Transkraniyal Fonksiyonel Ultrason Görüntüleme Kullanan Farelerde Tüm Beyin 3D Aktivasyon ve Fonksiyonel Bağlantı Haritalaması

Özet

Bu protokol, fonksiyonel ultrason (fUS) kullanarak fare beynindeki hacimsel serebral hemodinamik varyasyonların nicelliğini açıklar. Duyusal stimülasyonun yanı sıra dinlenme durumu fonksiyonel bağlantısını takip eden 3D fonksiyonel aktivasyon haritası prosedürleri, uyuşturulmış ve uyanık farelerde açıklayıcı örnekler olarak sağlanır.

Özet

Fonksiyonel ultrason (fUS) görüntüleme, ultra hızlı doppler anjiyografi ile elde edilen serebral kan hacminin yüksek hassasiyet ölçüsüne dayanan yeni bir beyin görüntüleme yöntemidir. Beyin perfüzyonu yerel nöronal aktiviteye güçlü bir şekilde bağlı olduğundan, bu teknik, görev kaynaklı bölgesel aktivasyonun tüm beyin 3D haritalandırılmasına ve aynı anda eşsiz mekansal-zamansal çözünürlük ve operasyonel basitlik ile invaziv olmayan dinlenme durumu fonksiyonel bağlantısına izin verir. fMRI (fonksiyonel manyetik rezonans görüntüleme) ile karşılaştırıldığında, fUS görüntülemenin ana avantajı uyanık ve davranışlı hayvan deneyleriyle tam bir uyumluluk sağlamaktır. Ayrıca, Nörobilimde en çok kullanılan preklinik model olan farelerde fMRI beyin haritalaması, beynin küçük boyutu ve istikrarlı fizyolojik koşulları koruma zorluğu nedeniyle teknik olarak zor olmaya devam etmektedir. Burada, motorlu doğrusal dönüştürücülü raf dışı ticari bir fUS sistemi kullanarak uyuşturulmuş ve uyanık farelerde tüm beyin fUS görüntülemesi için basit, güvenilir ve sağlam bir protokol sunuyoruz, duyusal stimülasyonun yanı sıra ağ tanımlaması için tekrarlanabilir 3D fonksiyonel bağlantı desenini takiben önemli kortikal aktivasyon sağlar.

Giriş

Son yirmi yılda, nörogörüntüleme, beyin fonksiyonlarını ve organizasyonunu incelemek için önemli bir araç haline geldi ve araştırmacıların nörobilim alanında önemli keşifler yapmalarını sağladı. Günümüzde fonksiyonel manyetik rezonans görüntüleme (fMRI), görev veya ilaçla uyarılan beyin aktivasyonunu değerlendirmek ve istirahatte fonksiyonel bağlantıyı haritalamak için altın standart klinik nörogörüntleme tekniği haline gelmiştir. İnsan fMRI yüksek güvenilirlik ve duyarlılığa sahip olsa da, fare fMRI teknik olarak çeşitli nedenlerle zorlu olmaya devam eder¹. İlk olarak, fMRI zayıf bir mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahiptir. Fare beyninin küçük boyutu, makul uzamsal çözünürlük elde etmek için pahalı tarayıcılar kullanarak güçlü manyetik alanların kullanılmasını gerektirir. İkincisi, etkili nöro-vasküler kavramaya izin vermek için dar aralıkta kararlı fizyolojik parametrelerin korunması anestezik farelerde çok zordur. Son olarak, fMRI çalışmalarının dayandığı kan oksijen seviyesine bağımlı (BOLD) sinyal nispeten zayıf hassasiyete sahiptir, bu da farelere uygulandığında düşük sinyal-gürültü oranına yol açar ve genellikle küçük varyasyonları tespit etmek için uzun alım üzerinde tekrarlanan uyaran sunumu gerektirir. Fare biyomedikal preklinik araştırmalarda en yaygın kullanılan hayvan modelidir, bu sınırlamalar nöropsikiyatrideki çevirisel boşluklardan kısmen sorumludur ve tezgahtaki yeni umut verici terapötik hedeflerin başucunda etkili tedavilere dönüştürülmesine engel olur.

Fonksiyonel ultrason (fUS), ultra hızlı doppler^2'yedayanan yakın zamanda geliştirilmiş bir nörogörüntüleme tekniğidir. Serebral kan hacmini doğrudan örneklemekle, bu teknik beyin aktivitesini nörovasküler kavrama yoluyla gerçek zamanlı olarak yoklamayı sağlar. Diğer nörogörüntüleme teknikleriyle karşılaştırıldığında, fUS 100 μm'lik bir mekansal çözünürlük ve onlarca milisaniyede zamansal bir çözünürlük sağlar. Bu teknik, fare beyninin tam koronal bölümlerinin tamamen invaziv olmayan bir şekilde tüm beyinle görüntülenmesini sağlar. Ayrıca, bilinçli ve davranan hayvanlarla tamamen uyumludur^3,4,5. FUS'un ana akım sınırlamalarından biri, aynı anda tek bir koronal düzlem kaydetmeye izin sağlayan 2D özelliğidir. 2D matris dizisi dönüştürücüleri kullanan hacimsel 3D fUS zaten sıçanlarda^başarıyla gösterilmiştir 6 ve farelerde^{onaylanmıştır 7}, mevcut hassasiyet eksikliği tam bir kraniyotomi gerektirir ve hafif bir aktivite değişikliğini tespit etmek için önemli sayıda denemenin ortalamasını gerektirir. Alternatif olarak, doğrusal dönüştürücüler birden fazla konuma basılabilir ve tüm beyni kapsayacak şekilde düzlemle fonksiyonel görüntüleme düzlemi gerçekleştirebilir. Bununla birlikte, bu teknik çok sayıda deneysel paradigma tekrarı gerektirir ve bu kadar uzun alım süreleri (fare beyni için 3-4 saat)^8,9.

Mevcut çalışmada, ticari olarak mevcut bir fonksiyonel ultrason tarayıcısı ve uyuşturulmış ve uyanık farelerde 3D fUS verileri elde etme prosedürlerine sahip hızlı bir düzlem değiştiren doğrusal dönüştürücü içeren sağlam bir deneysel platformu tanımlıyoruz, fare beyninin hacimsel ve transkraniyal fonksiyonel haritalandırılmasına izin veriyoruz, invaziv olmayan, kontrast madde olmadan ve kısa alım süreleri içinde. Bu özelliği, bıyık stimülasyonunun yanı sıra dinlenme durumu fonksiyonel bağlantısını takiben somatosensör korteks aktivasyonunu haritalayarak gösteriyoruz. Hayvan hazırlama ve veri toplamanın yanı sıra, gerçek zamanlı fUS sinyallerinin görselleştirilmesi, atlas kaydı ve analizi prosedürünü de açıklıyoruz.

Protokol

Burada sunulan tüm prosedürler, 22 Eylül 2010 'daki Avrupa Topluluk Konseyi Direktifi (010/63/UE) ve yerel etik komitemiz (Comité d'éthique en matière d'expérimentation animale number 59, 'Paris Centre et Sud', proje #2017-23) ile aynı şekilde gerçekleştirilmiştir. Yetişkin fareler (erkek C57BL/6 Rj, yaş 2-3 ay, 20-30 g, Janvier Labs, Fransa'dan) 12 saat ışık / karanlık döngü, 22 ° C'de sabit sıcaklık ve yiyecek ve su ad libitum ile kafes başına 4 barındırıldı. Deneyler başlamadan önce, hayvanlara barınma koşullarına bir haftalık minimum iklimlendirme süresi verilir.

1. Uyuşturuldu fUS görüntüleme için hayvan hazırlığı

1. Anestezi
   1. Fareyi tartın.
   2. Steril salinde sırasıyla 10 mg/mL ve 2 mg/mL'de ketamin ve ksilazin karışımı hazırlayın. 26 gauge iğne ve 1 mL tek kullanımlık şırınga kullanarak ketamin/ksilazin çözeltisinin 0,2 mL'lik kısmını intraperitoneally olarak geçirin. Birkaç dakika sonra, hayvanı stereotaksik çerçeveye yerleştirin ve başın düz olduğundan emin olun.
   3. Toplam 100 mg/kg ketamin ve 20 mg/kg ksiline (başlangıç dozu dikkate alınarak) ulaşmak için ikinci bir anestezi hacmi uygular.
      NOT: Anestezi 1 saat sürmelidir. Daha uzun süre sabit bir sedasyon sağlamak için, ketamin / ksilazin karışımının 0.05 mL'lik kısmını intraperitoneal olarak her 30 dakikada bir enjekte edin.
2. Anestezili görüntüleme seansı için hayvan hazırlığı
   1. Görüntüleme seansı sırasında katarakt oluşumunu önlemek için fare gözlerine biraz göz merhemi (örneğin, Ocry-Gel) uygulayın. Bir düzeltici kullanarak fare kafasını tıraş edin. Biraz depilasyon kremi sürün ve birkaç dakika sonra durulayın. Saç tamamen çıkarılana kadar tekrarlayın.
   2. Elektrokardiyogram (EKG) kaydı için uzuvlara deri altı pimleri yerleştirin. Santrifüj ultrason jelini (1500 rpm, 5 dk) kafaya yerleştirin.
   3. Deneylerin tam süresi boyunca anestezinin derinliğini izleyin (anestezi indüksiyonu dahildir). Rektal probla birleştirilmiş bir ısıtma battaniyesi kullanarak hayvanların sıcaklığını 37 °C'de koruyun.
   4. Anestezi derinliğinin dolaylı göstergeleri olan aşağıdaki fizyolojik parametreleri izleyin: Kalp atış hızı (dakikada 220-250 atım - deri altından yerleştirilen elektrokardiyogram ince elektrotlar aracılığıyla izlenir) ve Solunum hızı (dakikada 130-140 nefes - EKG alım sistemine bağlı bir spirometre kullanılarak izlenir).
      NOT: Deneysel kurulumun açıklaması Şekil 1'de gösterilmiştir.

Şekil 1: Anestezi edilmiş fUS deneyleri için deneysel kurulum. Uyuşturulduğu bir deney sırasında ihtiyaç duyulan tüm bilimsel ekipmanı gösteren deneysel kurulumun tanımı. 1. Fizyolojik izleme: hem solunum hem de kardiyak frekansların canlı gösterimi. 2. Iconeus One sistemi (9) tarafından izlenen ve transkraniyal 3D tomografik taramalar veya 4D alımlar yapılmasına izin verilen dört eksenli motor modülü (üç çeviri ve bir dönüş). 3a. Servo-Motor sürüş bıyık stimülatör (3b.) Servo-motor görüntüleme dizileri ile stimülasyon desenleri senkronize etmek için Iconeus One sistemi (9) ile arayüzlü bir arduino uno kart tarafından kontrol edilir. 4.a. Şırınd pompası kontrolörü. 4.b. Şırınd tutucu. 5.a. Isıtma plakasını kontrol eden sıcaklık plakası monitörü. 5.b. Isıtma plakası ve rektal termometre sıcaklık plakası monitörü (5.a.) ile arayüzlenmiş. 6. Ultrason jeli, hayvanın başı ile ultrason probu arasına yerleştirilir ve aralarında akustik bağlantı sağlar. 7. 15 MHz ultrason probu. 8. Probu (7) motor modülüne bağlayan prob tutucu (2). 9. Iconeus One ekipman ve yazılımı, farklı görüntüleme dizilerinin programlanmasına ve motor modüllerinin kontrol altına verilmesine izin verir (2) probu (7)yönlendirerek. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Uyanık kafa sabit fare deneyleri için hayvan hazırlığı

1. Headplate cerrahisi
   1. Uyuşturulduğu hayvanı (adım 1.1-1.2) stereotaksik çerçeveye bir ısıtma yastığına (37 °C) yerleştirin. Gözler için koruyucu jel uygulayın ve 26 kalibrelik bir iğne kullanarak kafa derisi derisinin altına lidokrin s.c. (%0,2 mL, %2) uygulayın ve birkaç dakika bekleyin.
      NOT: Anestezi seviyesini her 10-30 dakikada bir sıkı bir parmak sıkışmasına yanıt olarak (yokluğu) izleyin.
   2. Oksipital kemiğin arkasından burun kemiğinin başına kadar sagittal sütürden sonra bir kesi gerçekleştirin. Cerrahi makas kullanarak, cildi her iki yarımküreye de attırın.
   3. Kafatasını% 1 iyot çözeltisi ile temizleyin ve kalan periosteumu çıkarın. Kafa plakasını şablon olarak kullanarak, ankraj vidalarını konumlandırmak için kafatasında iki delik (1 mm çapında) delin.
      DİkKAT: Beyin hasarlarını veya dura iltihabını önlemek için kafatasını tamamen delmemeye dikkat edin
   4. Kafa plakasını vidalarla yerleştirin. İmplantın iyi tutunmasını sağlamak için vidaları ve ön ve arkadaki kafa plakasını sabitlemek için diş çimentosu kullanın.
      DİkKAT: Sinyal kalitesini büyük ölçüde azalttık için çerçeve penceresinin içine çimento uygulamamaya dikkat edin. Kemiği korumak ve görüntüleme penceresinin yan tarafındaki yaraları kapatmak için kafatasını ince bir cerrahi tutkal tabakası ile örtün.
   5. Çimento kuruduktan sonra hayvanı stereotaksik çerçeveden çıkarın ve anesteziyi 1 mg / kg'da deri altı atipamezol enjeksiyonu ile tersine çevirin. Ameliyat sonrası ağrı için meloksikam profilaktik bir uygulama (5 mg/kg/gün, s.c.) uygulanır.
   6. Hayvanı bir ısıtma yastığına (37 °C) bir geri kazanım kafesine yerleştirin. Fare birkaç saat içinde ev kafesini çöp arkadaşlarıyla geri döndürebilir. Koruma için baş plakasının üzerine manyetik 3D baskılı bir kapak (mıknatıs uçlu poliaktik asit malzemesi) yerleştirin (Şekil 2A). Fareyi, mobil ev kafesine (MHC) alışkanlığın başlamasından 4 ila 6 gün önce iyileşmesi için bırakın.
      NOT: Kapağın ve kafa plakasının toplam ağırlığı 2,8 g'dır.
2. Elleçleme ve alışkanlık
   1. 1. gün iyileşme sonrası (PR), fareyi günde birkaç kez 5-10 dakika hafifçe elinizde tutun.
   2. 2. GÜN PR'da, 1.
      NOT: Odada bazı arka plan müziği çalmak hayvanın stresini azaltmaya yardımcı olabilir.
   3. 3. GÜN PR, hayvanın MHC'yi 5-10 dakika boyunca serbestçe keşfetmesine izin verin. Daha sonra, baş plakayı dikkatlice tutun ve fareye eşlik etmek için karbon kafesini manuel olarak hareket ettirerek kelepçeye hafifçe yerleştirin. Hayvanı 5-10 dakika boyunca kafa sabiti pozisyonunda alışkanlık haline getirin. MHC'yi eğitim seansları arasında %70 etanol çözeltisi ile temizleyin ve musluk suyu ile durulayın.
      NOT: MHC'nin üretici tarafından önerildiği gibi yeterli bir hava akışı aldığından emin olun. Rahat bir konum sağlamak için baş kelepçesinin yüksekliğinin manuel olarak ayarlanması gerekir.
   4. 4. ve 5 PR gününde, fare MHC'yi tekrar tekrar kenetleyin ve 5 dakikadan başlayarak 30 dakikaya kadar kafa sabit süresini kademeli olarak artırın. Alışkanlık haline getirmek için görüntüleme penceresine biraz salin ve ultrason jeli uygulayın.
   5. 6. GÜN PR'da, protokolü 4/5 PR gününden itibaren tekrarlayın ve 3.1 adımını izleyerek probu hayvanın başının üzerine yerleştirin.
   6. Deney günü, yukarıda açıklandığı gibi devam edin. Daha sonra, görüntüleme penceresini salin ile nemlendirin ve biraz ultrason jeli uygulayın. Hayvanın takibini başlatın ve prob konumlandırmasına devam edin (aşağıya bakın).
      NOT: MHC'de sıkıştırma, fareyi bir bez parçasına sararak da yapılabilir. Bu durumda, farelerin kafa sabitlemeden önce sarma prosedürüne alışması gerekir. Şekil 2B'deuyanık görüntüleme için eksiksiz bir deneysel kurulumun açıklaması sağlanmıştır.

Şekil 2: Uyanık fUS deneyleri için deneysel kurulum. A. Görüntüleme penceresini koruyan baş plakası manyetik kapağının şematik çizimi (BioRender.com ile oluşturulur). Görüntüleme seansları sırasında (Sol), baş plakasının sunduğu geniş diyafram açıklığında beyni taramak için kapak çıkarılır. B. Kafa sabitlenmiş serbestçe davranan farelerde transkraniyal uyanık görüntüleme için deneysel kurulumun fotoğrafı. 1. Iconeus One sistemi ve yazılımı, farklı görüntüleme dizileri kurmaya ve motor modüllerini kontrol etmeye izin verir. 2. Iconeus One sistemi (1) tarafından izlenen ve 3D tomografik taramalara veya 4D alımlara izin verilen dört eksenli motor modülü (üç çeviri ve bir döndürme). 3. Hava dağıtım masası. 4. Mobil Ev Kafesi (MHC). 5a,5b. MHC içindeki hayvanın çevresinin daha yakından görüntülenerek çekilen fotoğraflar. 6. Kafa plakasını sıkıştırarak kafa sabitleme sistemi. 7. Probu motor modülüne bağlayan prob tutucu (2). 8. 15 MHz ultrasonik prob. 9. Ultrason jeli fare kafası ve ultrason probu arasına yerleştirilir, aralarında akustik bağlantı sağlar. 10. Bıyıklı uyarıcıyı kullanan Servo-Motor. Servo-Motor, stimülasyon kalıplarını görüntüleme dizileriyle senkronize etmek için TTL sinyali (1) aracılığıyla Iconeus One sistemi ile arayüzlenmiş bir Arduino Uno kartı ile kontrol edilir. C. Farklı uzamsal örnekleme olanaklarının illüstrasyonu (BioRender.com ile oluşturulur): her durumda, prob ilk konumdan son konuma atılır ve yığılmış birimi yeniden oluşturmak için her konumda bir Doppler görüntüsü kaydedilir. Bu işlem tüm satın alma süresi boyunca sürekli olarak tekrarlanır. Yoğun Tarama (solda): hacimsel görüntülemeye izin vermek için dilimler arasındaki adım yeterince küçük olmalıdır (genellikle yükseklik çözünürlüğüne karşılık gelen 400 μm). Seyrek Tarama (sağda): Uzak fonksiyonel bölgeler hedeflenmişse (farklı konumlarda), zamansal örneklemeden ödün vermeden bu bölgelerle kesişen farklı dilimleri görüntülemek için uzamsal örneklemeyi azaltmak da mümkündür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Prob konumlandırma

1. Yazılımı başlatın (örneğin, IcoScan) ve bir deneme oturumu oluşturun. Navigasyon klavyesini kullanarak ultrason probunun konumunu ayarlamak için Sondayı Taşı menüsüne gidin.
   NOT: Prob, hayvanın başının yaklaşık 1 mm yukarısına konumlandırılmalıdır. Herhangi bir görüntüleme dizisine başlamadan önce probun ultrason jeli ile temas halinde olduğundan emin olmak çok önemlidir.
2. Canlı Görüntü alımını başlatın ve gerekirse hayvan CBV'nin (serebral kan hacmi) gerçek zamanlı görüntülemesi ile prob pozisyonunu ayarlayın. Beyni görüntünün ortasına hizalayın. En yüksek sinyal-gürültü oranını yakalamak için görüntüleme parametrelerini optimize edin.
   NOT: Uyanık fare deneylerinde, yanal kas kaslarının kasılmasından kaynaklanan eserlerden kaçınmak için diyafram boyutunun azaltılması gerekir.

4. Anjiyografik tarama ve atlas kaydı

1. Satın alma yazılımında Angio 3D seçeneğini açın. Önceden ayarlanmış panelde, tüm beyni taramak için tarama parametrelerini (ilk dilim, son dilim ve adım boyutu) ayarlayın (Şekil 3A, B) ve alımı başlatın.
   NOT: Tarama parametrelerini ayarlarken, taramanın beynin arka kısmını kaplayacağından emin olun
2. Satın alma yazılımını açık bırakın ve veri analizi ve görselleştirme için yazılımı başlatın (örneğin, IcoStudio) ve anjiyo 3D taramasını yükleyin. 3 görüntülemeli paneli kullanarak alım hacminde gezinin ve Coronal Tarama Yönünüseçin: antero-posterior veya postero-anterior.
3. Beyin Kayıt Paneli'negidin. Kayıt işlemi için gerekli olacak fare başvuru şablonını yükleyin. Tam otomatik veya manuel kayıt modlarını (Şekil 3C) kullanarak taramayı Allen Mouse Ortak Koordinatlar Çerçevesi'ne kaydedin.
4. Anjiyo 3D taramasının ve referans şablonunun süperpozisyona bakarak veya Atlas Manager panelini(Şekil 3D)kullanarak taramanın ve Allen referans atlasının süperpozisyona bakarak sonucu kontrol edin. Kaydı .bps dosyası olarak kaydedin.
   NOT: Kayıt dosyası, aynı deneme oturumu sırasında gerçekleştirilen diğer alımlar için yeniden kullanılabilir.

5. Beyin Konumlandırma Sistemi (BPS)

1. IcoStudio yazılımında, anjiyografik taramanın ve .bps dosyasının (adım 4.4'teoluşturulan) yüklendiğinden emin olun.
2. Beyin Navigasyon Paneli'negidin. Atlas Yöneticisi panelinde, ebeveyn/çocuk ağacı gezgini ile fare Allen beyin atlasında gezinin. Anatomik olarak hedeflenen bölgeleri bulun ve bunları 3 görünümde taramanıza bindirmek için seçin.
3. 3 görünüm panelinde hedeflenen bölgeleri görselleştirin ve deneme için hedeflenen bölgelerle örtüşen bir görüntüleme düzlemi seçin. Bunu yapmak için, koronal konuma ilgi alanlarını içeren iki işaretleyiciyi manuel olarak ayarlayın.
4. Elde edilen motor koordinatlarını çıkarmak için Beyin Konumlandırma Sistemi'ne (BPS) tıklayın. Bu koordinatlar, hedeflenen düzlemi görüntülemeyi sağlayan prob konumuna karşılık gelir. Anjiyo taramasından hesaplanan görüntünün önizlemesini kontrol edin.
5. IcoScan yazılımında, Prob konumlandırma panelini girin ve BPS koordinatlarını girin 'itıklatın. Adım 5.4'teverilen koordinatları uygulayın. Sonda hedeflenen görüntüleme düzleminde hareket eder ve hizalanır.
6. Canlı görüntü alımını gerçekleştirin ve geçerli görüntüleme düzleminin adım 5.4'teverilen tahmine karşılık gelip geldiğini kontrol edin.
   NOT: Parazital/ortogonal olmayan düzlemleri seçmek de mümkündür.

Şekil 3: Hassas prob konumlandırması için hızlı transkraniyal anjiyografik Tarama ve Beyin kaydı. A. Hızlı bir anjiyografik tarama sırasında ilk koronal dilimden (yeşil) son koronal dilime (mavi) kadar ultrasonik prob tarafından transkranially taranan fare beyninin şematik gösterimi. Geçerli görüntülenmiş dilim (kırmızı ile temsil edilir) adım adım arkadan (yeşil) beynin önüne (mavi) hareket eder. BioRender.com B ile oluşturuldu. Angio 3D panelinde IcoScan satın alma yazılımının ekran görüntüsü. Sağdaki hazır ayar parametreleri hızlı taramayı yapılandırır. İlk dilimin mm'sinde, son diliminde ve adım boyutunda konumlar, tüm beyni doğrusal olarak taramak için iyi seçilmelidir. C. IcoStudio işleme yazılımının ekran görüntüsü. Hızlı Anjiyo 3D taraması otomatik olarak fare beyninin bir referans şablonuna kaydedilir. Üç görünüm (solda), koronal, sagittal ve eksenel görünümlerde vaskülat ve fare beyni Allen atlasının süperpozisyonunun üstpozisyonunun gösterildiğini gösterir. D. 3D anjiyo taramasından 16 dilimden (31 üzerinden) doğrusal döşeme (montaj), kayıtlı Allen referans atlası vaskülatın üzerine bindirilir. E. Sol ve sağ birincil somatosensör korteks, varil alanları bölgesinin ortasına yerleştirilen iki işaretleyici sayesinde yazılım tarafından hesaplanan motor koordinatlarına karşılık gelen tahmin edilen görüntüleme düzlemini gösteren Beyin Navigasyon panelinin ekran görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

6. Görev çağrıştıran deney: bıyık stimülasyonu

1. Stimülasyon süresi, uyarılma süresi ve tekrar sayısı dahil olmak üzere stimülasyon dizisini önceden tanımlayın.
2. Toplam edinme süresini, pozisyon sayısını ve pozisyonlar arasındaki ölü zamanı tanımlayarak bir 3D fUS dizisi çalıştırın. TTL girişi üzerinden alım sistemiyle senkronize edilen otomatik stimülasyon durumunda, alıma başlamadan önce Trig-IN seçeneğini belirleyin.
   NOT: Bu çalışmada sunulan sonuçlar için, bıyıkların çoğunun sırt/ventral yönde saptırılmasına izin vermek için konumlandırılmış pamuklu çubuk kullanılarak stimülasyon teslim edildi. Senkronizasyonu sağlamak için Iconeus One sistemine bağlı bir Arduino UNO kartı ile tahrik edilen bir servo motora sabitlendi. Stimülasyon için önerilen parametreler 30 s ON, 30 s KAPASI, 20° genlik ve 4 Hz frekanstır. Alternatif olarak, stimülasyon, alım sırasında tanımlanan zamanlarda bıyıklar saptırılarak manuel olarak da teslim edilebilir.
3. Satın almayı IcoStudio yazılımında açın ve Etkinleştirme haritası menüsüne girin. Etkinleştirme deseni alanını başlangıç ve bitiş saatleriyle doldurun ve etkinleştirme eşlemesini hesaplayın. Görselleştirme için görüntüleme parametrelerini ayarlayın. Etkinleştirme eşlemesini satır dışı analiz için .h5 dosyası olarak dışa aktar.
   NOT: Etkinleştirme, varsayılan fare hemodinamik yanıtı (HRF) ile dolaştırılan uyaran ile genelleştirilmiş doğrusal model (GLM) yaklaşımı kullanılarak tahmin edilir. Alternatif olarak, aktivasyon, stimülasyon patiği ile her vokselden gelen hemodinamik sinyal arasındaki Pearson korelasyonunu tahmin ederek doğrudan görselleştirilebilir.

7. 4D fonksiyonel bağlantı

1. Toplam edinme süresini, görüntüleme düzlemi konumlarının sayısını ve pozisyonlar arasındaki ölü zamanı tanımlayarak bir 3D fUS dizisi çalıştırın.
   NOT: 4B işlevsel bağlantı için, her birim arasındaki alım süresinin 2,5 sn (en az 0,4 Hz örnekleme sıklığı) ve toplam alım süresinin en az 10 dakika (zaman noktası sayısı > 180) < öneririz.
2. Satın almayı kaydedin ve IcoStudio yazılımına yükleyin. Gerekirse, .bps dosyasını ve Allen fare beyni koordinat çerçevesini yükleyin. Atlas yöneticisinde,atlasın bölgelerini ilgi alanları (yatırım getirisi) olarak seçin.
3. İşlevsel Bağlantı menüsünü girin ve yatırım getirisi yöneticisinde istediğiniz bölgeleri seçin. Sonuçları bağlantı matrisi (denetimli analiz) veya tohum tabanlı korelasyon haritası (denetimsiz) olarak görselleştirin. Bant genişliği filtrelerini istediğiniz gibi seçin ve ayarlayın ve istatistiksel analiz için korelasyon sonuçlarını dışa aktarın.
   NOT: 3D fUS görüntüleme modunda, göreli prob konumları manuel olarak ayarlanır. Bu nedenle, iki tür tarama mümkündür ve işlevsel uygulamaya bağlı olarak seçilebilir: seyrek taramalara karşı yoğun taramalar (Şekil 2C).

Sonuçlar

Bu protokol, serebral hemodinamik varyasyonların fare beyninde transkranially olarak, istirahatte veya duyusal uyarıma yanıt olarak 3D nicelliğini açıklar. Kemirgenlerde beyin fonksiyonel aktivasyonunu haritalamak için standart bir paradigma olan bıyık stimülasyonu, duyusal stimülasyon çağrılan yanıta örnek olarak seçilmiştir. Şekil 4'te transkraniyal fUS görüntüleme kullanılarak elde edilen uyuşturulmuş bir farede mekanik bıyık stimülasyonuna yanıt olarak temsili bir aktivasyon haritası gösterilmiştir. Toplam deneme süresi 760 s idi, 60 s taban çizgisi (stimülasyondan önce ve sonra), 80 stimülasyon ve 60 s iyileşme süresi, tekrarlanan 5x idi. Varsayılan fare hemodinamik yanıt fonksiyonu (HRF) kullanılarak genel doğrusal modelin (GLM) çözünürlüğü ile anlamlı aktivasyon belirlenmiştir. Etkinleştirilen bölgeler (birden çok karşılaştırma için sıkı Bonferroni düzeltmesi sonrası p değeri >0.0000006 olan Z puanları) Allen ortak koordinat çerçevesi şablonuna üst üste bindirilmiş renk kodlu değerler olarak görüntülenir. Kontrallateral primer somatosensör korteksin voksel açısından zaman seyri, varil alan bölgesi (S1BF), CBV'nin taban çizgisine kıyasla% 15-20'lik bir artışını ortaya koydu.

Şekil 4: Ketamin/ksilazine uyuşturulmuş farede bıyık stimülasyonunu takiben transkraniyal aktivasyon Haritaları ve rCBV zaman kursu. A. Ketamin/ksilazine anestezi altında sağ bıyıkların (80 s ON, 60 s OFF,5x) mekanik uyarılmasını takiben önemli ölçüde aktive edilmiş vokselleri gösteren aktivasyon haritası. Haritalar, çoklu karşılaştırma için Bonferroni düzeltmesi ile genel doğrusal model analizine (GLM) dayalı Z puanları hesaplanarek elde edildi. Z-skorları (renk kodlu) Allen beyin 3D şablonunda (beyin konumlandırma sistemine kayıt olduktan sonra) kaplanır ve üç görünümde görüntülenir: koronal (sol), sagittal (orta) ve eksenel (sağ). Allen fare beyni ortak koordinat çerçevesinden anatomik bölgeler referans için görüntülenir. Aktif vokseller sol S1BF korteksinin içinde iyi bir konuma sahip. Ölçek çubuğu: 1 mm. Her numune hacmi 2,8 mm'nin üzerinde (yükseklik yönünde 7 dilime karşılık gelen) 3,85 s'de tarandı ve her fonksiyonel yanıt sırasında 20 hacimli numune kaydedildi. B. 3D bıyık stimülasyon çağrılmış göreli serebral kan hacmi (rCBV) baz düzeye göre artış. S1BF'nin anatomik tanımlaması mavi ile belirtilir. C. Sol S1BF (mavi) ve ilgili uyaran (kırmızı) CBV varyasyonlarının zaman seyri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Aynı paradigma, IcoScan'ın uyanık ön ayarı kullanılarak mobil ev kamerasında kafa sabitlenmiş bir farede uygulanmıştır. Şekil 5, Şekil 2'deaçıklanan deneysel kurulumu kullanarak birden çok bıyık stimülasyon denemesinden sonra etkinleştirme haritasını sunar. Birkaç posterior ve kaudal bıyık aşağıdaki desenle uyarılmıştır: 30 s taban çizgisi ve ardından 30 s ON (4 Hz) ve 30 s OFF(Şekil 5C)ardışık beş deneme. Stimülasyon, senkronizasyon için görüntü alma sırasını tetikleyen bir Arduino UNO kartı tarafından tahrik edilen bir servo motor kullanılarak teslim edildi. Varsayılan fare hemodinamik yanıt fonksiyonu (HRF) kullanılarak genel doğrusal modelin (GLM) çözünürlüğü ile anlamlı aktivasyon belirlenmiştir. Bonferroni yöntemi ile çoklu karşılaştırma düzeltmesi yapıldı. Geleneksel alfa seviyesi olan 0.05, satın alma hacmindeki toplam voksel sayısı ile normalleştirildi ve 0.000003'ün son katı eşiğine ulaştı.

Şekil 5: Uyanık davranan farede bıyık stimülasyonunu takiben Aktivasyon Haritaları ve rCBV zaman kursu. A. Mobil ev kamerasındaki uyanık bir farede sağ bıyıkların (30 s ON, 30 s OFF, 5x) mekanik uyarılmasını takiben önemli ölçüde etkinleştirilmiş vokselleri gösteren aktivasyon haritası. Haritalar, Z-puanların genel doğrusal model analizine (GLM) dayalı olarak, çoklu karşılaştırma için Bonferroni düzeltmesi (toplam voksel sayısına göre normalleşme) ile hesaplanarak elde edilmiştir. Z-skorları (renk kodlu) Allen beyin 3D şablonunda (Beyin Konumlandırma Sistemi ile kayıt olduktan sonra) kaplanır ve üç görünümde görüntülenir: koronal (sol), sagittal (orta) ve eksenel (sağ). Allen Mouse Brain Common Coordinate Framework'ün anatomik bölgeleri referans olarak görüntülenir. Aktif vokseller sol S1BF korteksinin içinde iyi bir konuma sahip. Ölçek çubukları, 1 mm. Her numune hacmi 1,6 mm'nin üzerinde (yükseklik yönünde 3 dilime karşılık gelen) 3,85 s'de tarandı ve her fonksiyonel yanıt sırasında 17 hacimli numune kaydedildi. B. Bıyık stimülasyonu çağrıştırılan bağıl Serebral Kan Hacminin (rCBV) temel düzeye göre artarak 3D oluşturulması. S1BF'nin anatomik tanımlaması mavi ile belirtilir. C. Toplam 330 s. D edinme süresi boyunca beş adet 30 s denemenin gerçekleştirildiği doğru bıyık stimülasyon deneyi sırasında mobil ev kamerasındaki farenin illüstrasyonu. Etkin alanın (mavi) içine çıkarılan anlık bağıl CBV zaman kursu, ilgili uyaran üst üste bindirilmiş (kırmızı). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6, ketamin-ksilazine anestezik bir farede 3D beyin bölgeleri arasındaki (kayıttan Allen ortak koordinat çerçevesine kadar tanımlanan) normalleştirilmiş düşük frekanslı (<0,2 Hz) spontan CBV dalgalanmalarının zamansal korelasyonlarını göstermektedir. Toplam alım süresi 20 dk (1200 sn) idi. Atlas denetimli analiz, 0,8'e kadar korelasyon katsayısı değerleriyle güçlü interhemisferik bağlantı kalıpları ortaya çıkardı. Dorsal hipokampusta yapılan tohum bazlı analizler, sağ ve sol hipokampus ile derin retro-hipokampal bölgeler ve piriform kortikaller arasında önemli bir interhemisferik bağlantı olduğunu ortaya koydu. S1BF'de seçilen bir tohum bölgesi de daha önce açıklandığı gibi simetrik (kortiko-kortikal) korelasyon deseniyle sonuçlandı.

Şekil 6: 20 dk 3D fUS alımında değerlendirilen ketamin/ksilazine anestezi altında fare beyninin transkraniyal hacimsel iskan durumu fonksiyonel bağlantısı. A. Korelasyon matrisi, transkraniyal fonksiyonel edinimde kayıtlı Allen ortak koordinat çerçevesinin 3D bölgelerine dayanmaktadır. Matris, normalleştirilmiş Pearson'ın dilim zamanlama düzeltmesinden sonra tanımlanan her yatırım getirisinde bulunan tüm voksellerden gelen ortalama zaman sinyallerinin spontan düşük frekanslı dalgalanmalarla (<0,1 Hz) korelasyonunun hesaplanmasıyla elde edilir. Örneklenen her hacim, 2,2 sn. B'denfazla elde edilen yükseklik yönünde (4 dilime karşılık gelen) 1,6 mm'nin üzerinde tarandı. 3D şablona yansıtılan tohum tabanlı analiz. Tohum β - 2.1 mm'de sağ sırt hipokampus içinde seçildi. Korelasyon haritası, tohumun zamansal sinyalleri ile dilim zamanlama düzeltmesi sonrası tüm kazanımın her bir voksel arasında Pearson Korelasyon katsayısı hesaplanarek elde edilir. C. 3D korelasyon haritası, β -2,1 mm'de S1BF içinde seçilen tohum bölgesi ile tohum bazlı analize dayanmaktadır. Ölçek çubukları: 1 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

Tüm beyin görüntüleme yöntemleri, beyin fizyolojisini ve patolojisini daha iyi anlamak için çok önemli araçlardır. Burada açıklanan yöntem, canlı beyindeki hemodinamik sinyallerin doğrudan tezgahta hassas bir şekilde ölçülmesini sağlar. Fonksiyonel ultrasonun eşsiz hassasiyeti ve mekansal-zamansal çözünürlüğü özellikle fare fizyolojisi için çok uygundur. İşlevsel yanıtlar ve dinlenme durumu ağları, uzunlamasına ve güvenilir bir önlem elde etmek için denemeleri veya konuları ortalamaya almak zorunda kalmadan kısa alım süreleri içinde eşlenebilir. Yüksek hassasiyetli ultrasonik lineer problar ve hızlı motorlu kurulumların ilgili kombinasyonu, makul alım süreleri içinde farelerde transkraniyal hacimsel fUS görüntüleme gerçekleştirmesini sağlar. Bu protokol, mobil bir ev kafesi kullanılarak uyuşturulmuş veya uyanık fareler üzerinde gerçekleştirilebilir.

Bu yazıda örnek olarak kullanılan duyusal uyaran olan bıyık stimülasyonu, kemirgenlerde standart bir fonksiyonel aktivasyon paradigmasıdır ve duyusal işleme, nörovasküler kavrama ve^{bunların 5,}6^,10,11değişikliklerini incelemek için güvenilir bir okumadır. Kullanım kolaylığı için bıyıkların kaba elle fırçalaması tercih edilebilirken, bu yöntem uzamsal ve zamansal hassasiyetlerden yoksundir. Burada fUS görüntüleme tarayıcısıyla tetiklenen gibi otomatik bir uyarıcının kullanılması, başlangıç zamanı, genlik yer değiştirmesi, frekans ve Q ucu / tarak açısı dahil olmak üzere çeşitli parametrelerin daha iyi kontrol edilmesine izin verir ve bu da hayvanlar arası daha iyi bir tekrarlanabilirlik sağlar. Ek olarak, daha hassas bir stimülasyon zamanlaması,^12,13parametrelerinin başlangıç ve pik yapma süresini belirleyerek Hemodinamik Yanıt İşlevinin (HRF) modellenmesine olanak tanır. Stimülasyon sırasında saptırılan bıyıkların sayısı (ve dolayısıyla aktif bölgenin alanı) üzerinde daha iyi hassasiyet sağlamak için, daha sofistike uyarıcılar bu protokole uyarlanabilir. Işık^8,ses¹⁴ veya koku sunumu¹⁵ gibi diğer birçok uyaran aynı protokol kullanılarak uygulanabilir.

Fonksiyonel ultrasonun uyanık ve uslu hayvanlarla uyumluluğu, diğer nörogörüntleme tekniklerine kıyasla önemli bir avantajdır ve anestezi önyargısı olmadan fonksiyonel aktivasyon haritalamasını sağlar. Havayla kaldırılan bir mobil ev kamerası kullanmak, doğrusal veya küresel koşu bantları gibi mevcut diğer kafa sabitleme cihazlarına iyi bir alternatiftir. Sıkıca kafa kafaya sabitlenirken, ev kamerasının hareketi fareye çevrede gezinme yanılsaması verir ve çok çeşitli davranış testlerinin fUS görüntüleme¹⁶ile birleştirilmiş olmasına izin verir. Bununla birlikte, kafa sabitleme alışkanlığı prosedürü, özellikle kafa karıştırıcı bir faktör olarak kabul edilebileceği deneyler için stresi azaltmak için önemli bir adım teşkil eder. Burada ayrıntılı olarak açıklanan prosedür (kafa fiksasyonuna 6 günlük kullanım ve alışkanlık) duyusal stimülasyon ve dinlenme durumu fonksiyonel bağlantısı için sağlam sonuçlar verir. Ancak, daha rafine davranış testleri için alışkanlık süresini uzatmak gerekebilir¹⁷.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Plastipak 1 mL syringes	Dutscher, France	303172
BD Microlance 26 Gauge needles	Dutscher, France	303800
Animal Temperature Controller (heating Plate coupled with a rectal probe)	Physitemp	TCAT-2DF
Arduino	Arduino	Arduino Uno-Rev3
Atipamezole	Orion Pharma, France	Antisedan®	5 mg/ml injectable solution
Dental Ciment	Sun Médical, Shiga, japan	Superbond C&B
Depilatory cream	Klorane	N/A
Eye Ointment	TVM, UK	Ocry-gel
Hair trimmer	Wella Profesionnals	N/A
Head plates	Neurotar, Finland	Model 14
Iconeus One standard package for fUS	Iconeus, France	Iconeus One
IcoScan acquisition software (v1.0)	Iconeus, France	IcoScan
IcoStudio analysis software (v1.0)	Iconeus, France	IcoStudio
Isoflurane Anesthesia station	Minerve, Esternay, France
Ketamine	Virbac, France	Ketamine1000	100 mg/ml injectable solution
Lidocaine	Vetoquinol	Lurocaine®	20 mg/ml injectable solution
Medetomidine	Orion Pharma, France	Domitor®	1 mg/ml injectable solution
Meloxicam	Boehringer lingelheim	Metacam®	0.5 mg/ml injectable solution
Mobile HomeCage Large with tracking capability	Neurotar, Finland	MHC-L-T-V4
Monitoring of ECG and breathing rate	AD Systems, (USA) and LabChart software
Servomotor	Feetech	FT90B
Stereotaxic frame	David Kopf (Tujunga, USA)	900-WA	Using Mouse Adaptor  (Ref: 922) and Non-Rupture Ear Bars (ref: 922)
Surgical glue	3M, USA	Vetbond
Syringe Pump	KD Scientific, USA	Legato® 130, Cat# 788130
Ultrasound gel	DREXCO medical, France	Medi'Gel
Xylazine 2%	Bayer, France	Rompun®	20 mg/ml injectable solution