μTongue: Dil In Vivo için Mikroakışkan tabanlı fonksiyonel görüntüleme platformu

Özet

Makale, mikroakışkanları dildeki bir intravital görüntüleme penceresine entegre ederek fonksiyonel tat hücresi görüntüleme in vivo için μTongue (dil üzerinde mikroakışkanlar) cihazını tanıtmaktadır.

Özet

İntravital floresan mikroskopi, canlı bir hayvanda çok hücreli dinamikleri incelemek için yaygın olarak kullanılan bir araçtır. Ancak tat duyusal organda başarıyla kullanılmamıştır. μTongue, mikroakışkanları intravital dil görüntüleme penceresine entegre ederek, birden fazla şok tabancasına kontrollü maruz kalma altında vivo tat hücrelerinin güvenilir fonksiyonel görüntülerini sağlar. Bu yazıda, μTongue sistemini kullanmak için ayrıntılı bir adım adım prosedür sunulmuştur. Beş alt kategori vardır: lezzetli çözümlerin hazırlanması, mikroakışkan bir modülün kurulması, numune montajı, işlevsel görüntü verilerinin alınması ve veri analizi. μTongue kullanırken ortaya çıkabilecek pratik sorunları çözmek için bazı ipuçları ve teknikler de sunulmaktadır.

Giriş

Intravital floresan mikroskop, canlı dokular üzerindeki mekansal dinamikleri incelemek için yaygın olarak kullanılır. Araştırmacılar, biyolojik süreçlerin floresan sinyallerine belirli ve hassas dönüşümlerini sağlayan genetik olarak kodlanmış sensörler geliştiriyorlar - bu sensörler yaygın olarak bulunan floresan mikroskoplar kullanılarak kolayca kaydedilebilir^1,2. Kemirgenlerdeki çoğu iç organ mikroskop kullanılarak araştırılmış olsa da, dile başarılı uygulaması henüz başarılı olmamıştır³.

Tat hücrelerinin kalsiyum görüntülemesi üzerine daha önceki çalışmalar, sirkülasyon tat tomurcukları 4^,5,⁶elde etmek için bir dil dokusunu ince bölümlere ayırarak veya mantar formu tat tomurcukları elde etmek için tat epitelini soyarak ex vivo yapıldı^7,8. Bu örneklerin hazırlanması kaçınılmaz olarak invazivdi, bu nedenle sinirlerin innervasyonu, geçirgenlik bariyerleri ve kan dolaşımı gibi doğal mikroçevreler büyük ölçüde pertüre edildi. İlk intravital dil görüntüleme penceresi 2015 yılında Choi ve arkadaşları tarafından bildirilmiştir, ancak akışkan tastant uyaranların neden olduğu hareket ve optik eserler nedeniyle güvenilir fonksiyonel kayıt elde edilemedi⁹.

Son zamanlarda, mikroakışkanlar-on-a-language (μTongue)^{tanıtıldı 10}. Bu cihaz, fare dilinde bir görüntüleme penceresi ile mikroakışkan bir sistemi entegre eder. Görüntüleme süresi boyunca sabit bir uyarıcı uyaran akışı elde edilerek, akışkan hareketten elde edilen eserler en aza indirilebilir (Şekil 1). Giriş porti bir dizi çok kanallı basınç kontrolörü tarafından beslenirken, çıkış bağlantı noktası 0,3 mL/ dk tutan bir şırınna pompasına bağlanır. Ek olarak, şok çözeltilerinin kırılma indekslerindeki farklılık nedeniyle oluşan optik eserler, kalsiyuma duyarsız bir gösterge (tdTomato) ve kalsiyum göstergesi (GCaMP6)^11.'yitanıtan oranmetrik analiz ile en aza indirilmiştir. Bu tasarım, akışkan kanallar arasında ani geçişle bile tat hücrelerinin vivo mikroskobik stabilitesini sağladı. Sonuç olarak, μTongue, vivo fare tat tomurcuklarına birden fazla şok tabancasının güvenilir bir fonksiyonel taramasını uygular.

Bu protokolde, μTongue kullanılarak in vivo fare mantar formu tat tomurcuklarının kalsiyum görüntülemesi için deneysel prosedürler ayrıntılı olarak açıklanmıştır. İlk olarak, yapay tükürük ve lezzetli çözeltilerin hazırlanması açıklanmaktadır. İkinci olarak, yarı sabit durum akışını sağlamak için mikroakışkan sistemin kurulmasına geçilir. Üçüncü olarak, görüntü alımına izin vermek için fare dilini μTongue'a monte etmek için kullanılan prosedürler tanımlanmıştır. Son olarak, yanal hareket yapıtlarının ve oranmetrisinin düzeltilmesi de dahil olmak üzere görüntü analizi için her adım belirtilir. Bu protokol, bir fare tesisi ve iki foton mikroskobu veya eşdeğer bir ekipman ile herhangi bir araştırma laboratuvarına kolayca uyarlanabilir.

Protokol

Tüm cerrahi prosedürler Sungkyunkwan Üniversitesi ve Seul Ulusal Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı.

1. Çözümlerin hazırlanması: yapay tükürük ve şok tabancaları

1. 2 mM NaCl, 5 mM KCl çözünerek yapay tükürük hazırlayın, 3 mM NaHCO_3,3 mM KHCO_3,0,25 mM CaCl_2,0,25 mM MgCl_2,0,12 mM K₂HPO₄, damıtılmış suda 0,12 mM KH₂PO₄ve 1,8 mM HCl (>1 L) ve çözeltinin pH'ını 7 olarak ayarlayın(bkz. Malzeme Tablosu )¹².
2. Ekşi: 10 mM sitrik asit gibi uyarıcılar hazırlayın; tuzlu: 400 mM NaCl, isteğe bağlı olarak 50 μM amilorid ile; tatlı: 40 mM asasulfame K; acı: 1.1 adımında hazırlanan yapay tükürükteki tatma kimyasalını eriterek 5 mM kinin, 5 mM denatonyum ve 20 μM sikloeximid karışımı.

2. Mikroakışkan sistemin hazırlanması

NOT: Şok tabancaları basınçlı çok kanallı akışkan bir dağıtım sistemi kullanılarak fare diline teslim edilmiştir (şekil 1 ve malzeme tablosunabakın).

1. Basınçlı akış perfüzyon sisteminin rezervuarlarını yapay tükürük ve şok tabancaları ile doldurun.
2. Basınçlı hava hattını regülatör girişine bağlayın ve akışkan teslimat sisteminde hava basıncını 30 ila 50 psi arasında ayarlayın.
3. Regülatörün çıkış basıncını 0,4 psi olarak ayarlayın ve bu basınç altında tüpten sıvı çıkıp çıkmamasını kontrol edin.
4. Manifoldu rezervuarlardan μTongue giriş limanına bağlayın.
5. μTongue çıkış portu bir şırıng pompasına bağlayın ve sabit durum durumunu belirlemek için sıvıyı ~300 μL⭐min^-1 ile çekin. μTongue altında asılı bir damlacık sabit hacmini gözlemleyin. Örnek yüksekliğe bağlı olarak ayar parametresinin değerini ayarlayın.
6. Basınçlı hava hattını çıkarın ve protokol 3 tamamlanana kadar şırınna pompasını durdurun.

3. In vivo görüntüleme için fare hazırlığı(Şekil 2).

NOT: Tüm hayvan preparatları gündüzleri bir laboratuvar tezgahında aseptik koşullar altında gerçekleştirildi.

1. Fare anestezisi
   1. Her iki cinsiyette de 7 haftalık veya daha yaşlı bir fare hazırlayın. Tat hücrelerinde kalsiyum algılayan floresan proteinleri ifade eden genetiği değiştirilmiş bir fare hattı kullanın.
   2. Fare anestezi için kısıtlanmıştır. Fareye intraperitoneally olarak 100 mg/ kg ketamin ve 10 mg / kg ksilazin karışımı enjekte edilir¹³.
2. %2,5 W/V fosfat tampon salinindeki TRITC-dektran (500 kDa), görüntüleme seansı sırasında kan dolaşımını gözlemlemek için retro yörüngeli bir rota üzerinden fareye intravenöz olarak iletilir.
3. Hareket yapıtlarını en aza indirmek için fare kafatasına bir kafa düzeltici takın.
   1. Fare başı% 70 ETOH ile püskürtülürken, fare bir destek konumuna yerleştirilir. Kafa derisini sertps ile hafifçe kaldırın ve makasla yaklaşık 7 mm² kesin.
   2. Saç derisinin etrafındaki saçları temizleyin, cildin altındaki periosteumu çıkarın, kafatasına anında bir yapıştırıcı uygulayın ve özelleştirilmiş bir kafa düzeltici takın.
   3. Anında yapıştırıcı sertleştikten sonra, baş düzelticinin etrafına diş yapıştırıcısı uygulayın ve diş tutkalını katılaştırmak için mavi bir ışıkla aydınlatın.
4. Fare dilini μTongue'un alt birimine yerleştirin.
   1. Farenin alt dudağını anında yapıştırıcı ile μTongue'un alt ünitesine takın.
   2. Fareyi tahtaya yerleştirin (Şekil 1B'dekifare hazırlama tahtası) ve μTongue'un alt birimini direklere yerleştirin (Şekil 1B'deμTongue tutma direği). Alt ünitenin kenarındaki deliklerin direğe hizalı olduğundan emin olun.
   3. Fare kafası düzelticisini tahtadaki kafa düzeltici tutucusuna sıkın. Ardından, fare kafası ile cihaz arasındaki mesafeyi ayarlayın. Kafa sabitleyici tutucuyu kullanarak fare kafasını yaklaşık 45° düzgün bir şekilde döndürün. Bu işlem mikroskop hedefi ile fare burnunun fiziksel temasını önler.
   4. Fare dilini plastik cımbız kullanarak hafifçe çizin ve dilin ventral tarafını μTongue'un alt ünitesinin üst tarafına takın. Ardından, fare dilinin yüzeyini ıslak bir pamuklu çubukla silin.
   5. Bir kağıt parçasını yapay tükürükte bekletin ve ıslak bir durumu korumak için fare dilinin açık yüzeyine yerleştirin.
   6. Kavisli pulları μTongue'un alt kısmının her iki ucunun her iki ucunun da yer tutan direklere yerleştirin.
5. Fare hazırlığını mikroskop aşamasına yerleştirin. Açıkta kalan fare dilini mikroskop nesnel alanının yaklaşık merkezinin altına yerleştirin. Sahnenin dinamik aralığından sapmamaya dikkat edin. Ardından, sahnedeki fare tahtasını vidalarla sıkın.
6. Isıtma yastığını fare gövdesinin altına yerleştirin ve sıcaklığı 36,5 °C-37,5 °C'de koruyun. Fare gövdesi sıcaklığını bir sıcaklık sensörü ile izleyin ve sıcaklık sensöründen gelen geri bildirim sinyalini kullanarak ısıtma yastığının sıcaklığını kontrol edin.
7. İnce bir kağıt parçasını çevirin ve sıvının fare nefes borusuna girmesini önlemek için farenin ağzına yerleştirin.
8. Islak dokuyu fare dilinden çıkarın ve hazırlanan μTongue'u fare diline yerleştirin. Dilin üzerine mikroakışkan bir kanal yerleştirin ve görüntüleme penceresinden dilin yüzeyini gözlemleyecek şekilde konumunu ayarlayın.
9. μTongue'yi her iki ucu da minimum basınç basıncıyla hafifçe vidalayarak sabitleyin.

4. Görüntüleme kazanımı

1. 920 nm iki foton lazeri ve mikroskobu kullanımdan önce açın.
2. Suya daldırma hedefini (16x, NA 0.80 veya 25x, NA 1.1) mikroskop üzerine monte edin. Damıtılmış suyu μTongue'un görüntüleme penceresine bırakın ve hedefi daldırın.
3. Kamera modunda, cıva lambasını kullanarak ışığı açın ve dilin yüzeyini aydınlatın.
4. Z eksenini ayarlayarak, yaklaşık odak düzlemini bulmak için filiform papilladan gelen otofluoresan sinyali arayın. Ardından, X ve Y ayar düğmesini kullanarak bir tat alma tomurcuk bulun.
5. Çokoton moduna geçin. Görüntü alma koşullarını aşağıdaki gibi ayarlayın: heyecan dalga boyu: 920 nm; emisyon filtre seti: 447/60 nm, 525/50 nm ve 607/70 nm; çift yönlü raster tarama modu, çerçeve boyutu: 512 x 512.
6. Tat alma tomurcuklarını görüntü penceresinin ortasına yerleştirmek için X ve Y konumlarını ayarlayın.
7. Tat alma tomurcukunun yaklaşık üçte iki yüksekliğinde tat tomurcukunu çevreleyen kan damarlarını arayın. Protokol adım 3.2'den TRITC-dektran (500 kDa) enjeksiyonu ile kan dolaşımını görselleştirin. Kan akışı tıkanırsa, kan akışını sağlamak için sabitleme vidalarını hafifçe gevşetin.
8. Z eksenini ayarlayın ve yeterli sayıda tat hücresi içeren tat tomurcuklarının Z düzlemini bulun.
9. 80 s için 2-6 Hz ile kalsiyum görüntülemeye devam edin. Görüntüleme başladıktan sonra akışkan sistemin rezervuarını açarak 20 s'lik bir tat çözeltisi sağlayın. 20 s tat stimülasyonundan sonra rezervuarı tekrar yapay tükürük sınayın.
10. Sıralı görüntüleme bittikten sonra, bir sonraki görüntüleme seansına kadar yaklaşık 3-4 dakika bekleyin. Yapay tükürüğün fare diline akmasını ve önceki görüntüleme seansındaki gergin remanent'i temizlemesini tutun. Denemenin tasarımına bağlı olarak, oturumu gerektiği gibi tekrarlayın.
11. In vivo kalsiyum görüntüleme tamamlandığında, fareyi IACUC prosedürüne göre ötenazi edin. Anestezi altındaki fare CO₂ odasında feda edilir.
    NOT: Bir parmak sıkışma refleksi kullanarak anestezinin derinliğini kontrol edin. Bir görüntüleme seansı sırasında, rezervuarlardan yapay tükürük sürekli olarak sağlanmalıdır. Kabarcıklar μTongue görüntüleme penceresinde görünürse, kabarcıkları güçlü sıvı basıncı kullanarak μTongue'un girişine veya çıkışına iterek çıkarın.

5. Görüntü analizi (Şekil 3)

1. Resim dönüştürme
   1. Fiji¹⁴ veya benzer bir görüntü analiz yazılımı kullanarak ham görüntü dosyalarını açın.
   2. NPL Bud Analyzer kodunu kullanmak için görüntü dosyasını RGB yığın dosyasına dönüştürün.
      1. Görüntü > Renk > Bölünmüş Kanallar
      2. Görüntü > Renk > Kanalları Birleştirin ve 5.2.1 adımından görüntüyü seçin.
      3. Görüntü > Renk > Yığını RGB'ye
2. Resim kaydı
   NOT: Veri analizi için özel yazılmış kodu kullanın. Lütfen https://github.com/neurophotonic/Tastebud-analyzer bakın.
   1. Taste_GUI.madlı kodu çalıştırın; NPL Bud Analyzer adlı bir GUI penceresi açılır. Sağ üst köşedeki Yeni Analiz düğmesine tıklayın, ardından dönüştürülen görüntüyü adım 5.1'den yükleyin. Kare hızını yüklenen görüntünün üzerine ayarlayın.
   2. Kayıt için yüklenen görüntünün üzerine ilgi çekici bölgeyi (YG) çizin. Seçilen yatırım getirisini çift tıklayıp otomatik olarak hesaplanan bir kayıt başlayacaktır.
3. Göreli floresan yoğunluğu değişikliklerini elde edin (ΔF/F)
   1. 5.2 adımındaki kayıtlı görüntüyü otomatik olarak göstermek için NPL Tomurcuk Çözümleyicisi penceresine geri dönün. Kullanıcının zaten bir reg dosyası varsa, Veri Yükle düğmesini tıklatın ve _reg.tif dosyasını seçin.
   2. CIRCLE veya POLYGON düğmesine tıklayın ve tat hücresinin yatırım getirisini tat alma tomurcuk görüntüsünün üzerine getirin.
   3. Bu, seçilen tat hücresinin ham floresan yoğunluğunu ve kalsiyum izini (ΔF/F)tat alma tomurcuk görüntüsünün altında otomatik olarak sunar.
   4. GUI'nin sağ tarafındaki kalsiyum izini (ΔF/F)sunmak için İzlemeyi Kaydet'e tıklayın, ancak yatırım getirisi tat alma tomurcuk görüntüsü üzerinde gösterilir. Yatırım getirisi seçimi tamamlanana kadar 5.3.2-5.3.4 adımlarını yineleyin.
      NOT: Son seçilen yatırım getirisi ve kalsiyum izlemesini ortadan kaldırmak için yatırım getirisi yanlış seçilmişse İzlemeyi Sil düğmesine tıklayın.
   5. Yatırım getirisi seçimi tamamlandıktan sonra, sağ alt köşeye dosya adını yazın ve ΔF/F kalsiyum izini .xls bir biçim olarak dışa ve PPI'lı şok tomurcuk görüntüsünü .bmp bir biçimde dışa aktarmak için Son düğmesine tıklayın.
4. Kalsiyum izinin analizi
   1. Adım 5.3'ten elde edilen kalsiyum izini analiz edin. Tat hücrelerinin, floresan 4 teslim edildikten sonra floresan yoğunluğu taban çizgisinin ikiden fazla standart sapması arttığında p -değerlerinin^{eşleştirilmiş}veya eşleşmemiş t^-testleri10 kullanılarak 0,01'den az olduğunda şok tabancasına tepki verdiğini düşünün.
   2. Tat hücresini bir yanıtlayıcı hücre olarak düşünün, eğer üç denemeden iki kereden fazla bir tastant yanıt veriyorsa (~%60)¹⁵.
   3. Adım 5.4.1'den elde edilen bireysel kalsiyum izlerini ortalama alarak temsili kalsiyum izlerini elde edin.

Sonuçlar

Pirt-GCaMP6f-tdTomato faresi tat alma tokası görüntüsü elde etmek için kullanıldı. Fare dilinin yüzeyi otofluoresan filiform papilla ile kaplıydı. Tat tomurcukları dilin yüzeyine seyrek olarak yayılır (Şekil 4A). Tat alma tomurcukunun ve yapısının görüntüleri üç farklı filtre dedektörü kullanılarak elde edildi. 607/70 nm filtre seti kullanılarak, oranmetrik analiz için tat hücrelerinden tdTomato sinyali elde edildi (Şekil 4B). 525...

Tartışmalar

Burada açıklanan, vivo tat hücrelerinin fonksiyonel faaliyetlerinin araştırılmasına μTongue uygulamak için ayrıntılı bir protokoldür. Bu protokolde genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri kullanılarak tat hücreleri üzerinde fonksiyonel görüntüleme yapılmaktadır. Transgenik farelerin kullanımına ek olarak, kalsiyum boyalarının (veya voltaj algılama boyalarının) tat hücrelerine elektroforetik olarak yüklenmesi alternatif bir seçenek olabilir.

Bu ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
acesulfame K	Sigma Aldrich	04054-25G	Artificial saliva / tastant
calcium chloride solution	Sigma Aldrich	21115-100ML	Artificial saliva / tastant
citric acid	Sigma Aldrich	C0759-100G	Artificial saliva / tastant
cycloheximide	Sigma Aldrich	01810-5G	Artificial saliva / tastant
denatonium	Sigma Aldrich	D5765-5G	Artificial saliva / tastant
Dental glue	Denkist	P0000CJT-A2	Animal preparation
Image J	NIH	ImageJ	Data analysis
IMP	Sigma Aldrich	57510-5G	Artificial saliva / tastant
Instant adhesive	Loctite	Loctite 4161, Henkel	Animal preparation
K2HPO4	Sigma Aldrich	P3786-100G	Artificial saliva / tastant
KCl	Sigma Aldrich	P9541-500G	Artificial saliva / tastant
Ketamine	Yuhan	Ketamine 50	Animal preparation
KH2PO4	Sigma Aldrich	P0662-25G	Artificial saliva / tastant
KHCO3	Sigma Aldrich	237205-500G	Artificial saliva / tastant
MATLAB	Mathwork	MATLAB	Data analysis
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266-100G	Artificial saliva / tastant
MPG	Sigma Aldrich	49601-100G	Artificial saliva / tastant
Mutiphoton microscope	Thorlab	Bergamo II	Microscope
NaCl	Sigma Aldrich	S3014-500G	Artificial saliva / tastant
NaHCO3	Sigma Aldrich	792519-500G	Artificial saliva / tastant
Objective	Nikon	N16XLWD-PF	Microscope
Octaflow	ALA Scientific Instruments	OCTAFLOW II	Fluidic control
PC	LG	Lg15N54	Fluidic control
PH meter	Thermoscientific	ORION STAR AZ11	Artificial saliva / tastant
Phosphate-buffered saline	Sigma Aldrich	806562	Artificial saliva / tastant
quinine	Sigma Aldrich	Q1125-5G	Artificial saliva / tastant
Syringe pump	Havard Apparatus	PHD ULTRA 4400	Fluidic control
TRITC-dextran	Sigma Aldrich	52194-1G	Animal preparation
Ultrafast fiber laser	Toptica	FFultra920 01042	Microscope
Xylazine	Bayer Korea	Rompun	Animal preparation