Somitogenezi Yöneten Sinyal Salınımlarının Fonksiyonel Olarak İncelenmesi İçin Bir Mikroakışkan Yaklaşımı

Özet

Mikroakışkan bir çip üzerinde fare embriyonik dokusunun kültürü ve manipülasyonu için bir protokol sağlanır. Yol modülatörlerinin darbelerini uygulayarak, bu sistem fare somitogenezinin fonksiyonel araştırması için sinyal salınımlarını harici olarak kontrol etmek için kullanılabilir.

Özet

Gelişmekte olan bir fare embriyosunun presomitik mezoderminin periyodik segmentasyonu, bir sinyal yolları ağı tarafından kontrol edilir. Sinyal salınımlarının ve gradyanlarının sırasıyla segment oluşumunun zamanlamasını ve aralığını kontrol ettiği düşünülmektedir. İlgili sinyal yolları son yıllarda kapsamlı bir şekilde incelenmiş olsa da, somitogenezi kontrol etmede sinyal salınımlarının işlevi için doğrudan kanıtlar eksiktir. Sinyal dinamiklerinin işlevsel olarak araştırılmasını sağlamak için, mikroakışkanlar bu dinamiklerin ince modülasyonu için önceden kurulmuş bir araçtır. Bu mikroakışkan tabanlı sürüklenme yaklaşımı ile endojen sinyal salınımları, yol modülatörlerinin darbeleri ile senkronize edilir. Bu, örneğin salınım periyodunun veya iki salınımlı yol arasındaki faz ilişkisinin modülasyonunu sağlar. Ayrıca, sinyal gradyanlarındaki spesifik değişikliklerin somitogenezi nasıl etkilediğini incelemek için yol modülatörlerinin uzamsal gradyanları doku boyunca kurulabilir.

Mevcut protokol, mikroakışkanların ilk kez kullanıcıları için mikroakışkan yaklaşımların oluşturulmasına yardımcı olmayı amaçlamaktadır. Bir mikroakışkan sistem kurmak için gereken temel prensipler ve ekipmanlar tanımlanmıştır ve çip üretimi için bir kalıbın bir 3D yazıcı kullanılarak kolayca hazırlanabileceği bir çip tasarımı sağlanmıştır. Son olarak, birincil fare dokusunun mikroakışkan bir çip üzerinde nasıl kültürleneceği ve sinyal salınımlarının yol modülatörlerinin dış darbelerine nasıl bağlanacağı tartışılmaktadır.

Bu mikroakışkan sistem, diğer bağlamlarda sinyal dinamiklerinin ve morfojen gradyanlarının fonksiyonel olarak araştırılması için gastruloidler ve organoidler gibi diğer in vivo ve in vitro model sistemlerini barındıracak şekilde de uyarlanabilir.

Giriş

Gelişim, sinyal yolları aracılığıyla hücreler arası iletişim ile kontrol edilir. Dokuların karmaşık oluşumunu ve uzay ve zamanda uygun hücre farklılaşmasını düzenleyen sınırlı sayıda sinyal yolu vardır. Bu çok sayıda süreci düzenlemek için, bilgi bir sinyal yolunun dinamiklerinde, bir sinyalin frekansı veya süresi gibi zaman içinde bir yolun değişiminde ^{kodlanabilir1,2}.

Somitogenez sırasında, somitik doku periyodik olarak presomitik mezodermden (PSM) ^ayrılır3. PSM, Wnt, Fibroblast Büyüme Faktörü (FGF) ve Retinoik asit sinyalizasyonu gradyanları tarafından mekansal olarak düzenlenir. Wnt ve FGF sinyallerinin düşük olduğu belirleme cephesindeki anterior PSM'de, hücreler somitlere farklılaşmak üzere hazırlanır. Farklılaşma, bir transkripsiyonel aktivasyon dalgası bu belirleme cephesine ulaştığında meydana gelir. PSM içinde Wnt, FGF ve Notch sinyal salınımı olur. Komşu hücreler fazın biraz dışına salınır, bu da Wnt, FGF ve Notch yollarının posteriordan anterior PSM'ye giden salınımlı transkripsiyonel aktivasyon dalgalarıyla sonuçlanır. Fare embriyolarında, bir transkripsiyonel dalga yaklaşık her 2 saatte bir belirleme cephesine ulaşır ve somit oluşumunu başlatır. Sinyal yollarını bozarak veya aktive ederek somitogenezi incelemek, bu yolların önemini gösterebilir4,5,6,7,8,9. Bununla birlikte, hücresel davranışın kontrolünde sinyal dinamiklerinin işlevini araştırabilmek için, sinyal yollarını kalıcı olarak aktive etmek veya inhibe etmek yerine ince bir şekilde modüle etmek önemlidir.

Segmentasyon faresi embriyosundaki sinyal yolu aktivitesini geçici olarak modüle etmek için, Sonnen ve ark. mikroakışkan bir sistem ^{geliştirmiştir10}. Bu sistem, biyolojik numuneyi içeren bir çipin mikro kanalları içindeki sıvı akışlarının sıkı bir şekilde kontrol edilmesini ^sağlar11. PSM'nin uygun şekilde segmentasyonu için sinyal dinamiklerinin önemini incelemek için, bu mikroakışkan kurulumu, fare segmentasyon saatinin sinyal dinamiklerini ex vivo olarak modüle etmek için kullanılır. Yol aktivatörleri veya inhibitörleri kültür odasına sırayla darbelendirerek, Wnt, FGF ve Notch sinyalizasyonunun dinamiklerinin dış kontrolü ^sağlanır10. Örneğin, bireysel yolların periyodunu ve çoklu salınımlı sinyal yolları arasındaki faz ilişkisini değiştirmek mümkündür. Dinamik sinyal muhabirlerinin eşzamanlı gerçek zamanlı görüntülemesi kullanılarak, sürüklenmenin yolakların kendileri, farklılaşma ve somit oluşumu üzerindeki etkisi analiz edilebilir. Sinyal dinamikleri üzerindeki bu kontrol seviyesi kullanılarak, somitogenez sırasında Wnt- ve Notch-sinyal yolları arasındaki faz ilişkisinin önemi ^{vurgulanmıştır10}.

Kişiselleştirilmiş çip tasarımları, yerel ortamdaki mekansal zamansal pertürbasyonlar için çok sayıda seçeneğe izin verir, örneğin, kararlı gradyan oluşumu12,13,14,15, pulsatil aktivasyon/inhibisyon10,16,17,18 veya lokalize pertürbasyonlar19,20 . Mikroakışkanlar ayrıca deneysel kullanımın otomasyonu sayesinde daha tekrarlanabilir bir okuma ve daha yüksek verim sağlayabilir21,22,23. Mevcut protokol, mikroakışkanları ve dokulardaki endojen sinyal salınımlarının sürüklenmesini her standart yaşam bilimleri laboratuvarına getirmeyi amaçlamaktadır. Temiz oda ve yumuşak litografi ekipmanı gibi çip üretimi için sofistike ekipmanların yokluğunda bile, mikroakışkan çipler biyolojik soruları ele almak için üretilebilir ve kullanılabilir. Kalıplar, serbestçe kullanılabilen bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı kullanılarak tasarlanabilir. Genellikle polidimetilsiloksandan (PDMS) oluşan mikroakışkan çiplerin üretimi için bir kalıp, bir 3D yazıcı ile basılabilir veya baskı şirketlerinden sipariş edilebilir. Bu şekilde, mikroakışkan çipler pahalı ekipmanlara ihtiyaç duymadan bir gün içinde ^{üretilebilir24}. Burada, iki boyutlu (2D) ex vivo ^{kültürlerde25} fare segmentasyon saatinin sürüklenmesi için bir kalıbın bir 3D yazıcı ile basılabileceği bir çip tasarımı sağlanmıştır.

Mikroakışkanlar tarafından sağlanan çip üstü kültürler ve hassas pertürbasyonlar, sinyal yollarının çok hücreli davranışı nasıl kontrol ettiğinin moleküler mekanizmalarını çözmede olağanüstü bir potansiyele sahiptir. Sinyalizasyon dinamikleri ve morfojen gradyanları, gelişimdeki birçok süreç için gereklidir. Daha önce, laboratuvarlar mikroakışkan çiplerde kültürlenmiş hücrelere, dokulara ve tüm organizmalara sahipti ve öncelikle 2D hücre kültürünün mekansal zamansal pertürbasyonu için protokoller başka bir yerde sağlanmıştır12,26,27,28,29. Çok hücreli sistemlerde yerel ortamları modüle etmek için mikroakışkanların uygulanması, yüksek verimli ve hassas mekansal zamansal bozulmalar için yeni perspektifler açar. Mikroakışkanlar alanı artık gelişimsel biyologlar için uzman olmayan, ucuz ve kolayca uygulanabilir bir araç haline geldiği bir noktaya ulaşmıştır.

Burada, fare segmentasyon saatinin bir Çentik sinyal inhibitörünün darbelerine sürüklenmesi için bir protokol sağlanmıştır. Böyle bir deney aşağıdaki adımlardan oluşur: (1) mikroakışkan çipin üretilmesi, (2) çipin boru ve kaplamasının hazırlanması ve (3) mikroakışkan deneyin kendisi (Şekil 1A). Omurgalı model sistemlerini içeren araştırmalar, sorumlu komiteden önceden etik onay gerektirir.

Protokol

Burada sunulan araştırma, EMBL etik ^komitesi10 ve Hollanda hayvan araştırmaları komitesi (dierenexperimentencommissie, DEC) tarafından onaylanmıştır ve Hubrecht'in hayvan bakımı yönergelerini izlemektedir.

Sıvı PDMS ile çalışırken eldiven giyin. Yüzeyleri ve ekipmanları örtün. Dökülmeleri derhal temizleyin, çünkü sertleştikten sonra temizlik zorlaşır.

1. Çipin üretimi

NOT: Mikroakışkan çipler, PDMS'nin (Polidimetilsiloksan) bir kalıpta dökümü ile üretilir. Kalıplar CAD yazılımı kullanılarak tasarlanabilir (örneğin, uFlow veya ^3DμF30). MIT (Metafluidics.org) tarafından ücretsiz tasarımların bir deposu sağlanmaktadır. Kalıplar ya bir 3D yazıcı ile basılır ya da istenen tasarımı içeren bir fotomaske kullanılarak yumuşak litografi ile üretilebilir (daha fazla bilgi için bkz., örneğin, Qin ve ark., ²⁰¹⁰³¹). Burada, fare embriyo dokusunun çip üzerindeki kültürü için bir 3D yazıcı ile basılabilen bir kalıp tasarımı sağlanmıştır (Şekil 1B, C, Ek Dosyalar 1 ve 2). Daha düşük çözünürlüklü 3D yazıcılarla baskıya izin vermek için, tasarım daha önce yayınlanmış olana kıyasla ^{değiştirilmiştir10}. Hava kabarcığı tuzakları olmayan ve hava kabarcığı tuzakları olan bir kalıp sağlanır (sırasıyla Ek Dosyalar 1 ve 2). Yazdırma yordamı mevcut yazıcıya bağlı olduğundan, yazdırmayla ilgili ayrıntılar açıklanmayacaktır. Bununla birlikte, polimerize edilmemiş tüm reçinelerin tamamen çıkarıldığından emin olunmalıdır. Mikroakışkan haznesi içindeki küçük <200 μm deliklerden polimerize edilmemiş reçineyi çıkarmak için genellikle çözücülerle ekstra yıkama yapılması gerekir. Bu delikler, deney sırasında çip içindeki embriyonik dokuyu yakalamak için PDMS sütunları oluşturacaktır. PDMS genellikle ucuz, biyouyumlu ve şeffaf olduğu ve düşük otofloresansa sahip olduğu için mikroakışkanlar için kullanılır. Kürlendikten sonra, PDMS çipi kalıptan kesilir ve bir cam kızağa yapıştırılır. Hem camın hem de PDMS çipinin plazma muamelesi, yüzeyleri aktive eder ve temas ettirildiğinde kovalent bağların oluşumuna izin verir.

1. Polimerizasyonu indüklemek için monomeri katalizörle 9: 1 oranında (w: w) karıştırarak gerekli miktarda PDMS hazırlayın. Plastik bardaklar ve çatallar gibi karıştırmak için tek kullanımlık aletler kullanın. Karıştırmanın doğru şekilde yapıldığından emin olun.
2. PDMS karışımını bir kurutucuya yerleştirin ve PDMS karışımından havayı çıkarmak için yaklaşık 30 dakika boyunca vakum uygulayın. Kurutucudaki vakum nedeniyle, hava PDMS karışımından uzaklaştırılacaktır.
   NOT: PDMS'nin akması ihtimaline karşı kurutucunun içini mendillerle örtün.
3. PDMS karışımını talaş kalıbına dökün (yaklaşık 3-5 mm'lik bir PDMS tabakası yeterlidir).
4. PDMS ile doldurulmuş kalıbı tekrar kurutucuya yerleştirin ve kalan kabarcıkları çıkarmak için vakum uygulayın. Havanın kalıbın tüm küçük yapılarından çıkarıldığından emin olun.
5. Kalıbı gece boyunca 65 °C (veya kalıp malzemesine bağlı olarak daha düşük) bir fırına yerleştirerek kürleyin. Bir neşter kullanarak çipi kalıptan kesin. Sertleşmiş PDMS'yi, daha sonra yapıştırmaya izin vermek için tasarımın etrafında yeterli alanla (1-2 cm) kalıptan kesin. Çipi çıkarırken kırılmasını önlemek için PDMS'yi tamamen kestiğinizden emin olun. PDMS yongasını dikkatlice kaldırın, önce neşterin kör ucuyla ve mümkünse ellerle.
6. Giriş ve çıkış deliklerini, 1 mm'lik bir biyopsi zımba kullanarak mikroakışkan haznenin içinden başlayarak delin.
7. PDMS yongasını basınçlı hava ile kısa bir süre temizleyin ve yapışmış PDMS ve toz parçalarını çıkarmak için yapışkan bandı her iki tarafa yapıştırın ve daha fazla kullanıma kadar temiz tutun.
   NOT: Çip daha fazla kullanıma kadar bu şekilde tutulabilir.
8. Cam sürgüyü basınçlı hava ile temizleyin. Kırılmamasına dikkat edin. PDMS yongasından yapışkan bandı çıkarın.
9. Bir plazma fırın kullanarak çipi cam slayda bağlayın. Aşağıdaki talimatlar hava plazması için optimize edilmiştir.
   NOT: Laboratuvarın plazma fırınının el kitabına bakın ve spesifik deney için prosedürü optimize edin.
   1. Çip ve cam kaydırağı, bağlanacak yanlar yukarı bakacak şekilde plazma fırınına yerleştirin.
   2. Kapağı plazma fırının üzerine yerleştirin ve vakum uygularken yerinde tutun ve vakum oluşana kadar bekleyin.
   3. Gaz düğmesine basarak gazı açın ve yaklaşık 1 dakika bekleyin (basınç yaklaşık 0,37 mbar olmalıdır).
   4. Jeneratöre basarak plazma üretin (Güç: 9.0, Süre: 1 dk).
   5. İşiniz bittiğinde, pompayı ve gazı kapatın; havalandırın ve kapıyı açın.
   6. Aktif yüzeyleri birbirine yerleştirerek ve eşit şekilde basınç uygulayarak çipi cama yapıştırın. Camın kırılmamasına dikkat edin.
      NOT: Plazma işleminin işe yaradığını doğrulamak için bir su testi yapılabilir. Cam yüzeye bir damla su koyun. Plazma işlemi işe yaradıysa, su bir damlacık oluşturmak yerine hemen yayılmalıdır.
10. Yapıştırılan çipi 5 dakika boyunca 65 °C'de bir fırına koyun.
11. Tozun girişlere girmesini önlemek için çipin açıkta kalan tarafını yapışkan bantla kapatın.
    NOT: Çip kullanıma kadar saklanabilir. Açıklıklar o zamana kadar bantla kapatılmalıdır.

2. Mikroakışkanlar deneyinin hazırlanması

NOT: Mikroakışkanlar deneyini gerçekleştirmek için aşağıdaki hazırlık adımları gereklidir: İlk olarak, mikroakışkanlar deneyini gerçekleştirirken, girişlerden çıkışlara bir sıvı akışı oluşturulur. Talaştaki herhangi bir delik, girişlerden gelen basınç birikimi nedeniyle çıkış olarak işlev görecektir. Bu nedenle, kullanılmayan tüm delikler kapatılmalıdır; örneğin, çip üzerine doku yüklemek için kullanılan delikler. Bunlar kapatılmazsa, doku sıvı ile birlikte dışarı akabilir. Bu delikleri kapatmak için PDMS dolgulu boru kullanılır. PDMS dolgulu boru süresiz olarak tutulabilir ve bu nedenle her mikroakışkan deneyi için ayrı ayrı hazırlanması gerekmez, ancak daha büyük partiler halinde yapılabilir. İkincisi, mikroakışkan deneyin başlamasından önce, tüp ve PDMS dolu boru ve deney için gerekli olan çip hazırlanır ve UV ile sterilize edilir. Son olarak, çipin fibronektin ile kaplanması gerekir, böylece embriyonik doku cama ^{yapışabilir25}.

1. PDMS dolgulu boru yapımı.
   1. ±1 m boru alın. Birden fazla boru parçası alınarak PDMS ile daha fazla boru doldurulabilir.
   2. Polimerizasyonu indüklemek için monomeri katalizörle 9: 1 oranında (w: w) karıştırarak gerekli miktarda PDMS hazırlayın.
      NOT: Plastik bardaklar ve çatallar gibi karıştırmak için tek kullanımlık aletler kullanın. Düzgün karıştırın.
   3. PDMS karışımını bir kurutucuya yerleştirin ve PDMS karışımından havayı çıkarmak için yaklaşık 30 dakika boyunca vakum uygulayın.
      NOT: PDMS'nin akması ihtimaline karşı kurutucunun içini mendillerle örtün.
   4. 3 mL'lik bir şırıngayı PDMS ile doldurun. Karışımda hava kabarcıkları oluşumunu önlemek için dikkatlice doldurun.
   5. 22 G'lik bir iğnenin ucunu boruya sokmak için forseps kullanın.
      NOT: Boruyu veya parmaklarınızı iğneyle delmemeye dikkat edin.
   6. Boruyu iğne aracılığıyla PDMS dolu şırıngaya takın. Yaklaşık 500 μL/s akış hızına sahip boruyu doldurmak için şırınga pompasını kullanın. Pompanın kırılmasını önlemek için çok yüksek basınç uygulamamaya dikkat edin.
   7. Boru tamamen PDMS ile doldurulduktan sonra, 15 cm'lik bir kaba koyun ve oda sıcaklığında (en az gece boyunca) kürleyin.
2. Deney için boruyu ve çipi hazırlayın.
   NOT: Deney için aşağıdaki borular gereklidir: birincisi, çıkış başına yaklaşık 50 cm boru ve ikincisi, giriş başına yaklaşık 2-3 m (kesin boyut, daha sonra kullanılan pompaların, inkübatörün veya mikroskobun mekansal organizasyonuna bağlıdır). Deney sırasında kültür ortamının embriyo kültürü için _CO2 ile dengelenmesine izin vermek için giriş borusunun uzun olması gerekir.
   1. Boruyu 45° açıyla kesin, böylece sivri uçlar oluşturulur; bu, boruyu çipin deliklerine yerleştirmeyi kolaylaştıracaktır. Giriş borularının her birine bir iğne takın. Bkz. adım 2.1.5.
   2. PDMS dolu boruları ±1 cm'lik tapalar halinde kesin. Sivri uçlar oluşturulacak şekilde 45° açıyla kesin; bu, boruyu çipin deliklerine yerleştirmeyi kolaylaştıracaktır. Herhangi bir boruya bağlı olmayan her deliği doldurmak için yeterli tıkaçlara ihtiyaç vardır.
   3. Yapışkan bandı çipten çıkarın.
   4. İğneler takılı tüm boruları, çipi ve tapaları bir kaba yerleştirin ve ±15 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakarak sterilize edin. UV sterilizasyonu imkanı olan herhangi bir hücre kültürü başlığı kullanılabilir.
3. Çipin fibronektin ile kaplanması.
   NOT: Posterior PSM'nin 2D ex vivo kültürlerinin kültürü için, çipi fibronektin ile kaplayın.
   1. Çipi oda sıcaklığında PBS +% 1 Penisilin / Streptomisin içeren bir beher içine yerleştirin. Çipin tamamen PBS ile kaplandığından emin olun. P200 pipetle havayı temizlemek için çipi PBS ile yıkayın.
      NOT: Çipin daha sonraki tüm işlemleri, çipe hava girmesini önlemek için deneyin başlangıcına kadar bu beherde yapılacaktır. Çipin cam kızağını kırmamaya dikkat edin.
   2. PBS'de 2 mL 1:20 Fibronektin hazırlayın ve bir beherin içine doldurun.
   3. Çipin her odası için 3 mL'lik bir şırınga yükleyin. Forsepsle, çıkış borusuna 22 G'lik bir iğne yerleştirin. İğneyi fibronektin içeren şırıngaya takın.
   4. Şırıngayı şırınga pompasına bağlayın. Boruda hava kalmayana kadar boruyu yıkayın.
   5. Çıkış borusunu çipin çıkışına takın. Boruyu dibe kadar ittiğinizden emin olun. Çipi kaplamak için düşük bir akış hızı ayarlayın. Diğer tüm açıklıklar açık kalabilir. Şırınga pompasının en az 2 saat çalışmasına izin verin, gece boyunca da çalışabilir.
   6. Pompayı durdurun. İğnenin hemen ardından boruyu kesin. Kalan boru, daha sonra deney sırasında çıkış görevi görecektir.

3. Mikroakışkanlar deneyi

NOT: Burada, Çentik sinyal inhibitörü DAPT'ın darbelerini uygulayarak 2D ex vivo kültürlerde fare segmentasyon saatinin sürüklenmesi için bir protokol sunulmaktadır. Fare segmentasyon saatinin doğal periyoduna (137 ^dk25) yakın, 130 dakikalık bir periyotla darbelerin uygulanması, verimli bir sürüklenmeye izin verir. 100 dakikalık orta ve 30 dakikalık 2 μM DAPT'lik darbeler uygulanır (Şekil 2A). Çip içindeki ilacın varlığı, floresan bir boya kullanılarak izlenir. Bu boyanın ve floresan sinyal raportörünün uyarma ve emisyon spektrumları, floresan gerçek zamanlı görüntüleme sırasında kanamayı önleyecek kadar farklı olmalıdır. Çentik sinyal muhabiri ^LuVeLu5 (Çılgın saçaklı-Venüs-Deli saçağı) gibi sarı floresan proteinler sinyal muhabiri olarak kullanıldığında, boya Cascade Blue uygulanabilir. Floresan boya ve muhabirin diğer olası kombinasyonlarını tanımlamak için, serbestçe kullanılabilen spektrum görüntüleyici kullanılabilir. Sürüklenmenin etkisi, dinamik sinyal muhabirlerinin gerçek zamanlı görüntülenmesiyle tespit edilebilir5,10,32. Her çipin iki kuluçka odası vardır. Bu, ilaç darbelerinin (DAPT) kontrol darbeleri (DMSO) ile doğrudan karşılaştırılmasını sağlar.

1. Orta ve degaz yapın.
   1. Deney gününde, 50 mL kültür ortamı hazırlayın (fare kuyruk tomurcuğu kültürü hakkında daha fazla bilgi için 0.5 mM glikoz, 2 mM glutamin ve% 1 BSA ile desteklenmiş DMEM-F12 ^bakınız25).
   2. Deney için ortamla dolu şırıngalar hazırlayın. Beherlerde kültür ortamı hazırlayın: Çentik sinyal salınımlarını yerleştirmek için, 1.2 μL DMSO + 10 μM Kaskad Mavisi ile 6 mL ortam hazırlayın; 2 μM DAPT + 10 μM Kaskad Mavisi ile 6 mL kültür ortamı; Her biri 6 mL orta alana sahip iki tüp. Şırınga başına en az 6 mL ortam kullanın. Şırıngaları ortamla yükleyin. İlaç ve DMSO içeren şırıngaları etiketlediğinizden emin olun.
   3. PBS içindeki çipi ve ortam içeren şırıngaları bir kurutucuda gazdan arındırın. Şırıngaları, ucu yukarı bakacak şekilde bir beherin içine yerleştirin, böylece hava üstten kaçabilir. Çipin yüzdüğü ve hala kabarcıklarla dolu olduğu ortaya çıkabilir. Bunlar daha sonra kaldırılacaktır.
   4. Bir P200 pipet kullanarak hava kabarcıklarının çoğunu çipten temizlemeye/emmeye çalışın. Bir miktar hava kalırsa, bu bir sonraki deney sırasında giderilecektir.
   5. Şırıngaları pompalara takın ve giriş borusunu şırıngalara takın. Çentik sinyalizasyonunu zorlamak için, biri orta şırıngaları taşıyan, diğeri ilaç / DMSO şırıngalarını taşıyan iki şırınga pompası kullanın. Hava kabarcıklarını borudan çıkarmak için denemenin başlangıcına kadar bunun daha yüksek bir akış hızında (0,5 mL/s) çalışmasına izin verin. Şırınga detaylarını (çapını) pompada doğru şekilde ayarlamaya dikkat edin.
2. Çip üzerine doku yüklenmesi.
   1. Fare embriyo dokusunu disseke edin. Kuyruğun en arka ucunu (kuyruk tomurcuğu) inceleyin. Disseke edilmiş dokuyu kültür ortamı + 25 μM HEPES'e yerleştirin.
   2. PBS'yi çıkarmak için çipi bir P200 kullanarak kültür ortamı + 25 μM HEPES ile yıkayın.
   3. P200 pipet kullanarak dokuyu çipe yükleyin (Şekil 1C). Çipin içine hava kabarcıkları sokmadığınızdan emin olun.
      NOT: Verimli yükleme biraz pratik gerektirir. Doku düzgün bir şekilde yönlendirilmemişse, dikkatlice emerek ve tekrar kızartarak çevirmek mümkün olabilir. Bununla birlikte, bu genellikle hızlı hücre ölümü ile sonuçlanır.
   4. Her doku yükleme adımından sonra, PDMS dolu bir boru parçası kullanarak ilgili doku yükleme girişini kapatın. Fişlerin kör cımbız kullanarak çipin dibine yeterince itildiğinden emin olun.
   5. Tüm numuneler yüklendikten sonra, kullanılmayan girişleri/çıkışları künt forseps kullanarak PDMS dolu boru parçalarıyla kapatın.
3. Mikroakışkan kurulumunun montajı.
   1. Mikroakışkan pompaların akış hızını düşürün. 60-100 μL / s, fare embriyo kuyruk tomurcukları için iyi çalışır. Daha yüksek akış hızlarında, hücre ölümü gözlendi - muhtemelen çok yüksek hücre kesme nedeniyle. Birden fazla pompanın kümülatif akış hızı, belirli bir zamanda mikroakışkan oda başına bu 60-100 μL / s'yi geçmemelidir.
   2. Boruyu mikroakışkan çipe takın. Bunu, çipin içine hava kabarcıkları sokmadan yapın (bu, borunun sonunda bir damla orta madde bulunduğundan emin olarak elde edilebilir). Fibronektin kaplamadan çıkışlar hala mevcuttur (bkz. 2.3).
   3. Tüm borular çipe tutturulduktan sonra, beherden çıkarın, uygun şekilde kurutun, bir kaba koyun ve bunu bir gece kültürü için bir inkübatörde (37 ° C,% 20 O2,% 5 _CO2) yaklaşık 1,5 m giriş borusu ile bir araya getirin. Boru gaz geçirgendir; bu, ortamdaki _{O2 ve CO2'nin} dengelenmesini sağlayacaktır. Alternatif olarak, eşzamanlı floresan gerçek zamanlı görüntüleme için, çip ve yaklaşık 1,5 m giriş borusu doğrudan mikroskopa yerleştirilir. Standart 96 kuyucuklu plaka tutuculara uyan çip için bir tutucu, Ek Dosya 3'te verilmiştir.
      NOT: Kuluçka sırasında nemin yeterince yüksek olduğundan emin olun. Gerekirse, mikroakışkan kurulumunda buharlaşmayı önlemek için görüntüleme odasına veya inkübatöre nemli bir doku ekleyin. Mikroskop inkübatöründeki nem çok düşükse, bu durum boruda ve mikroakışkan çipte hava kabarcığı oluşumuna neden olur. Daha sonra çip ve boruların yerleştirildiği kapalı bir görüntüleme kutusu kullanılabilir. Böyle bir görüntüleme kutusu yapmanın en basit yolu, çipin üzerine büyük bir kapak yerleştirmek ve ıslak bir doku eklemektir, tamamen kapatılması gerekmez. Pompa ve talaş arasındaki yükseklik farkının çok büyük olmadığından emin olun ve gerekirse yerçekimi nedeniyle hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için yükseklikleri yavaşça değiştirin.
   4. Kurulum son konumuna yerleştirildikten sonra tüm pompaların 20 dakika boyunca 20 μL/s akış hızında akmasına izin verin. Oda ve pompa büyük olasılıkla yükseklikte hareket ettiğinden, boruda doğru basıncı yeniden oluşturmak için bu gereklidir.
   5. İlaç pompasını kapatın, deney/gerçek zamanlı görüntüleme başlayana kadar sadece orta boy pompanın 60 μL/s hızda çalışmasına izin verin.
4. Denemenin başlangıcı.
   1. Deney için planlanan pompalama programını başlatın. Çentik sinyalizasyonunu zorlamak için, deneyin sonuna kadar, tipik olarak 24 saat boyunca tekrarlanan 100 dakikalık orta ve 30 dakikalık ilaç darbelerinden oluşan bir pompalama programı kullanın.
      NOT: Programlanabilir herhangi bir mikroakışkan pompa kullanılabilir. En basit formatta, pompalar manuel olarak programlanabilir ve çalıştırılabilir. Alternatif olarak, pompalar bir bilgisayar yazılımı ile kontrol edilebilir.
   2. Gerçek zamanlı görüntüleme yapılması durumunda, en az 30 dakikalık bir süre sonra görüntülemeye başlayın. Bu, çipin sıcaklığının inkübatör içindeki sıcaklığa ayarlanmasına izin verecek ve görüntüleme sırasında çok güçlü bir sürüklenmeyi önleyecektir. Otomatik odaklama hala faydalıdır.
   3. Ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak çipin cam sürgüsü aracılığıyla standart konfokal görüntüleme gerçekleştirin. 130 dakikalık bir süre ile sinyal salınımlarını yeterince tespit etmek için 10 dakikalık bir görüntüleme aralığı kullanın.
   4. Daha kısa süreler için, yeterli örnekleme için aralığı kısaltın. Çip üzerindeki ilacın varlığını görselleştirmek için Cascade Blue'nun algılanması için düşük çözünürlüklü bir görüntüleme izi ekleyin.
   5. Bir Venüs muhabirinin uyarılması için, 960 nm dalga boyunda 515 nm lazer veya 2 fotonlu lazer kullanın.
   6. 20x plan hedefi (çözünürlük 512 x 512 piksel, 1,38 μm/piksel) aracılığıyla 8 μm mesafeye sahip 6-8 düzlemden oluşan bir z yığını elde edin. Tek bir deneyde birden fazla örneği görüntülemek için motorlu bir aşama kullanın.
   7. 405 nm lazerle Kaskad Mavisi'ni heyecanlandırın ve her 10 dakikada bir tek bir z düzlemi elde edin (çözünürlük 32 x 32 piksel, 22,14 μm/piksel).
      NOT: Görüntüleme ve görüntü analizi hakkında daha fazla bilgi Temsili Sonuçlar'da verilmiştir ve ^{referans10'da} bulunabilir.

Sonuçlar

Bu protokolle, mikroakışkanlar kullanılarak fare segmentasyon saatinin sinyal salınımlarının harici olarak sürüklenmesi için bir yöntem sunulmaktadır. Çentik sinyal inhibitörünün darbeleri uygulanarak, bağımsız embriyo kültürlerindeki sinyal salınımları birbirleriyle senkronize ^edilir10. Bu sistemin segmentasyon saatinin işlevselliğini incelemek için uygulanmasının ön koşulu, sinyal dinamiklerinin ve segmentasyonun çip üzerinde hala mevcut olmasıdır. Daha önce hem Wnt hem de Notch sinyal dinamiklerinin sabit orta akışa rağmen korunduğu ve fiziksel sınır oluşumunun periferik 2D kültürlerde devam ettiği ve ön ^PSM10'u temsil ettiği gösterilmiştir.

Sinyal salınımlarının harici ilaç darbelerine sürüklenmesini doğrulamak için, örneğin mikroakışkan deney sırasında sarı floresan proteini Venüs'ü ifade eden Çentik sinyal muhabiri ^LuVeLu5'in gerçek zamanlı görüntülenmesi gerçekleştirilir. 2D kültürlerin çip üzerindeki oryantasyonunu kontrol etmek zor olduğundan, ön dokudaki sinyal salınımları analiz edilir. 2B kültürün çevresi yeniden üretilebilir şekilde tespit edilebilir. Çip üzerindeki doku kesitlerinin oryantasyonu istenildiği zaman kontrol edilemez ve çipin tüm iç yüzeyi Fibronektin ile kaplanır. Bu nedenle, bazen kültürlerin çipin yanlarına veya tavanına tutturulması olur. Numunelerin görüş alanının dışına çıkması durumunda (x, y ve z yönünde) veya kuyruğun arka ucu aşağı bakacak şekilde yapışırsa, genellikle bu örnekler hariç tutulur.

Daha fazla analiz için, bu tür sürüklenme deneylerinin birçoğu birleştirilmiştir. Bağımsız deneyler, yaklaşık 400 nm'de Cascade Blue boyası tarafından görselleştirilen ilaç darbelerinin zamanlaması kullanılarak birbirleriyle hizalanabilir. Senkronizasyonu analiz etmek ve görselleştirmek için, niceliksel salınımlar trendden arındırılabilir (Şekil 2B, D) ve daha sonra ortalama ve standart sapma olarak görüntülenebilir veya salınımların fazları hesaplanabilir. Bu, bağımsız posterior embriyo kültürlerinin birbirlerine ve eksternal ilaç darbelerine salınımları arasındaki faz-ilişkinin analizini sağlar (Şekil 2C, E). Python tabanlı ^pyBOAT33 programı, bu tür sinyal salınımlarının periyodunu, fazını ve genliğini belirlemek için basit ve kullanıcı dostu bir araçtır. Sürüklenmeyi doğrulamak için, örneğin, endojen sinyal salınımlarının periyodu belirlenebilir. 130 dakikalık bir periyotla darbeler uygulanırken, Çentik sinyal salınımları da 130 dakikalık bir periyot gösterir (Şekil 2F)¹⁰. Ek olarak, Cascade Blue darbeleri kullanılarak, farklı sinyal muhabirleriyle yapılan bağımsız deneyler birbirine hizalanabilir. Bu şekilde, çoklu sinyal muhabirlerinin salınımları arasındaki faz-ilişki dolaylı olarak ^{belirlenebilir10}.

Böylece, sunulan mikroakışkan sistem, gelişmekte olan fare embriyosunun ex vivo kültürlerinde sinyal salınımlarının kontrolüne izin verir. Segment oluşumu ve farklılaşması için belirteçlerin görüntülenmesi ile birlikte, bu sistem artık segmentasyon saatinin sinyal yollarının nasıl etkileşime girdiğini ve somit oluşumunu nasıl kontrol ettiklerini incelemek için uygulanabilir.

Şekil 1: Mikroakışkanlar protokolüne şematik genel bakış. (A) Çip kalıpları, bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı kullanılarak tasarlanabilir. Fare somitogenezinin ex vivo modellerinde sinyal salınımlarını içine almak için bir çip tasarımı sağlanmıştır. Kalıplar, örneğin, 3D baskı ile üretilebilir veya sipariş edilebilir. Mikroakışkan çipler PDMS'nin kalıplanması ile üretilir. Sertleştirilmiş bir PDMS çipi kesilir ve bir plazma fırını kullanılarak bir cam slayta kovalent olarak bağlanır. Çip içindeki cam yüzey, disseke edilmiş dokunun yapışmasını sağlamak için fibronektin ile kaplanır. Embriyonik doku, daha sonra kapatılan yükleme girişleri yoluyla çip üzerine yüklenir. Farklı ortam koşullarına sahip pompalar talaş girişlerine bağlanır ve bir akış programı başlatılır. Deney sırasında doku konfokal mikroskop kullanılarak görüntülenebilir. (Kymographs, Sonnen ve ark., 201810'dan uyarlanmıştır. Creative Commons Atıf CC BY-NC-ND 4.0'a göre Cell'den yeniden basılmış ve değiştirilmiştir.) (B) Arka fare embriyo dokusunun çip üstü kültürü için bir kalıp tasarımının şematik çizimi. Mikroakışkan kanalların yüksekliği, posterior embriyonik fare kuyruklarının kültürü için yeterli olan 500 μm'dir. Bu kalıbı yazdırmak için gereken dosya Ek Dosya 1'de sağlanır ve Ek Dosya 2'de bir alternatif verilir. (C) Çip üzerindeki PDMS sütunlarıyla çevrili E10.5 kesitli fare kuyruğunun parlak alan görüntüsü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Bir mikroakışkanlar deneyinden elde edilen temsili sonuçlar. (A) Orta ve ilaç pompası ile sürüklenme deneyinin şematik gösterimi. Sinyal yolu modülatörünün darbeleri, fare embriyolarının ex vivo kültürlerine uygulanır ve sinyal salınımları, dinamik sinyal muhabirlerinin gerçek zamanlı görüntülenmesiyle görselleştirilebilir (örneğin, Notch sinyal muhabiri ^LuVeLu5 ve Wnt sinyal muhabiri Axin2T2A10). Kesikli çizgiler, zaman içinde analizler için kullanılan bölgeyi gösterir. (B-F) LuVeLu muhabir salınımları, Çentik sinyal inhibitörü DAPT'ın periyodik darbeleri tarafından sürüklenir. (B,D) DAPT veya DMSO kontrolü kullanılarak sürüklenme üzerine ön PSM'deki Çentik sinyal salınımlarının nicelleştirilmesi. (C,E) Çentik sinyal salınımlarının fazı ile harici DAPT/DMSO darbelerinin zamanlaması arasındaki faz-faz ilişkisi grafikleri. Sürüklenme durumunda, istikrarlı bir faz ilişkisi kurulur. (F) DMSO ve DAPT darbeleri ile sıkıştırılmış numuneleri karşılaştıran muhabir salınımlarının ortalama periyodunun ve SEM'inin ölçülmesi. (Şekil Sonnenet al., 201810'dan uyarlanmıştır. Creative Commons Atıf CC BY-NC-ND 4.0'a göre Cell'den yeniden basılmış ve değiştirilmiştir.) Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sorun	Önerilen çözüm(ler)
PDMS cama yapışmaz.	- Hem PDMS'nin hem de camın temiz olduğundan emin olun.
	- Odanın etrafında yapıştırma için yeterli PDMS olduğundan emin olun.
	- Plazma fırının ayarlarını optimize edin.
Çipimde hava kabarcıkları var.	- Pompanın açık olup olmadığını kontrol edin.
	- Çip üzerine doku yüklemeden önce çipin gazını çözün.
	- Deney başlamadan önce ortamın gazını boşaltın.
	- Kuluçka odasındaki nemin yeterince yüksek olduğundan emin olun.
Doku deneyin başında ölür.	- Çipi yüklerken ve monte ederken ortama HEPES ekleyin.
	- Yükleme sırasında dokuyu çok sık içeri ve dışarı yıkamayın.
	- Akış hızının çok yüksek olmadığını kontrol edin.
Doku görüntüleme sırasında ölür.	- Görüntülemeden fototoksisite olmadığından emin olun
	- Kirlenme olmadığından emin olun.
	- Debi çok yüksek olmamalıdır.
Görüntüleme sırasında odak değişir.	- Görüntüleme slaytının sürüklenmesini ayarlamak için görüntüleme sırasında otomatik netleme kullanın.
	- Çipin mikroskop içindeki sıcaklığa en az 30 dakika eşit olmasına izin verin.
Çıkışlar/girişler ayrılır.	- Tüm boruları tamamen aşağıya doğru itin.
Çipin camı kırılır.	- Daha dikkatli olun, cam çok kırılgandır.
	- İnce cam sadece görüntüleme için gereklidir. Görüntüleme yapılmazsa, normal bir kalın cam slayt kullanılabilir.
	- Kırılma çipin dışındaysa, sorun olmayabilir. Talaşa giden cam conta kırılırsa, sıvı dışarı sızacak ve hava içeri girecektir.
Çipimde bir kirlenme var.	- Kültür ortamına antibiyotik ekleyin.
	- Tüm ekipman ve boruları sterilize edin.
	- Hızlı ve temiz çalışın.

Tablo 1: Sorun Giderme

Ek Dosya 1: 3D yazıcı ile bir kalıp yazdırmak için STL dosyası. Bu kalıp, arka embriyonik dokunun çip üstü kültürü için mikroakışkan bir çip oluşturmak için kullanılır (tasarım Şekil 1'de gösterilmiştir). Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 2: STL dosyası, arka embriyonik dokunun çip üstü kültürü için mikroakışkan bir çip oluşturmak üzere 3D yazıcı ile bir kalıbı yazdırmak için. Ek Dosya 1'in ve Şekil 1'de gösterilen tasarımın aksine, bu tasarım, az miktarda havanın ana mikroakışkan odaya girmesini önlemek için tüm girişlerde kabarcık tuzakları içerir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 3: Çipi mikroskopa yerleştirmek için bir tutucunun oluşturulması için tasarım dosyası. Bu tutucu 96 delikli bir plakanın boyutlarına sahiptir ve çoğu mikroskobun standart tutucularına uymalıdır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tartışmalar

Sinyal dinamiğinin çok hücreli sistemleri nasıl kontrol ettiği, bu alanda uzun süredir devam eden bir soru olmuştur. İşlevsel araştırma önemli bir zorluk teşkil eder, çünkü bu dinamiklerin buna izin vermek için ince bir şekilde modüle edilmesi ^gerekir11. Yol pertürbasyonları üzerindeki bu tür zamansal kontrol, prensip olarak, yüksek bir mekansal kontrol sağlayan optogenetik ile ^{sağlanabilir34}. Bununla birlikte, optogenetik, söz konusu her sinyal yolunun analizi için sofistike genetik araçların kurulmasını gerektirir. Burada açıklanan mevcut protokol, herhangi bir sinyal yolunun bozulması için çok yönlü bir araç sağlar. Mikroakışkanlar deneyi, doku kültürlerinde sinyal yolaklarının dinamiklerini fonksiyonel olarak araştırmak için geçici olarak kontrol edilen ilaç darbelerinin uygulanmasına izin verir. Burada, odak noktası ex vivo kültürlerde somitogenezin incelenmesidir, ancak protokol diğer model sistemlere uyacak şekilde uyarlanabilir.

Protokoldeki belirli adımlar, başarılı bir mikroakışkanlar deneyi gerçekleştirmek için kritik öneme sahiptir (Tablo 1'de özetlenmiştir). Anahtar noktalar aşağıdaki gibi tartışılmaktadır. Deney sırasında orta akış nedeniyle, doku kültürü kayma stresi yaşar. Model sistemin sürekli akışa maruz kalması, hücre stresine ve aşırı durumlarda kesme etkisine bağlı hücre ölümüne neden olabilir. Fare kuyruk tomurcuklarının ex vivo doku kültürleri ve mevcut çip tasarımı için, 60 μL / s'lik bir akış hızının (maksimum 100 μL / s) minimum kesme etkisiyle iyi çalıştığı bulunmuştur. Aynı talaş için birden fazla pompa aynı anda açıldığında, toplam debide bir artışa neden olmamak için her bir pompanın akış hızının buna göre ayarlanması gerekir. Mevcut protokol diğer model sistemlere ve çip tasarımlarına uyarlandığında, akış hızı optimize edilmelidir. Alternatif olarak, ortamı sürekli olarak yıkamamak, ancak çip üzerindeki ortamı periyodik olarak değiştirmek ^{mümkündür35}. Böyle bir kurulum, fare somitogenezindeki sinyal salınımlarını kontrol etmek için de uygulanabilir (yayınlanmamış, veriler gösterilmemiştir). Dahası, doku kültürlerinin doğrudan sıvı akışına maruz kalmadığı, ancak ilaçların komşu bir kanaldan difüzyon yoluyla dokuya ulaştığı bir kurulum da öngörülebilir. Bu tür sistemler, büyüme faktörlerinin gradyanlarını ESC farklılaşmasının in vitro modellerine uygulamak için başarıyla ^{kullanılmıştır14,36}.

Mikroakışkan deneylerin önemli bir konusu, deney sırasında çip üzerinde hava kabarcıklarının oluşmasıdır. Talaş veya boru içindeki hava kabarcıkları, çip üzerindeki düzgün sıvı akışına müdahale edebilir ve embriyo kültürünün bulunduğu yerden uzaklaştırılmasına neden olabilir. Hava kabarcıklarının varlığını önlemek için, protokolün çeşitli adımları vazgeçilmezdir. İlk olarak, şırıngalar içindeki kültür ortamı ve mikroakışkan çipin kendisi bir kurutucu kullanılarak gazdan arındırılmalıdır (adım 3.1.3). İkinci olarak, numuneleri yükleme girişlerine yüklerken, numuneyle birlikte çipe hava pipetlememeye dikkat edilmelidir (adım 3.2.3). Üçüncüsü, boruyu ortamla doldururken, çip takılmadan önce tüm hava kabarcıkları dışarı pompalanmalıdır (adım 3.3.2). Aksi takdirde, bu kabarcıklar deney sırasında ana çipe itilecektir. Son olarak, deney sırasında, yarı geçirgen boru nedeniyle ortam görüntüleme odası veya inkübatör içinde dengelenir. Borunun geçirgenliği aynı zamanda ortamın buharlaşmasına da izin verir, bu nedenle tüpte yeni kabarcıkların oluşumunu önlemek için deney sırasında nemin düzenlendiğinden emin olun.

Genel olarak, mikroakışkanlar, araştırmacının özel sorusuna uyarlanabilen çok yönlü bir araçtır. Mevcut tasarım yaklaşımı, çip başına paralel olarak 12 adede kadar ex vivo kültürün görüntülenmesini sağlar. Bu sayı esas olarak deney başına embriyo sayısı ve her embriyo kültürünü yeterli çözünürlükte görüntülemek için gereken süre ile sınırlıdır. Tek bir deneyde birden fazla koşulun karşılaştırılması gerekiyorsa, tek bir cam slayta birden fazla talaş monte edilebilir. Birden fazla doku eksplantının paralel olarak görüntülenmesi için ideal olan bir çip tasarımı sağlanır, ancak kişiselleştirilmiş tasarımlar, yüksek verim analizine izin vermek ve tek bir deneyde daha fazla koşulun kombinasyonunu artırmak için numune sayısındaki sınırlamaların üstesinden ^{gelebilir16,17}. Mikroakışkanlar, bir çip üzerinde kültürlenebilen modellerle sınırlıdır ve çip üzerindeki kültürün her model sistemi için ayrı ayrı optimize edilmesi ^{gerekecektir27,37,38}.

Son 5-10 yılda, mikroakışkanlar, yüksek verimli yaklaşımlar ve sinyal dinamikleri ve gradyanlarının ince modülasyonları için potansiyeli nedeniyle çeşitli biyolojik soruları ele almak için uygulanmıştır. Günümüzde mikroakışkanlar, laboratuvarların kolaylıkla kurabileceği kolay uygulanabilir, ucuz ve çok yönlü bir araç haline gelmiştir. Burada, mevcut protokol belirli bir uygulama için, yani somitogenezi yöneten sinyal dinamiklerini incelemek için optimize edilmiştir. Bu protokolü ve tasarımı, doku biyolojisindeki bireysel araştırma sorularına uyacak şekilde uyarlamak kolaydır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL syringe	Becton, Dickinson and company	300912
184 Silicon Elastomer curing agent	SYLGARD	1673921
184 Silicon Elastomer PDMS	SYLGARD	1673921
3 ml syringes	Becton, Dickinson and company	309657
Adhesive tape			Scotch Magic tape or similar
Blunt-tip forceps Bochem 18/10 Stainless steel	Fisher Scientific	10663341
Bovine Serum albumin Lyophilised pH~7	Biowest	P6154
Compressed air system
Crystallizing dish	VWR	10754-7	Sterilized
D-(+)-Glucose 45%	Sigma	G8769
Desiccator	VWR	467-0104
Disposable cups	Duni	173 941
Disposable forks	Staples	511514
Dissection equipment
DMEM/F12	Cell culture technologies	custom	DMEM/F-12, no phenol red, no L-glutamine, no Glucose
Fibronectin	Sigma	F1141-5MG
Flow hood BioVanguard Greenline	CleanAir by Baker	511514	For UV light source
Glass slide No 1.5H high precision, 70x70 mm	Marienfeld	107999098
HEPES Buffer	Gibco	15630-056
L-glutamine	Gibco	25030024
Microscope	Leica	Leica SP8 MP
Needles 22G	Becton, dickinson and company	z412139-100EA
Oven	VWR	390-09
PBS0
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070063
Plasma oven Femto	Diener electronic
Punch Ø 1mm	Uni-Core	WB100073
Scale	Sartorius	Entris
Syringe pump	WPI	AL-4000
Tubing Ø 1mm	APT	AWG24T
Vacuum pump	VWR	181-0308