Yetişkin Kas Kök Hücre İşlevselliğinin Değerlendirilmesi için Tek Miyofiber Kültür Tahlil Ex Vivo

Özet

Bu protokolde, kas kök hücreleri için endojen nişleriyle etkileşimlerinin çoğunu koruyan bir in vitro kültleme ve fonksiyonel analiz yöntemi tanımlanmıştır.

Özet

Erişkin iskelet kas dokusu, yenilenme yeteneğinin vazgeçilmezi olan bir kök hücre popülasyonunu barındırır. Kas hasarı üzerine, kas kök hücreleri sessiz hallerini terk eder ve miyojenik programı aktive eder ve sonuçta kas kök hücre havuzunun yenilenmesi ile birlikte hasarlı dokunun onarılmasına yol açtı. Çeşitli faktörler kas kök hücre aktivitesini etkiler, bunlar arasında içsel uyaranlar, aynı zamanda doğrudan kas kök hücre ortamından, kök hücre nişinden gelen sinyaller. Tek miyofiberlerin ilişkili kas kök hücreleri ile izolasyonu ve kültürü, kök hücrenin nişi ile etkileşiminin çoğunu korur ve bu nedenle kas kök hücre işlevselliğini incelemek için en yakın olasılıktır ex vivo. Burada fare EDL(ekstansör digitorum longus)kaslarından kas kök hücrelerinin kendi miyofiberlerinde izolasyon, kültür, siRNA transfeksiyonu ve immünostaining için bir protokol sağlanmaktadır. Burada özetlenen deneysel koşullar, in vivo hayvan deneylerine ihtiyaç duymadan miyojenik aktivitenin araştırılması da dahil olmak üzere kas kök hücrelerinin incelenmesine ve manipülasyon edilmesine izin verir.

Giriş

Erişkinteki iskelet kası, esas olarak gönüllü hareketler için efektör hücreler olan çok iklüzlenmiş miyofiberlerden oluşan postmitotik bir dokudur. Embriyonik miyogenez'e benzeyen ve yaş ve hastalıkta bozukluklar geçiren bir süreç olan olağanüstü bir yenilenme yeteneğine sahiptir¹. İskelet kasının bu çarpıcı rejeneratif kapasitesi, sarkolemma ve miyofiberlerin bazal laminası arasındaki konumları nedeniyle uydu hücreleri olarak da adlandırılan kas kök hücrelerine (MÜSC) bağlıdır^2,3. Dinlenme koşulları altında MÜSC'ler sessizdir ve transkripsiyon faktörü Pax7 ve Sprouty1 4 , 5^,6,7,8gibi sessizlik işaretleyicilerinin ifadesi ile karakterize edilir. Etkinleştirme üzerine, örneğin, yaralanmadan sonra, MUSC'ler sessiz durumdan ayrılır ve miyojenik düzenleyici faktör MyoD^9'uyükseltir. Pax7/MyoD çift pozitif MuSC'ler çoğalır ve farklılaşır, böylece genellikle miyoblastlar olarak da adlandırılan miyojenik öncül hücreler üretir. Bu mioblastlar daha sonra uzun miyositlere, moleküler ve morfolojik değişikliklere denk gelen bir sürece, örneğin Pax7 kaybına ve Myogenin ifadesinin yukarı doğru kontrol edilebilirliğine daha da farklılaşır¹⁰. Miyositler daha sonra birbirlerine veya mevcut miyoberlere kaynaşır ve böylece hasarlı dokuyu onarırlar. Daha da önemlisi, kas kök hücrelerinin küçük bir kısmı MyoD'un yukarı yönlülasyonunu geri döndürür ve kendi kendini yenileyebilir¹¹. MuSC farklılaşması ve miyojenik ilerleme durumu Pax7, MyoD ve Myogenin¹⁰gibi miyojenik belirteçlerin araştırılmasıyla kolayca gözlemlenebilir.

Bitişik MuSC'leri ile tek miofiber kültürü, MuSC'ler endojen nişlerinde kaldıklarından, bir ex vivo ayarında MuSC işlevselliğini araştırmak için mükemmel bir yöntemdir^12,13. MuSC'lerin davranışı, içsel sinyallerin yanı sıra, MüSC'leri ve miofiberin kendisini çevreleyen hücre dışı matrisin (ECM) bileşenlerini içeren özel bir anatomik konum olan niş tarafından sağlanan dışsal sinyallerle düzenlenir. Örneğin, MüSC sessizliğinin dışsal düzenleyicilerinden biri Notch sinyalidir. Burada, sinyal ipuçları hem myofiber hem de ECM^{14 , 15,}16'dan MUSC'ler tarafından alınır. Dahası, MuSC niş, MüSC'lerin bölünme eksenini kontrol etmek için önemlidir, böylece MuSC kız hücrelerinin hücre kaderini düzenler^17,18. Makul bir şekilde, asimetrik MuSC bölümleri, miyojenik ilerleme ve kendini yenileme gibi parametreler bu deneysel kurulumda benzersiz bir şekilde değerlendirilebilir. Örneğin, 72 saatlik bir kültür döneminden sonra bir MüSC'den kaynaklanan çok hücreli bir küme oluşabilir, bu da kendini yenileme, çoğalma ve daha da farklılaştırılmış MüSC 8 ,¹⁹,^20,21gibi farklı miyojenik popülasyonların oluşumu ve yüzdesi için araştırılabilir. MüSC'lerin farklılaşma durumu Pax7, MyoD ve Myogenin'in ekspresyonu/birlikte ifadesi araştırılarak belirlenebilir. 72 saatlik kültürden sonra bir kümedeki hücreler aşağıdaki parametrelerle ayırt edilebilir: Pax7 yalnızca hücreler kendi kendini yenileyen MuSC'ler iken Pax7 / MyoD çift pozitif hücreler çoğalır / aktive olur MuSC'ler ve daha da farklılaştırılmış miyojenik hücreler Myogenin pozitif²². Ayrıca, MuSC numaraları veya hücre döngüsüne/aktivasyonuna yeniden giriş, miyojenik ilerlemeye ek olarak, örneğin yukarıda açıklanan parametrelere dayalı immünofluoresans bazlı analizler yoluyla araştırılabilir.

Burada, miofiber izolasyon ve kültür protokolünün benzersiz özellikleri, örneğin MüSC'nin nişi ile etkileşiminin korunması anlatılıyor. Fare bütün EDL (ekstansor digitorum longus) kasları dikkatlice parçalara ayırılır, kollajenaz tarafından sindirilir ve daha fazla kültür için ilişkili MuSC'leri ile tek miyofiber elde etmek için fiziksel olarak üçe katlanır. Ayrıca protokol, transgenik hayvanlara gerek kalmadan aday genlerin fonksiyonel analizleri ve ardışık immünofluoresans bazlı analizler için MüSC'leri siRNA ile dönüştürme adımlarını tanımlamamaktadır.

Protokol

Hayvanların kurban edilmesi, hayvan deneyleri için ulusal düzenlemelere uygun olarak yapılmalıdır. Burada açıklanan protokol, Leibniz Yaşlanma Enstitüsü - Fritz Lipmann Enstitüsü ve Avrupa Birliği (AB) direktifi 2010/63/EU 'nun yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi (organ hasadı için lisans numarası: O_JvM_18-20). Protokolün temel adımları Şekil 1'de özetlenmiştir.

1. Kültür plakalarının, medyanın ve Pasteur pipetlerinin hazırlanması

NOT: Tek miyofiberleri izole etmek ve kültüre etmek için gerekli tüm malzeme ve ekipmanların mümkün olduğunca steril olması gerekir. Bu nedenle, tek miyofiberlerin yarı steril bir diseksiyon başlığı altında izolelanması önerilir.

1. Doku kültürü plakalarını kaplamak için steril HS (at serumu) kullanın. Kaplama, tek miyofiberlerin plastik yüzeye bağlanmasını önler. Her fare için, izolasyon için 12 kuyulu bir plakanın 4 kuyusu ve kültleme için 24 kuyu plakasının özel bir sayısı gereklidir. 1 mL'lik 12 kuyulu bir plakanın kuyularını ve RT'de (oda sıcaklığında) 5 dakika boyunca 0,5 mL HS'ye sahip 24 kuyu plakasının kuyularını kuluçkaya yaslayın, ardından HS'yi çıkarın ve plakaları 5 dakika daha kurutun.
   NOT: HS, steril tutulursa, kaplama amacıyla birçok kez toplanabilir ve yeniden kullanılabilir.
2. DMEM'i (Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium'u 4,5 g/L glikoz ve sodyum piruvat) %20 FBS (fetal sığır serumu) ile destekleyerek, 0,22 μm filtre ile filtreleyarak miyober izolasyon ortamını hazırlayın. Önceden kaplanmış izolasyon plakalarına (12 kuyu plakası, kuyu başına 2-4 mL izolasyon ortamı) izolasyondan yaklaşık 30 dakika önce orta ekleyin ve % 5 CO₂ile nemlendirilmiş 37 °C inkübatörde dengeleyin.
3. DMEM'i (Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium'u 4,5 g/L glikoz ve sodyum piruvat ile) %20 FBS (fetal sığır serumu) ve %1 tavuk embriyosu özü ile destekleyerek miyober kültür ortamını hazırlayın, 0,22 μm filtreden filtreleyin. Önceden kaplanmış kültür plakalarının (24 kuyu plakası) her kuyusuna izolasyondan yaklaşık 30 dakika önce 0,5 mL orta ekleyin ve % 5 CO₂ile nemlendirilmiş 37 °C inkübatörde dengeleyin.
4. DMEM'de (Dulbecco'nun 4,5 g/L glikoz ve sodyum piruvatlı modifiye Eagle's medium) %0,2 (w/v) kollajenaz tip 1'i (Clostridium histolyticum'dan)çözerek kollajenaz sindirim solüsyonunu hazırlayın, 0,22 μm filtreyi filtreleyin. İki EDL(ekstansör digitorum longus)kasları için steril 15 mL reaksiyon tüpünde 2,5 mL kollajenaz çözeltisi kullanın. Ek olarak, çözeltiyi izolasyona başlamadan önce 37 °C'de sirkülasyonlu bir su banyosunda ~10 dk önceden ısıtın.
5. Kollajenaz sindirilmiş kasların olgunlaşması için steril Pasteur pipetler hazırlayın. Pasteur pipetlerini kesmek için elmas bir kalem kullanın.
   1. Her fare için, yaklaşık 0,3 cm açıklığı ve yaklaşık 10-12 cm uzunluğunda bir büyük delik pipet ve yaklaşık 0,1 cm küçük bir açıklığa ve yaklaşık 22 cm uzunluğa sahip ikinci bir cam pipet kullanın (Şekil 2F).
   2. Bunsen brülörün alevi ile ısı parlatarak her iki pipetin kenarlarını yumuşatın. Keskin cam kenarlar yumuşayana kadar eşit ısı dağılımı sağlamak için pipet ucunu 5-10 sn boyunca alevin içine hafif bir hareketle tutun.
   3. Kullanmadan hemen önce, her iki cam pipet türünü de steril HS ile kaplayın, tüm pipeti 5 dakika boyunca ~ 2 mL HS ile doldurun, daha sonra HS'yi dışarı atın ve pipetlerin RT'de 5 dakika kurumasına izin verin.

2. EDL kas izolasyonu ve kollajenaz sindirimi

1. Kirlenmeyi önlemek için tüm ekipmanları % 70 etanol ile püskürtün.
2. Hayvan deneyleri için ulusal düzenlemelere uygun olarak fareyi kurban edin.
3. Farenin arka ayaklarını% 70 etanol ile püskürtün. Cildi çıkarmak ve alttaki kasları ortaya çıkarmak için sertleştirilmiş ince kavisli makas (24 mm kesme kenarı) ve ince tokalar (Dumont 7, kavisli veya düz) kullanın. Alttaki kasların kürkle herhangi bir temasından kaçının (bulaşma riskini arttırır).
4. Alttaki kaslara zarar vermeden ince kavisli antileps ile çevredeki fasyayı çıkarın (Şekil 2A). Bükülmeyi önlemek için tokaları kapatın.
5. TA (tibialis ön) ve EDL kasının distal tendonlarını ortaya çıkarmak için kavisli önkseçimler kullanın. TA'yı çıkarmak için distal TA tendonunu önps ile tutun ve ince Vannas yay makası (5 mm kesme kenarı, 0,35 mm uç çapı) ile kesin. TA'yı tendonda tutarken, dizine doğru çekin ve kası dizine yakın kesin (Şekil 2B), EDL kası artık açığa çıkar.
   NOT: Bu adımda yalnızca TA tendonu kapıldığından emin olun, aksi takdirde alttaki EDL zarar görebilir. TA kasını keserken dizdeki tendonların daha sonra kolayca görülebildiğinden emin olun.
6. Distal EDL tendonu ince kavisli önps ile kaldırın ve ince Vannas yay makası ile kesin (Şekil 2C). EDL'i dizine doğru dikkatlice çekerek proksimal EDL tendonu ortaya çıkın. Proksimal tendonu ince Vannas yay makası ile kesin. EDL kasını adım 1.4'ten 15 mL reaksiyon tüpündeki 37 °C önceden ısıtılmış 2.5 mL kollajenaz sindirim çözeltisine aktarın. (Şekil 2D).
   NOT: Proksimal EDL tendonunu tamamen ortaya çıkarmak için dış diz bağ dokusunda küçük bir kesi yapın. Sadece tendonları tuttuğunuzdan ve EDL'yi çok fazla germediğinden emin olun.
7. 2.3. adımları yineleyin. 'yi 2,6'ya kadar karşılastır. ikinci EDL ile. Her iki EDL kasını da 2,5 mL kollajenaz sindirim çözeltisi ile dolu aynı 15 mL reaksiyon tüpüne ekleyin.
8. EDL kaslarını 37 °C'de reaksiyon tüpünde sirkülasyonlu bir su banyosunda kuluçkaya yatırın.
   NOT: Kuluçka süresi kollajenaz aktivitesi, farenin yaşı ve fibrotik doku miktarı gibi çeşitli faktörlere bağlıdır. Yetişkin farelerin EDL kasları için tipik kuluçka süresi (2-6 aylık) 1-1,5 saat ve yaşlı fareler (18 aylık) 1,5-2 saattir.
9. Kasların aşırı sindirimini önlemek için, sindirim süresi boyunca kasları kontrol edin. Kaslar gevşediğinde ve tek miyofiberler görünür olduğunda sindirimi durdurun (Şekil 2E). Kasları büyük delikli pipetle miyofiber izolasyon ortamı içeren önceden ısıtılan 12 kuyulu plakanın ilk kuyusuna dikkatlice aktarın (Şekil 2G).

3. Myofiber ayrışması ve kültürü

1. Aşağıdaki adımlar için tercihen ısıtma plakası (37 °C) ile donatılmış bir stereo dürbün mikroskobu kullanın. Tek miyofiberler serbest bırakılana kadar kasları ılık izolasyon ortamıyla yıkamak için büyük delikli pipeti kullanın. İstenilen sayıda miyofiber çözeltide serbestçe yüzene kadar kasları büyük delikli pipetle ayrıştırın.
   NOT: Hasarlı miyofiber riskini azaltmak için aşırı tritürasyondan kaçının. Miyofiber ayrışması için bir ısıtma plakası kullanılması, izolasyon işlemi sırasında sıcaklık düştüğünden ve bu da miyofiber ölümle sonuçlanacağından şiddetle tavsiye edilir.
2. HS kaplı küçük deliklicam pipet ile sözleşmeli olmayan miyofiberleri, enkazı yıkamak için izolasyon ortamı ile dolu ikinci kuyuya aktarın ve sözleşmeli (hasarlı) miyofiberleri(Şekil 2I).
   NOT: İzole miyofiberlerin aşırı hareket etmesini önlemek için ikinci kuyuya aktarılabilir ve daha sonra tritürasyon işlemine devam edilebilir.
3. Sözleşmeye sahip olmayan miyofiberleri tekrar yıkamak için izolasyon ortamı ile dolu bir sonrakine (3^rd)aktarın.
4. Yaklaşık 50-100 sözleşmeye bağlı olmayan miyofiberleri myofiber kültür ortamı içeren 24 kuyulu tabağa aktarmak için HS ile kaplanmış küçük delikli cam pipeti kullanın.
5. 37 °C'de kuluçka miyofiberleri, özel süre için% 5 CO₂ (maksimum 96 saat önerilir).
   NOT: MüSC'ler 42 saatlik kültürden sonra düzlemsel veya apikal bazal olarak bölündükten sonra bölünür. Ayrıca, 72 saatlik kültürden sonra MÜSC'ler kendi kendini yenileyen, çoğalan veya taahhüt edilen (farklılaştırılmış) MÜSC'lerden oluşan çok hücreli kümeler oluşturur.

4. siRNA transfection

1. Miyober izolasyondan 4 saat sonra, myofiber ilişkili MüSC'leri (500 μL kültür ortamı ile doldurulmuş 24 kuyu plakasının bir kuyusunda 50-100 sözleşme dışı myofiber) lipid bazlı transfeksiyon reaktifi ile, örneğin RNAiMAX üreticinin protokolüne göre 5 pmol siRNA nihai konsantrasyonda transfect. Bu nedenle, transfeksiyon reaktifinin 1,5 μL'sini içeren 25 μL Opti-MEM'e ilgili siRNA hacmine sahip 25 μL Opti-MEM ekleyin. Reaksiyon karışımını 5 dakika kuluçkaya yaslayın ve daha sonra 500 μL kültür ortamına ekleyin.
   NOT: 24 saat veya 48 saat sonra ikinci bir transfeksiyon, örneğin 48 saatten fazla daha uzun kültür dönemleri için önerilir. Transfeksiyondan sonra ortam değişikliği gerekli değildir.

5. Fiksasyon ve IF boyama

1. İmmün yetinme için stereo dürbün mikroskobu kullanın. Aşağıdaki adımlardaki tüm birimler 24 kuyulu bir plakanın bir kuyusuna ayarlanır. HS kaplı küçük delikli pipet kullanarak aşağıdaki tüm adımları gerçekleştirin.
2. Kuyuda bir çözelti bırakırken miyofiber kültür ortamını dikkatlice atın (24 kuyu başına yaklaşık 100 μL). Myofiberlerin yüzdülmasına izin vermek için aksi belirtilmedikçe, bunu diğer tüm adımlar için yapın. Miyofiberleri bitişik MuSC'leriyle sabitlemek için 500 μL% 2 PFA ekleyin, oda sıcaklığında (RT) 5 dakika kuluçkaya yatırın.
3. Süpernatant'ı dikkatlice çıkarın ve myofiberleri PBS ile üç kez yıkayın (her biri RT'de 5 dakika boyunca pH 7.4, 500 μL).
4. 500 μL permeabilizasyon çözeltisi ekleyin (%0,1 Triton X-100, PBS'de 0,1 M Glisin, pH 7,4), RT'de 10 dakika kuluçkaya yat.
5. Permeabilizasyon çözümünü çıkarın ve RT'de 1 saat boyunca 500 μL engelleme çözümü (PBS'de %5 HS, pH 7,4) ekleyin.
   NOT: Spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için birincil antikorlar için önerilen engelleme çözeltisini kontrol edin.
6. Engelleme solüsyonunu çıkarın ve kuyu başına 300 μL birincil antikor seyreltme (örneğin, Anti-Pax7 (PAX7, DSHB, seyreltilmemiş), anti-MyoD (klon G-1, Santa Cruz, 1:200)) ekleyin. Gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yaslanın.
7. Kuyu başına 500 μL PBS ile üç kez yıkayın (RT'de 5 dk).
8. PBS'yi çıkarın ve kuyu başına 300 μL ikincil antikor seyreltme (örneğin, fare-IgG1-546 ve anti-fare-IgG2b-488 1:1000) ekleyin. RT'de ışıktan korunan 1 saat kuluçkaya yatın. Aşağıdaki adımlar için hafif azaltılmış koşullar önerilir.
9. Kuyu başına 500 μL PBS ile iki kez yıkayın (RT'de 5 dk).
10. RT'de 5 dakika boyunca kuyu başına 500 μL çözelti (son DAPI konsantrasyonu 10 μg/mL) kullanarak DAPI boyama işlemi gerçekleştirin.
11. Kuyu başına 500 μL PBS ile iki kez yıkayın (RT'de 5 dk).
12. Miyober içeren sıvının dökülmesini önleyecek bir su itici bariyer oluşturmak için mikroskobik bir cam kaydırağa daire çizmek için hidrofobik bir kalem kullanın. Miyoberleri mümkün olan en küçük hacimde mikroskobik cam kaydırağa aktarın ve cam kaydırağa dağıtın.
    NOT: Miyoberlerin mikroskobik cam kaydırağın üzerine fiziksel olarak çekilmesinden kaçının, çünkü bu, kümelerin miyoberlerden kopmasıyla sonuçlanan sürtünmeye neden olabilir.
13. Kalan sıvıyı küçük delikli Pasteur pipet veya 200 μL pipet ile çıkarın.
14. İki damla sulu montaj ortamı kullanın ve miyofiberleri bir kapakla örtün. Slaytları üretici tarafından önerilen süre boyunca kurutun. Slaytları karanlıkta 4 °C'de saklayın.

Sonuçlar

Bu protokol, murine EDL kaslarından ilişkili MüSC'leri ile tek miofiberlerin başarılı türetimi ve kültürü için talimatlar sağlar. Protokolün temel adımları Şekil 1'de özetlenmiştir. EDL kaslarının dikkatli tendondan tendona diseksiyonu (Şekil 2A-C) canlı miyofiberlerin yüksek verimi için kritik öneme sahiptir. Kas ayrışması ilk olarak kollajenaz sindirimi (Şekil 2D) ve ardından fiziksel tritürasyon (Şekil 2G) ile elde edilir. Bozulmamış miyofiberler (Şekil 2H) kültürlüdür, oysa hiperkreptif ve ölü miyofiberler (Şekil 2I) kültür ve analizden çıkarılmalıdır.

İzolasyon sürecinde MÜSC'ler myofiber ile ilişkili olmaya devam eder. Transkripsiyon faktörü pax7 için immünofluoresans boyama tanımlar ve izolasyon sürecinin tamamlanmasından hemen sonra sabitlendiğinde myofiber başına myonuclei bolluğundan7-9MuSC çekirdeğini ayırır ( Şekil 3A ). Şekil 3B, miyotülün hücre altı miofibriyal yapısını ortaya çıkaran ve bir MüSC'nin çekirdeğinde Pax7 immünofluoresans sinyalini gösteren ek brightfield kanalı ile Şekil 3A'dan büyütülmüş bir alan göstermektedir.

Miyober ilişkili MüSC'lerin aktivasyonu ve miyojenik ilerlemesi miyojenik belirteç ekspresyonu ile analiz edilebilir. Taze izole miyoberlerle (0 h) ilişkili olarak, Pax7 ifadesi ve MyoD ifadesinin yokluğu ile karakterize edilen ve böylece in vivo homeostatik bir duruma benzeyen çoğunlukla sessiz MüSC'ler bulunabilir(Şekil 4, 0 h). Diseksiyon/dissosiyelasyon prosedürü ve miyober kültür medya kompozisyonu nedeniyle, MÜSC'ler ilk bölünmelerini geçirdiği 42 saatte gözlemlenebildiği gibi çoğalma sağlamak için transkripsiyon faktörü MyoD'yi hızla aktive eder ve yükseltir(Şekil 4, 42 h). 72 saatlik kültürden sonra, MUSC'ler farklı miyojenik belirteçlerin ifade kalıplarıyla paralel olan farklı miyojenik kaderlere sahip soy kümeleri oluştururlar(Şekil 4, 72 h). Pax7+ sadece hücreler farklılaşmaya direnir ve kendini yenileyen kök hücreler haline gelir. Pax7+ ve MyoD+ çift pozitif hücreler proliferatiftir, ancak MyoD+ sadece hücreler miyojenik soy boyunca daha da ilerlemiş ve farklılaşacaktır.

Miyofiber kültür sistemi, bu protokolde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, bunlardan biri siRNA transfection olan çeşitli müdahalelerle MuSC aktivitesinin verimli bir şekilde müdahalesini sağlar. Myofiber ilişkili MüSC'lerin transfeksiyon verimliliğini izlemek için floresan etiketli hedefsiz siRNA transkrna transkred edildi. Pax7 pozitif MüSC'ler, verimli alımı gösteren granül benzeri bir şekilde sitoplazmik siRNA biriktirmiştir (Şekil 5A). Miyoberlerin sitoplazmasında, izolasyondan sonra 4 saat içinde miyoberlerde doğal bir alım bariyeri olduğunu ve siRNA transfeksiyonunun özellikle MuSC'leri hedef aldığını düşündüren floresan granüller gözlenmedi. Pozitif olarak transe edilmiş Pax7+ hücrelerinin myofiber başına ölçülmesi, tüm MuSC'lerin yarısından fazlasının, ilk bölüm turunun 24 saatte tamamlanmasından hemen önce görünür miktarlarda floresan olarak siRNA etiketlendiğini ortaya koydu. Transfected Pax7+ hücrelerinin sayısı 30 saat sonra% 74'e kadar daha da artmıştır (Şekil 5B). Ayrıca, her iki zaman noktasında transfected veya transfected olmayan durumların myofiber başına Pax7+ hücrelerinin sayısında bir fark yoktu ve transfeksiyon prosedürü nedeniyle kök hücre sayıları üzerinde hiçbir olumsuz etki göstermedi (Şekil 5C).

Özetle protokol, EDL tek miyofiberlerinin bitişik kas kök hücreleri ile izolasyonu ve kültürünün ayrıntılı bir açıklamasını sunmaktadır. İmmünofluoresans bazlı analizlerle miyofiber ilişkili kas kök hücre aktivitesi ex vivo'nun incelenmesini sağlar. Kas kök hücrelerinin siRNA transfeksiyonu ile manipülasyonu verimlidir ve fonksiyonel analizler için metodolojik bir temel oluşturur.

Şekil 1: Temel adımların şematik özeti. İzolasyon ve immün yetinme prosedürünün temel adımları bu şekilde özetlenmiştir. Kısaltmalar: DMEM, Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortası; FBS, Fetal Sığır Serumu; CEE, Tavuk Embriyosu Özü; TA, tibialis ön; EDL, extensor digitorum longus Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Fare EDL diseksiyonu ve tek miyober izolasyonu. (A) Fare arkalığının derisi çıkarılır ve FASYA'yı çevreleyen kas, TA (tibialis ön) kasını ortaya çıkarmak için çekilir. (B) Ta kası, beyaz okla işaretlenmiş EDL (ekstansör digitorum longus) kasını açığa çıkarmak için çıkarılır. (C) EDL kası tendonları kesilerek kesilir. (D) İki EDL kası kollajenaz sindirilir. (E) Kollajenaz sindirilmiş kas görünümü doku çekirdeğinden gevşeyen görünür tek miyofiberler ile. (F) Büyük ve küçük delikli Pasteur pipet ile ölçek. (G) EDL kasları (siyah oklarla işaretlenmiş) büyük bir delikli Pasteur pipet kullanılarak fiziksel olarak üçe alınır. (H) Tek sağlam miyofiberler ince ve parlaktır ve kültür ve analiz için ayrı ayrı toplanabilir. (I) Hiperkoşulu ve ölü miyofiberler kültür ve analiz için uygun değil. 2H ve 2I'nin mikroskobik görüntüleri N-Achroplan 5x hedefi kullanılarak mikroskopla çekildi. Ölçek çubukları 200 μm'dir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Tek bir miofiberin mikroskobik görüntüsü ve ilişkili MüSC'leri. Genç C57BL/6 farelerin EDL'sinden tek miyofiberler hazırlandı ve izolasyondan sonra PFA sabitlendi (0 h). (A) Pax7 ve DAPI immünofluoresans boyama, miyofiber ilişkili kas kök hücrelerini tanımlar (Oklarla işaretlenmiş MÜSC'ler). Mikroskobik görüntü, Plan-Apochromat 40x yağ hedefi ile donatılmış bir mikroskobun karoları ve z-yığını işlevi kullanılarak çekildi. Ölçek çubuğu 200 μm. (B) Büyütme (A) mionuclei, bir Pax7 pozitif çekirdek ve parlak alanda miofibriner yapılardan parlak-koyu desen gösteren. Ölçek çubuğu 10 μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Tek miyober kültürü sırasında MuSC aktivasyonu ve miyojenik ilerlemenin immünofluoresans görüntüleri. Yeni izole edilmiş miyoberlerin (0 h) kas kök hücreleri (MuSCs), Pax7 ekspresyonu ve MyoD ekspresyonu eksikliği ile karakterize, in vivo sessize almaya yakın bir homeostatik durumu temsil eder. Tek miyober kültürü sırasında çoğu MUSC MyoD'yi yükseltir ve bölmek ve çoğalmak için hücre döngüsüne yeniden girer (42 saat). 72 saat kültürden sonra MuSC kaderi miyojenik işaretleyici ifadesine göre ayırt edilebilir. Pax7 yalnızca ifade edilen hücreler kendi kendini yeniler (kırmızı ok) oysa Pax7 ve MyoD çift pozitif hücreler (kırmızı/yeşil ok) çoğalmaya devam eder. MYOD sadece pozitif hücreler (yeşil ok) miyojenik farklılaşmayı taahhüt etmiştir. Mikroskobik görüntüler, Plan-Apochromat 20x hedefi (0 h, 42 h) veya LD Plan-Neofluar 40x hedefi (72 saat) olan bir mikroskop kullanılarak çekildi. Ölçek çubukları 20 μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: MüSC'lerin floresan siRNA transfeksiyonu ve alım analizi. EDL tek miyoberler, bu protokolün sağladığı adımları izleyerek floresan etiketli siRNA (siGLO) ile hazırlandı ve trans enfekte edildi. (A) SiGLO granüllerinin sitoplazmatik birikimi özellikle Pax7 pozitif kas kök hücresinde (MuSC) 30 saat kültürde tek bir miyofiber üzerinde. Mikroskobik görüntü, Plan-Apochromat 100x yağ hedefine sahip bir mikroskobun z-istifi ve apotom işlevi kullanılarak çekildi. Ölçek çubukları 5 μm' dir. (B) Pax7 pozitif kas kök hücreleri tarafından 24 veya 30 saat kültürde siRNA alımının nicelleştirilmesi. (C) Tek bir miyofiber başına 24 veya 30 saatlik kültürde transfected olmayan ve transfected olan durumları karşılaştıran Pax7 pozitif hücre sayısı. Veriler standart n = 4 fare sapma ile ortalama olarak gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

Burada, in vitro bir yaklaşım kullanarak belirli bir genin MuSC'lerdeki rolünü işlevsel olarak araştırmak için bir yöntem sunulmuştur. Daha da önemlisi, burada açıklanan sistemde, MUSC'lerin nişleriyle etkileşimlerinin çoğunu koruyarak mümkün olduğunca in vivo duruma benzeyen koşullarda MuSC'ler kültürlenir. Bu, izole edilmiş miofiberlerin yüzen koşullar ve ardışık siRNA transfeksiyonları altında bitişik MuSC'leri ile kült ederek gerçekleştirilir. İmmünofluoresans analizleri ile 72 saat kültür sırasında miyofiber izolasyon, siRNA transfeksiyonu ve MuSC popülasyonlarının araştırılması prosedürleri açıklanmaktadır. Ayrıca, tüm MuSC'lerin yaklaşık% 74'ünün 30 saat kültürden sonra floresan etiketli bir kontrol siRNA ile transkred olduğu gösterilmiştir.

Özellikle dikkat, EDL kasının dikkatli bir şekilde diseksiyonu üzerine odaklanmalıdır, çünkü geniş germe, sıkışma veya sıkma miyofiberlerin kasılmasına ve ardışık ölümüne yol açacaktır. Ayrıca, her koşul için çoğaltma başına en az 20 farklı miyofiberden MuSC kümelerini araştırmak önemlidir. MuSC sayıları ve özellikleri, MuSC alt nüfuslarının varlığı nedeniyle değiştiğinden, bu gereklidir. Yüzen miyofiber kültür yöntemini kullanarak belirli bir siRNA'nın MuSC'ler üzerindeki etkisi araştırılırken, durumun hedefleme siRNA ile hedefleme olmayan kontrol ile karşılaştırılması aynı fare ve kas içinde yapılmalıdır. Bu, siRNA'nın etkilerini kapsayabilecek veya güçlendirebilecek fareye özgü farklılıkları önlemek için önerilir. Nakavt verimliliği, bitişik MuSC'leri ile tek miyofiberler kullanılarak hedef genlere karşı yönlendirilen antikorlarla immünofluoresans analizleri ile belirlenebilir. Bu bir seçenek değilse, birincil mioblastlarda siRNA devirme verimliliğini ve ardından nicel RT-PCR veya immünoblot analizlerini test edebilirsiniz. SiRNA'nın MüSC'ler üzerindeki etkisini tek miyofiberler üzerinde analiz etmeden önce siRNA'nın verimliliği belirlenmelidir. Tek bir sineye karşı 4 farklı siRNA'dan oluşan akıllı havuzun kullanılması, nakavt verimliliğini artırırken, belirsiz hedefleme riskini de artırır. Hedeflemeyen bir siRNA kontrol olarak kullanılmalıdır. Transfection verimliliğini doğrudan izlemek için, burada gerçekleştirilen gibi floresan etiketli hedefsiz siRNA kullanılabilir. SiRNA ile transfection için zaman noktası, izolasyondan yaklaşık 4 saat sonra, MuSC'leri çevreleyen bazal laminanın siRNA için zaten geçirgen olduğu bir zaman noktasıdır. Belirli bir siRNA'nın 72 veya 96 saat sonra MuSC'ler üzerindeki etkisi araştırılırsa, yüksek nakavt verimliliğini korumak için 24 saat veya 48 saat sonra ikinci bir siRNA transfeksiyonu yapılması önerilir.

Myofiber kültür tahlilleri, geleneksel hücre kültürü yöntemleriyle MuSC'lerin araştırılmasına kıyasla çeşitli avantajlar sergiler. MüSC'ler tüm izolasyon sürecinde miofiberlere bağlı kalır, böylece MuSC'nin^{niş 19,}23 ,^24,25ile önemli etkileşimini korur. MuSC'lerin miofiber ile korunmuş etkileşimi, geleneksel 2D mioblast kültürlerinde yeniden ele alınamayan MuSC işlevselliği üzerindeki niş bağımlı etkileri incelemek için bir ön koşuldur. Örneğin, yaşlanma sırasında MUSC'ler bozuk miyojenik kapasiteyi gösterir ve hasar^20,26'dansonra kas dokusunu yenilemek için daha az verimlilik sağlar. Bu bozukluk en azından kısmen MuSC nişindeki değişikliklere, özellikle ECM bileşimindeki değişikliklere atfedilebilir^27,28. Miyofiber kültür protokolü, çalışmanın ve bu sapkın niş değişikliklere müdahaleye izin verir.

Burada açıklanan yöntemin aksine, MUSC'lerin immünoplabeling ve -sorti teknikleri ile saflaştırılması FACS (floresan aktif hücre sıralama) veya MACS (manyetik hücre sıralama) gibi MUSC'lerin nişlerinden uzaklaştırılmasını içerir. İlginçtir ki, yaşlı kaslardan izole edilmiş MüSC'lerin 2D kültürleri dışsal ipuçlarını kaybeder ve genç kaslardan izole edilen MuSC'lere benzer davranır, böylece in vivo durumu uygun şekilde yeniden yakalamaz²⁹. Ayrıca, kas dokusunun tamamen ayrışması ve MuSC'lerin yüzey belirteçleri ile etiketlenmesi transkriptomik değişikliklere ve hücrelerin aktivasyonuna neden olur^30,31,32. Miyofiber kültür sisteminin bir diğer avantajı, çeşitli seviyelerde MuSC işlevselliğine müdahale etme imkanıdır. MuSC'lerin kültürlü miyofiberler üzerindeki manipülasyonu, burada ayrıntılı olarak açıklandığı gibi siRNA aracılı gen devrilmesi ile etkili bir şekilde elde edilebilir. Aynı şekilde, kimyasal bileşiklerin uygulanması veya rekombinant proteinlerin teslimi kök hücre yollarına müdahale etmek için çok etkilidir^20,28. Ayrıca, retro veya lentiviral ekspresyon vektörleri eksojen genlerin, yani konsitatif aktif mutantların tanıtılmasına izin eder³³. Ek olarak, dışsal faktörlerin MuSC işlevselliği üzerindeki etkisi burada açıklanan sistemde araştırılabilir, örneğin, kültür koşulları kanser cachexia^{34 , 35}gibi farklı durumları modellemek için farklı fizyolojik veya patolojik kaynaklardan gelen üstünlüklerle desteklenebilir.

Burada açıklanan yöntemin bir sınırlaması, tek miyofiber kültür sisteminin tüm sistemik faktörlerin veya diğer hücre türlerinin MuSC'ler üzerindeki etkisini tamamen nüksedemeyeceği gerçeğidir. Ayrıca, miyoberlerin kültürde canlı tutulabileceği süre sınırlıdır ve bu nedenle MuSC ile ilgili süreçlerin incelenmesi aktivasyon ve miyojenik bağlılık gibi erken olaylara odaklanmaktadır. Ayrıca, bağışıklık hücreleri veya fibro-adipojenik progenitör hücreler gibi diğer niş hücrelerle MuSC etkileşiminin araştırılması mümkün değildir. MuSC işlevselliği üzerindeki sistemik etkileri araştırmak için, kas yaralanması deneylerini ve ardından kas yenilenmesinin analizini in vivo yapabilir veya transplantasyon deneyleri^{yapabilirsiniz 36,37}.

Birlikte ele alındığında, miyofiber izolasyon ve kültür protokolü, transgenik fare modellerine ihtiyaç kalmadan yetişkin MüSC'ler üzerinde genetik veya mekanistik çalışmalar için büyük bir fırsat sağlar ve potansiyel olarak hayvan deneylerini azaltabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG 2b	ThermoScientific	A-21141	use 1:1000 for IF
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1	ThermoScientific	A-21123	use 1:1000 for IF
chicken embryo extract	Seralab	CE-650-J	chicken embryo extract containing growth factors etc.
collagenase type 1	Sigma	C0130
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5 g/l glucose and sodium pyruvate)	GibCo	41966029	cell culture medium
fetal bovine serum	Gibco	10270-106	fetal bovine serum
horse serum	Gibco	26050-088
Lipofectamine RNAiMax	ThermoScientific	13778150	transfection reagent
MyoD antibody clone G-1	Santa Cruz	sc-377460	dilute 1:200 for IF
Pax7 antibody	DSHB	PAX7	use undiluted
siGLO Red Transfection Indicator	horizon discovery	D-001630-02-05	non targeting siRNA