14, 15 ,16,17 ,18'detranskraniyal Doppler sonografi (TCD) veya transkraniyal renk kodlu Dubleks sonografiye (TCCD) benzer şekilde, bu yöntemin murine modelinde SAH indüksiyonu sonrası intrakraniyal arterlerin kan akış hızlarını ölçerek serebral vazospazmı izlemek için kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Protokol

Hayvan deneyleri sorumlu hayvan bakım komitesi (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz) tarafından onaylandı ve Alman Hayvan Refahı Yasası (TierSchG) uyarınca gerçekleştirildi. Hayvanların bakımı ve kullanımı için geçerli tüm uluslararası, ulusal ve kurumsal yönergelere uyuldu. Bu çalışmada 11-12 haftalık kadın C57BL/6N farelerde vücut ağırlığı 19-21 g arasında olan intrakraniyal ve ekstrakraniyal arterlerin kan akış hızlarının ölçümlerini yaptık. Fareler, başka bir yerde ayrıntılı olarak açıklanan SAH indüksiyonu veya sham ameliyatına maruz kaldı10,12,13.

1. Malzemelerin hazırlanması

  1. Ultrason makinesini aç ve hayvan kimliğine gir.
  2. Ultrason sisteminin ısıtma plakasını 37 °C'ye ısıtın. Rektal sıcaklık probun kullanıma hazır olduğundan emin olun.
  3. Ultrason jelini 37 °C'ye ısıtmak için bir su banyosu kullanın. Epilasyon kremi, elektrotlar için temas kremi ve göz merhemi hazırlayın.

2. Anestezi

  1. Fareyi 1 dakika boyunca% 4 izofluran ve% 40 O2 ile yıkanmış bir odaya koyarak anesteziye neden olabilir. Gözleri göz merhemiyle koruyun. Sadece yeterince derin bir anesteziye ulaşıldıktan sonra devam edin (ağrı uyaranlarına reaksiyon olmaması).
  2. Tüm işlem boyunca anestezi maskesi kullanarak %1,5 izofluran ve%40 O 2 ile anesteziyi koruyun.

3. Transkraniyal yüksek frekanslı Dubleks sonografi ile intrakraniyal iç karotid arterlerin kan akış hızlarının belirlenmesi

  1. 37 °C vücut sıcaklığını korumak için fareyi ultrason sisteminin ısıtma plakasına eğilimli konuma yerleştirin.
  2. Hayvanın dört ekstremitesini iletken macunla kaplayın ve tahtaya gömülü EKG elektrotlarına bantla sabitleyin. Fizyolojik parametrelerin (EKG, solunum sinyali) görüntüleme sisteminin ekranında doğru görüntülenip görüntülenmey olduğunu kontrol edin (örneğin, Vevo3100). Gerekirse, dakikada 400-500 atım (bpm) hedef kalp atış hızı elde etmek için anestezi seviyesini ayarlayın.
  3. Yağlamayı bir rektal sıcaklık probuna yerleştirin ve vücut sıcaklığını izlemek için dikkatlice yerleştirin. Gerekirse ilave bir ısıtma lambası kullanın.
  4. İlk sınavdan önce, epilasyon kremi kullanarak oksiput'taki kürkü kimyasal olarak çıkarın. Saçlar dökülmeye başlayana kadar kremi 2 dakika boyunca yaymak ve ovalamak için pamuklu çubuk kullanın.
    1. Ek 2 dakika sonra, krem ve tüyleri bir spatula ile çıkarın ve cildi alkollü bir cilt antiseptiği ile dezenfekte edin. 37 °C'ye ısıtılmış ultrason jeli ile kaplayın.
  5. Ultrason görüntüleri elde etmek ve probu mekanik kola sabitlemek için 38 MHz doğrusal dizi dönüştürücüsü ve 200 kare/sn'nin üzerinde bir kare hızı kullanın. Dönüştürücüsü 30° geriye doğru eğilmiş oksiput üzerine yerleştirin.
  6. Sağ intrakraniyal iç karotid arteri görselleştirmek ve dönüştürücüsü kontrol ünitesiyle ileri geri hareket ettirmek için Parlaklık(B)- modunu ve Renk dalgası(CW) Doppler modunu kullanın, arterlerin maksimum akışı bulunana kadar.
  7. Anatomik bilgi toplamak için geleneksel B-Mode ve CW-Doppler modunu kullanın ve Edin düğmesine tıklayarak edinimi başlatın.
    1. İntrakraniyal gemilerin akış özellikleri hakkında bilgi kaydetmek için Pulse-Wave (PW) Doppler düğmesine tıklayın, numune hacmini geminin ortasına yerleştirin ve 3 s'den uzun bir sinüs döngüsü elde edin.
  8. Sol tarafla aynı şekilde ilerleyin.
  9. Ekstrakraniyal karotis arterlere devam edin.

4. Yüksek frekanslı Dubleks sonografi ile ekstrakraniyal iç karotid arterlerin kan akışı hızlarının belirlenmesi

  1. 37 °C vücut sıcaklığını korumak için fareyi ultrason sisteminin ısıtma plakasına geriye doğru yerleştirin.
  2. Hayvanın dört ekstremitesini iletken macunla kaplayın ve tahtaya gömülü EKG elektrotlarına bantla sabitleyin. Fizyolojik parametrelerin ekranda doğru görüntülenmesi için tekrar kontrol edin.
  3. İlk sınavdan önce yukarıda açıklandığı gibi epilasyon kremi kullanarak ön boyundaki kılları kimyasal olarak çıkarın. Ön boynu 37 °C'ye kadar ısıtılmış ultrason jeli ile kaplayın.
  4. Ultrason görüntüleri elde etmek için 38 MHz doğrusal dizi dönüştürücüsü ve 200 kare/sn'nin üzerinde bir kare hızı kullanın. Dönüştürücüsü hayvana paralel yerleştirin ve sağ şahdamarının boyuna görüntülerini elde etmek için pozisyonu ayarlayın.
  5. Doğru karotid arteri görselleştirmek için Parlaklık(B)- modunu ve Renk dalgası(CW) Doppler modunu kullanın. Görüntüde sağ ortak karotis arter (RCC), sağ iç karotis arter (RICA) ve sağ dış şahdamar (RECA) yer almalıdır.
  6. Anatomik bilgi toplamak için geleneksel B-Mode ve CW-Doppler modunu kullanın ve Edin düğmesine tıklayarak edinimi başlatın.
    1. Ekstrakraniyal karotis arterin akış özellikleri hakkında bilgi kaydetmek için Pulse-Wave (PW) Doppler düğmesine tıklayın, numune hacmini ortak karotis arterin, iç şahdamarının ve dış şahdamarının ortasına yerleştirin ve 3 s'den uzun bir sinevizyon döngüsü elde edin.
  7. Sol tarafla aynı şekilde ilerleyin.
  8. Anesteziyi sonlandırın ve hayvanı ısıtma plakasından çıkarın. Hipotermiyi önlemek ve tam iyileşmeyi kontrol etmek için hayvanı 1 saat boyunca 37 °C'ye ısıtılmış bir inkübatöre yerleştirilmiş bir kafese geri koyun.

5. Ultrasonografi verilerinin işlenmesi

  1. Yüksek frekanslı ultrason verilerinin işlenmesi sonrası için harici bir iş istasyonu kullanın. B modu, CW-Doppler modu ve PW-Doppler modu görüntülerini ve cine döngülerini dışa aktarın.
  2. İhraç edilen ultrason çalışmasını açın. Bir hayvan seçin ve intrakraniyal karotid arterin PW-Doppler cine döngüsünü açın. Bu protokolde genellikle 7 ila 8 kalp atışı ve karşılık gelen akış hızı eğrileri kaydedilir.
  3. Cine döngüsünü duraklatın ve Ölçüm düğmesine tıklayın. Vasküler Paketi seçin ve tepe sistolik basıncını (PSV) ölçmek için RICA PSV'ye tıklayın. Şimdi bir hız eğrisinin zirvesinde sola tıklayın ve düz çizgiyi sıfır çizgisine çekin. Sağ fare düğmesiyle bir tıklamayla ölçümü belirleyin.
  4. Şimdi enddiyastolik hızı (EDV) ölçmek için RICA EDV'yi seçin. Diyastole'nin sonundaki hız eğrisinin minimum döküntüsüne sola tıklayın. Çizgiyi doğrudan sıfır çizgisine çekin ve sağ fare düğmesiyle bir tıklamayla ölçümü belirleyin.
  5. Hız süresi integralini (VTI) ölçmek için RICA VTI'yi seçin. Hız eğrisinin başında sola tıklayın ve diyastolik platonun sonuna kadar fareyle eğriyi izleyin. Ardından ölçümü belirlemek için tekrar sağa tıklayın.
  6. Rapor düğmesini kullanarak intraserebral iç karotid arterlerin verilerini dışa aktarın. Dışarı Aktar'a basın ve verileri VSI Rapor dosyası olarak kaydedin.
  7. Doğru ekstrakraniyal iç karotid arterlerin PSV, EDV ve VTI'larını ölçmek ve verileri buna göre dışa aktarmak için aynı yaklaşımı kullanın.
  8. Sol tarafla aynı şekilde ilerleyin.

Sonuçlar

3'unda endovasküler filament perforasyon modeli kullanılarak SAH indüklenen 6 farede, 3'ü sham ameliyatı elde edilirken, intrakraniyal iç karotis arterin (ICA) ve ekstrakraniyal ICA'nın kan akış hızları ameliyattan bir gün önce, ameliyattan 1, 3 ve 7 gün sonra belirlendi. Ölçümler, vücut ısısı 37 °C19'datutulurken izofluran ile anestezi altında yapılan başka bir çalışmanın ekokardiyografi incelemelerinin bir parçası olarak gerçekleştirildi.

Tartışmalar

Bilgimiz dahilinde, bu çalışma, yüksek frekanslı transkraniyal renk kodlu Dubleks ultrason ile SAH'ın bir murine modelinde serebral vazospazm izlenmesi için bir protokol sunan ilk çalışmadır. Bu yöntemin farelerde SAH indüksiyonu sonrası intrakraniyal kan akışı hızlarında bir artışı ölçebileceğini gösteriyoruz. İnsan tıbbında bu fenomen iyi bilinmektedir3,15. Çeşitli klinik çalışmalar, büyük intrakraniyal arterlerin yüksek kan...

Açıklamalar

Yazarlar rakip çıkarlar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Yazarlar, videodaki illüstrasyonların hazırlanması için Stefan Kindel'e teşekkür etmek istiyor. PW, MM ve SHK, Almanya Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (BMBF 01EO1503) tarafından desteklendi. Çalışma, Alman Araştırma Vakfı'nın (DFG INST 371/47-1 FUGG) Büyük Enstrümantasyon Hibesi ile desteklendi. MM, Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2020_EKEA.144) tarafından hibe ile desteklendi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Balea hair removal cremeBalea; GermanyASIN B0759XM39Vhair removal creme
C57BL/6N miceJanvier; Saint-Berthevin Cedex, Francen.a.mice
CorneregelBausch&Lomb; Rochester, NY, USAREF 81552983eye ointment, lube
cotton swabsHecht Assistent; Sondenheim vor der Röhn, GermanyREF 44302010cotton swabs
Ecco-XS razorTondeo; Soligen, GermanyDE 28693396razor
Electrode creamGE; Boston, MA, USAREF 21708318conductive paste
Heating plateMedax; Kiel, Germany2005-205-01
IsofluraneAbvie; Wiesbaden, Germanyn.a.volatile anesthetic
LeukofixBSN medical; Hamburg, GermanyREF 02137-00tape
Mechanical arm + micromanipulatorVisualSonics; FujiFilm, Toronto, CAP/N 11277
Microbac tissuesPaul Hartmann AG; Hamburg, GermanyREF 981387antimicrobial tissues
MZ400, 38 MHz linear array transducerVisualSonics; FujiFilm, Toronto, CAREF 51068-30ultrasound transducer
SonosidASID Bonz GmbH; Herrenberg, GermanyREF 782010ultrasonography gel
Ultrasound platform with heating plate and ECG-recordingVisualSonics; FujiFilm, Toronto, CAP/N 11179
UniVet-PortaGroppler; Oberperasberg, GermanyS/N BKGM0437isoflurane vaporizer
Vevo3100VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CAREF 51073-45ultrasonography device
VevoLab softwareVisualSonics; FujiFilm, Toronto, CAn.a.evaluation software

Referanslar

  1. Macdonald, R. L., Schweizer, T. A. Spontaneous subarachnoid haemorrhage. Lancet. 389 (10069), 655-666 (2017).
  2. Macdonald, R. L. Delayed neurological deterioration after subarachnoid haemorrhage. Nature Reviews Neurology. 10 (1), 44-58 (2014).
  3. Francoeur, C. L., Mayer, S. A. Management of delayed cerebral ischemia after subarachnoid hemorrhage. Critical Care. 20 (1), 277 (2016).
  4. van Lieshout, J. H., et al. An introduction to the pathophysiology of aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Neurosurgical Review. , (2017).
  5. Altay, T., et al. A novel method for subarachnoid hemorrhage to induce vasospasm in mice. J Neurosci Methods. 183 (2), 136-140 (2009).
  6. Momin, E. N., et al. Controlled delivery of nitric oxide inhibits leukocyte migration and prevents vasospasm in haptoglobin 2-2 mice after subarachnoid hemorrhage. Neurosurgery. 65 (5), 937-945 (2009).
  7. Froehler, M. T., et al. Vasospasm after subarachnoid hemorrhage in haptoglobin 2-2 mice can be prevented with a glutathione peroxidase mimetic. Journal of Clinical Neuroscience. 17 (9), 1169-1172 (2010).
  8. Provencio, J. J., Altay, T., Smithason, S., Moore, S. K., Ransohoff, R. M. Depletion of Ly6G/C(+) cells ameliorates delayed cerebral vasospasm in subarachnoid hemorrhage. Journal of Neuroimmunology. 232 (1-2), 94-100 (2011).
  9. Kamp, M. A., et al. Evaluation of a murine single-blood-injection SAH model. PLoS One. 9 (12), 114946 (2014).
  10. Luh, C., et al. The Contractile Apparatus Is Essential for the Integrity of the Blood-Brain Barrier After Experimental Subarachnoid Hemorrhage. Translational Stroke Research. , (2018).
  11. Neulen, A., et al. A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
  12. Neulen, A., et al. Large Vessel Vasospasm Is Not Associated with Cerebral Cortical Hypoperfusion in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage. Translational Stroke Research. , (2018).
  13. Neulen, A., et al. Neutrophils mediate early cerebral cortical hypoperfusion in a murine model of subarachnoid haemorrhage. Scientific Reports. 9 (1), 8460 (2019).
  14. Neulen, A., et al. Volumetric analysis of intracranial vessels: a novel tool for evaluation of cerebral vasospasm. Int J Comput Assist Radiol Surg. 14 (1), 157-167 (2019).
  15. Washington, C. W., Zipfel, G. J. Participants in the International Multi-disciplinary Consensus Conference on the Critical Care Management of Subarachnoid, H. Detection and monitoring of vasospasm and delayed cerebral ischemia: a review and assessment of the literature. NeuroCritical Care. 15 (2), 312-317 (2011).
  16. Greke, C., et al. Image-guided transcranial Doppler sonography for monitoring of defined segments of intracranial arteries. Journal of Neurosurgical Anesthesiology. 25 (1), 55-61 (2013).
  17. Neulen, A., Prokesch, E., Stein, M., Konig, J., Giese, A. Image-guided transcranial Doppler sonography for monitoring of vasospasm after subarachnoid hemorrhage. Clinical Neurology and Neurosurgery. 145, 14-18 (2016).
  18. Neulen, A., et al. Image-Guided Transcranial Doppler Ultrasound for Monitoring Posthemorrhagic Vasospasms of Infratentorial Arteries: A Feasibility Study. World Neurosurgery. 134, 284-291 (2020).
  19. Neulen, A., et al. Correlation of cardiac function and cerebral perfusion in a murine model of subarachnoid hemorrhage. Scientific Reports. 11 (1), 3317 (2021).
  20. Neulen, A., et al. A segmentation-based volumetric approach to localize and quantify cerebral vasospasm based on tomographic imaging data. PLoS One. 12 (2), 0172010 (2017).
  21. Marbacher, S., et al. Systematic Review of In Vivo Animal Models of Subarachnoid Hemorrhage: Species, Standard Parameters, and Outcomes. Translational Stroke Research. , (2018).
  22. Figueiredo, G., et al. Comparison of digital subtraction angiography, micro-computed tomography angiography and magnetic resonance angiography in the assessment of the cerebrovascular system in live mice. Clinical Neuroradiology. 22 (1), 21-28 (2012).
  23. Lindegaard, K. F., Nornes, H., Bakke, S. J., Sorteberg, W., Nakstad, P. Cerebral vasospasm diagnosis by means of angiography and blood velocity measurements. Acta Neurochirurgica. 100 (1-2), 12-24 (1989).
  24. Cassia, G. S., Faingold, R., Bernard, C., Sant'Anna, G. M. Neonatal hypoxic-ischemic injury: sonography and dynamic color Doppler sonography perfusion of the brain and abdomen with pathologic correlation. American Journal of Roentgenology. 199 (6), 743-752 (2012).
  25. Shen, Q., Stuart, J., Venkatesh, B., Wallace, J., Lipman, J. Inter observer variability of the transcranial Doppler ultrasound technique: impact of lack of practice on the accuracy of measurement. Journal of Clinical Monitoring and Computing. 15 (3-4), 179-184 (1999).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geri ekmeSay 172Subaraknoid kanamafare modelik k hayvan modeliboyuna al maazaltma stratejisitranskraniyal Doppler sonografitranskraniyal renk kodlu Dubleks sonografiy ksek frekansl ultrasonvazospazmserebral vazospazmgecikmi serebral iskemierken beyin hasar

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır