Akış Altında Damar İlacı Hedeflemesi Üzerinde Çalışmak için In Vitro 3D Hücre Kültürlü Arteriyel Modeller

Özet

Burada, fizyolojik akış altında imal edilmiş, gerçek boyutlu, üç boyutlu insan arter modellerinde ilaç taşıyıcılarının hedeflenen birikimini incelemek ve endotel hücreleriyle haritalamak için yeni bir protokol sunuyoruz. Sunulan yöntem, damar sistemi içindeki ilaç taşıyıcılarını hedeflemek için yeni bir platform görevi görebilebilir.

Özet

Doğru boyut ve anatomi ile tasarlanan insan arterlerinin üç boyutlu (3D) modellerinin kullanılması, kardiyovasküler sistemdeki çeşitli önemli süreçlerin uygun şekilde modellenerek kullanılmasını sağlar. Son zamanlarda, insan arterlerinin bu tür 3D modelleri kullanılarak çeşitli biyolojik çalışmalar yapılmasına rağmen, vasküler hedeflemeyi incelemek için uygulanmamıştır. Bu makale, 3D baskı tekniği kullanarak gerçek boyutlu, yeniden yapılandırılmış insan arteriyel modelleri imal etmek, bunları insan endotel hücreleri (VC) ile hizalamak ve fizyolojik akış altında parçacık hedeflemeyi incelemek için yeni bir yöntem sürmektedir. Bu modeller, insan vücudundaki kan damarlarının fizyolojik boyutunu ve koşullarını düşük maliyetli bileşenler kullanarak çoğaltma avantajına sahiptir. Bu teknik, kardiyovasküler sistemde ilaç hedeflemesini incelemek ve anlamak için yeni bir platform görevi görebilir ve yeni enjekte edilebilir nanotıpların tasarımını geliştirebilir. Ayrıca, sunulan yaklaşım, hastaya özgü akış ve fizyolojik koşullar altında kardiyovasküler hastalıklar için farklı ajanların hedefli teslimatının incelenmesi için önemli araçlar sağlayabilir.

Giriş

Son zamanlarda insan arterlerinin 1 ,², 3 ,^4,53Dmodelleri kullanılarak çeşitli yaklaşımlar uygulanmıştır. Bu modeller, insan vücudundaki farklı arterlerin fizyolojik anatomisini ve ortamını in vitro olarak çoğaltır. Bununla birlikte, daha çok hücre biyolojisi çalışmalarında kullanılmıştır. Parçacıkların endotellere vasküler hedeflemesi üzerine yapılan güncel çalışmalar siliko hesaplama simülasyonları 6^,7,8, in vitro mikroakışkan modeller 9^,10,11ve in vivo hayvan modelleri¹²içerir. Sağladıkları içgörülere rağmen, bu deneysel modeller, kan akışı ve hemodinamiklerin baskın faktörleri oluşturduğu insan arterlerinde meydana gelen hedefleme sürecini doğru bir şekilde simüle edememiştir. Örneğin, karmaşık devridaim akış deseni ve duvar kesme gerilme gradyanı ile bilinen karotis arter çatallanmadaki aterosklerotik bölgelere yönelik parçacık hedefleme çalışması, parçacıkların endotel 13 , 14^,15,16'yaulaşmadan önce yaptıkları yolculuğu etkileyebilir. Bu nedenle, bu çalışmalar fizyolojik ortamı, yaniboyutu, boyutu, anatomisini ve akış profilini çoğaltan koşullar altında yapılmalıdır.

Son zamanlarda, bu araştırma grubu, parçacıkların vaskülür^17'yebirikmesini ve hedeflenerek incelenmesini incelemek için 3D yeniden yapılandırılmış insan arteriyel modeller üretmektedir. Modeller, daha sonra iç duvarlarını kaplayan insan WC'leri ile kültürlenen insan kan damarlarının geometrik 3D kopyalarına dayanıyordu. Ek olarak, fizyolojik akış üreten bir perfüzyon sistemine maruz kaldığında, modeller fizyolojik durumları doğru bir şekilde çoğaltmıştır. Perfüzyon sistemi, hem kapalı hem de açık devre konfigürasyonlarında peristaltik bir pompa kullanarak sıvıları sabit bir akış hızında perfüzyonlamak için tasarlanmıştır (Şekil 1). Sistem, parçacık biriktirme ve hedeflemeyi karotid modelinin içinde tohumlanan hücrelere eşlemek için kapalı devre olarak kullanılabilir. Ek olarak, deneylerin sonunda yapışmayan parçacıkları yıkamak ve sistemi temizlemek ve korumak için açık devre olarak kullanılabilir. Bu makale, insan şahda ikiye ayırmanın 3D modellerinin imalatı, perfüzyon sisteminin tasarımı ve modellerin içindeki hedeflenen parçacıkların birikmesinin haritalandırılması için protokoller sunun.

Protokol

NOT: Bu protokol, şahdamarının 3D modelinin imalatını açıklar ve geometrik parametreleri değiştirerek başka bir ilgi atardamarı oluşturmak için uygulanabilir.

1. İnsan şahdamar modelinin 3D çatallanmasının tasarımı ve imalatı

1. Hastalardan veya daha önce çalışılan insan şahdamar çatallanmasının geometrilerinden görüntüler seçin ve basılması gereken kalıbın bilgisayar destekli bir tasarım modelini oluşturun.
   NOT: Şahdamar bifurkasyonu bir giriş ve iki çıkışa sahiptir. Arter etrafında bir 3D kalıp çerçevesi tasarlamak önemlidir ve çerçeve ile arter kalıbı arasında geçici baskı destekleri(Şekil 2A-C).
2. Geometrileri 3D yazıcı kullanarak yazdırın. Geçici baskı desteklerini kesin ve özellikle desteklerin kesildiği alanlarda kalıpları parlatmak ve pürüzsüzleştirmek için zımpara kağıdı kullanın. Plastik tozu çıkarmak için zımparalanmış modeli izopropil alkolle durulayın ve kimyasal bir başlıkta 2-3 saat boyunca tamamen kurumaya bırakın.
   NOT: Burada, baskılı kalıplar berrak reçine v4(Şekil 2D,E)yapılmıştır.
3. Plastiği kolayca çözmek için kalıpları kimyasal bir kaputun içine şeffaf lake ile püskürtün ve 1 saat boyunca havayla kurumaya bırakın. Bunu 3x tekrarlayın.
   NOT: Burada, 2X Ultra Kapak Şeffaf Sprey kullanıldı, ancak ahşap lake olmadığı sürece başka her türlü uygun olmalıdır. Açıkta plastik kalmadığını onaylayın, çünkü plastik silikonla reaksiyona sokabilir ve düzgün bir şekilde katılaşmasını önleyebilir. Püskürtülen yüzeyin kalitesi, nihai silikon modelinin yüzeyinin kalitesini belirleyecektir.
4. Kalıp çerçevesiyle aynı boyutlarda şeffaf dikdörtgen slaytlar / şeritler kesin ve cilayı kullanarak çerçevenin her tarafındaki çerçeveye ve çerçevenin bir tarafından yapıştırın, böylece altta kapatılır ve üstte açılır. Cilayı kimyasal bir kaputun içinde bir boya fırçası kullanarak uygulayın ve slaytların en az 24 saat boyunca tamamen kurumasını bekleyin(Şekil 2F).
5. Silikon kauçuk karışımını hazırlamak için, kürleme maddesi (kütle oranı 1:10) ile sıvı silikonu plastik bir plakaya ekleyin ve tam karıştırmayı sağlamak için iyice karıştırın. Şahdatır modeli için 54 g silikon ve 6 g kürleyici maddesi ekleyin.
6. Karışımı 4 °C'de 15 dakika soğutun, ardından tüm hava kabarcıkları ortadan kaldırılınceye kadar vakumlu bir kurutucuda gazdan arındırın. Kalıbı kurutucuya yerleştirin (açık tarafı yukarı bakacak şekilde), silikon karışımını yavaşça kalıba dökün ve karışım net olana kadar hava kabarcıklarını tekrar çıkarın.
7. Kalıbın oda sıcaklığında bir gecede silikonla durmasına izin verin (mümkünse vakumsuz olarak kurutucuda bırakın). Karışım tam olarak kurumamışsa, birkaç saat daha 60 ° C'de kuluçkaya yatırın.
8. Karışım tamamen kurudıktan sonra şeffaf slaytları çıkarın ve plastik tamamen çözünene kadar modeli kimyasal bir kaputta 48 saat boyunca mutlak aseton içine daldırin. Plastik artıkları tahta bir çubukla çıkarın. Modelin içine sıkışmış asetonları buharlaşmak için, hücre tohumlamadan önce en az 4 gün boyunca 60 ° C'de kuluçkaya yatırın.

2. Modellerde hücre kültürü ve tohumlama

1. Karotid modeli için üç konektör hazırlayın: biri giriş için, ikisi çıkışlar için (bkz. Malzeme Tablosu). Modeli ve konektörleri biyolojik bir başlıkta ultraviyole ışınlama ile 20 dakika sterilize edin.
2. Modelleri 4 mL 100 μg/mL fibronektin (1x fosfat tamponlu salin, (PBS)) ile 37 °C'de 2 saat veya 4 °C'de bir gecede kapla. Fibronektin çözeltisini 5 veya 10 mL plastik şırınna kullanarak giriş yoluyla modele enjekte edin. Fibronektin çıkıştan çıkarın ve modeli EC ortamı ile yıkayın.
3. 2,5 ×^{10 6} hücre/mL insan göbek damarı endotel hücrelerini (HUVEC'ler, geçiş < 6) askıya alın ve modeli 5 veya 10 mL plastik şırıng kullanarak hücre süspansiyonunun 4 mL'si ile doldurun (Şekil 3A). Homojen tohumlama sağlamak için modeli 48 saat boyunca 1 rpm hızında bir inkübatörün (37 °C) içindeki bir rotatora yerleştirin. Modelin rotatora iyi takıldığından emin olun (Şekil 3B). Biyolojik bir kaputun içinde 24 saat sonra ortamı değiştirin ve 24 saat daha inkübatör içindeki rotatora geri dönün.
   NOT: 24 saat sonra hücreler tohumlanır ve mikroskop kullanılarak görüntülenebilir.
4. Modeli rotatordan çıkarın ve 10 mL plastik şırınna kullanarak 1x PBS ile yıkayın. Hücreleri sabitlemek için, hücreleri kimyasal bir kaputun içinde 15 dakika boyunca modele% 4 paraformaldehit (PFA) 4 mL ile kuluçkaya yatırın ve ardından PBS ile 3x durulayın. 4 mL PBS ekleyin ve deneye kadar 4 °C'de saklayın (Şekil 3C). Standart boyama protokollerini kullanarak modelin içindeki hücreleri lekele(örneğin, 4′, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI), Şekil 3Dile nükleer boyama).

3. Perfüzyon sisteminin tasarımı

1. Perfüzyon sistemi iki giriş ve iki çıkış tüpüne sahiptir. İki girişi tek bir 4 mm kimlik tüpünde ve peristaltik pompaya bağlanan iki adet 6 mm kimlik tüpünde birleştirin. Peristaltik pompadan çıkan iki adet 6 mm'lik ID tüpü tek bir 4 mm'lik tüpte birleştirin ve pompadan salınımları ortadan kaldırmak için bir salınım damperine bağlayın. Damper olarak üç delikli kapaklı 250 mL dar ağızlı bir şişe kullanın.
2. Pompadan girişe bir delik bağlayın, ikincisini acil durumlarda basınç havalandırma için kullanılan bir mantarla kapatın ve üçüncü deliği (çıkış olan) şişenin altına uzatın.
3. Damperi, çıkış borularını kullanarak kültürlü karotis modelinin girişine bağlayın. Modelin iki çıkışını, sistemin çıkışı olacak bir boruyla birleştirin (Tüm borular 4 mm'dir).
4. Çıkış borularını iki çıkış tüpüne bölün (biri kapalı devre için, diğeri açık devredeki atık konteyneri için). Her tüpe plastik bir kelepçe takın.
   NOT: Açık/kapalı kelepçelerin kombinasyonu, sistemin kapalı veya açık devre konfigürasyonunda olup olmadığını belirleyecektir. Şekil 1'degösterildiği gibi, b ve c açıkken a ve d kelepçeleri yakınsa, sistem kapalı bir devredir; ters devre konfigürasyona sistemi getirir.
5. Üç kap hazırlayın: biri 300 mL sıvı (kapalı devre için) ve her biri 1 L'lik diğer iki sıvıyı tutabilen: biri yıkama için, diğeri atık için (açık devre için).

4. Kapalı devre konfigürasyonu: perfüzyon deneyi ve görüntüleme

1. Kapalı devre konteynere 300 mL PBS ekleyin, bu da boru ve model de dahil olmak üzere tüm sistemi doldurmak için yeterlidir. Kabın içine bir giriş tüpü ve bir çıkış tüpü (açık kelepçeler b ve c) yerleştirin.
2. 1 L yıkama kabını damıtılmış suyla doldurun (deneyin sonunda yıkamak için) ve diğer 1 L atık kabını boş bırakın. Diğer giriş ve çıkış borularını (a ve d kelepçelerini kapatın) sırasıyla yıkama ve atık kaplarına yerleştirin.
3. Sabit hücreli kültürlü karotid modelini 4 °C depolama alanından alın ve PBS'yi boşaltın. Karotid giriş ve çıkışlarını 3.3-3.4 adımlarında açıklandığı gibi bağlayın. Modeli uzun süre kuru bırakmayın. Model bağlandıktan sonra, sıvıyı boğmak için pompayı etkinleştirin.
4. Şahdatoid modelini mikroskop altına yerleştirin. Karotid modelinin girişinden önce ve çıkışından sonra boruyu açın. Peristaltik pompayı 10 rpm'ye ayarlayın ve açın. Hızı her 4-5 dakikada bir 5 rpm'lik artışlarla artırın. Sızıntı olmadığından emin olun.
5. İnsan şahdamarının fizyolojik dalga biçiminin maksimum akış hızına (~400 mL/dk) eşit olan 100 rpm'de, kapalı devre konteynerdeki 300 mL PBS'ye floresan karboksilatlı polistiren (PS) parçacıklar (2 μm, 1,6 μg/mL konsantrasyonda) ekleyin. 1,5 saat boyunca her 10 s'de bir ilgi çekici bölgeyi görüntüleyin (gerektiğinde hala tek resim veya video).

5. Açık devre konfigürasyonu: yıkama adımı

1. Yıkama ve atık tüplerinin kelepçelerini 1 L kapta (kelepçeler a ve d) açın ve sistemi kapalıdan açık devre konfigürasyonundan değiştirmek için 300 mL konteynerdeki (kelepçeler b ve c) hem giriş hem de çıkış tüplerinin kelepçelerini hemen kapatın.
2. Suyun büyük kısmının yıkama kabından saat 100 rpm'de atık konteynerine akmasına izin verin. Tamamen aktarılmadan önce, peristaltik pompaya basın ve karotis modelinin girişinden önce ve çıkışından sonra tüp kelepçelerini kapatın.
3. Uygun filtreleri kullanarak, parçacıkların hücrelere birikmesini ve yapışmasını göstermek için modelin ilgi çekici bölgedeki görüntülerini yakalayın. Şahdayıt modelinin bağlantısını kesin. Modelin girişine dikkatlice ve yavaşça 10 mL şırınna ile 4 mL PBS ekleyin.
4. Karotis modeli yerine bir "kukla model" (aynı zamanda sadece yıkama için kullanılan silikon kauçuk 3D karotid modelidir) karotis modeli yerine bağlayın ve sistemi durulayın. 1 L daha su ekleyin ve tüm su yıkama kabından atıklara aktarılana kadar sistemi tekrar yıkayın. Peristaltik pompayı kapatın.

6. Veri toplama ve analiz

1. Özelleştirilmiş bir yazılım kodu kullanarak deney sırasında çekilen görüntülerle ilgi çekici bölgede parçacık biriktirmenin dijital bir filmini haline alın (Bkz. Malzeme Tablosu).
2. Model boyunca parçacıkların birikmesinin haritalandırılması için, incelenen ilgi bölgesini kapsayacak şekilde birden fazla görüntü döşeyin (Şekil 4A,B).
   NOT: İlgi çekici bir yerdeki yapışan parçacıkların sayısını ölçmek için özelleştirilmiş bir yazılım kodu yazılabilir (ek bilgiolarak örnek bir dosya sağlanmıştır)¹⁷.

Sonuçlar

Bu makale, ilaç dağıtım araştırmaları için yeni bir platform sağlayabilecek gerçek boyutlu 3D insan arter modellerindeki parçacıkların birikmesini haritalamak için yeni bir protokol sunun. 3D baskı tekniği kullanılarak, insan şahdamarının bir modeli imal edildi (Şekil 2). Model silikon kauçuktan yapılmış ve insan VC'leri ile tohumlanmıştır (Şekil 3). Daha da önemlisi, bu protokol fizyolojik koşulların özellikle akışkan dinamiğ...

Tartışmalar

Parçacıkların vasküler hedeflemesini incelemek için mevcut yaklaşımlar, insan vücudunda bulunan fizyolojik koşulları çoğaltmada yetersiz kalmaktadır. Burada sunulan, özelleştirilmiş bir perfüzyon sistemi kullanılarak uygulanan fizyolojik akış altında arteri kaplayan VC'lere partikül hedeflemesini incelemek için insan arterlerinin 3D yeniden yapılandırılmış modellerini imal etmek için bir protokol sunulmaktadır. 3D baskı için malzemeyi seçerken, silikon modeline pigment transferini önleme...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printer	FormLabs	PKG-F2-REFURB
Acetone, absolute (AR grade)
Connectors	Nordson Medical	FTLL013-1	Female Luer
		FTLL230-1	Female Luer
		FTLL360-1	Female Luer
		LP4-1	Male Luer Integral Lock
Damper	Thermo-Fisher Scientific	DS2127-0250	Nalgene Polycarbonate, Validation Bottle
Damper Cover	Thermo-Fisher Scientific	2162-0531	Nalgene Filling/Venting Closures
Elastosil Elastosil RT 601 A	Wacker	60003805
Elastosil RT 601 B	Wacker	60003817	The crosslinker
Endothelial Cell Media	ScienCell	1001
Fibrontectin	Sigma Aldrich	F0895-5mg
HUVEC	Lonza	CC-2519
Isopropyl alcohol, AR grade 99.5%			Remove plastic dust from the sanded model
Lacquer	Rust-Oleum		2X-Ultra cover Gloss Clear
Matlab	Mathworks		https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Microscope	Nikon	SMZ25
Microscope Camera	Nikon	DS-Qi2
Peristaltic pump	Watson Marlow	530U IP31	With 2 pumpheads: 313D
Plastic tube clamp	Quickun	1-2240-stopvalve-2pcs
Polystyrene Particles	Thermo-Fisher Scientific	F8827	Diameter = 2 µm
Printer resin	FormLabs	RS-F2-GPCL-04
Rotator	ELMI Ltd.		Intelli-Mixer RM-2
Solidworks	SolidWorks Corp., Dassault Systèmes		https://www.solidworks.com/
Tubing	Watson Marlow	933.0064.016	Tubing for the pump: 6.4 mm ID
All the other tubing: Silicon tubing: 4 mm ID