Lipid Membran Dinamiği ve Membran-Protein Etkileşimleri için Benzersiz Bir Prob Olarak Nötron Spin Eko Spektroskopisi

Özet

Bu makalede lipid membranlarının nötron spin eko (NSE) çalışmalarında örnek hazırlama, veri azaltma ve veri analizi protokolleri açıklanmaktadır. Lipitlerin judicious döteryum etiketlemesi, üzerinde hayati biyolojik süreçlerin meydana geldiği mezoskopik uzunluk ve zaman ölçeklerinde farklı membran dinamiklerine erişim sağlar.

Özet

Lipid bilayerler hücre zarlarının ana matrisini oluşturur ve diğer hayati hücresel süreçlerin yanı sıra besin değişimi, protein-membran etkileşimleri ve viral tomurcuklanma için birincil platformdur. Verimli biyolojik aktivite için, hücre zarları hücrenin ve bölmelerinin bütünlüğünü koruyacak kadar sert, ancak proteinler ve fonksiyonel alanlar gibi membran bileşenlerinin yayılmasına ve etkileşime girmesine izin edecek kadar akışkan olmalıdır. Elastik ve akışkan membran özelliklerinin bu hassas dengesi ve biyolojik işlev üzerindeki etkileri, mezoskopik uzunluk ve zaman ölçekleri üzerinde kolektif membran dinamiklerinin daha iyi anlaşılmasıni gerektirir, örneğin, membran deformasyonları ve protein bağlama olayları. Bu dinamik aralığı etkili bir şekilde araştırabilecek teknikler arasında nötron spin ekosu (NSE) spektroskopisi vardır. Döteryum etiketleme ile birlikte NSE, bükme ve kalınlık dalgalanmalarının yanı sıra seçilen membran özelliklerinin mezoskopik dinamiklerine doğrudan erişmek için kullanılabilir. Bu makale, NSE tekniğinin kısa bir açıklamasını sağlar ve veri toplama ve azaltma talimatlarının yanı sıra örnek hazırlama ve döterasyon şemalarının ayrıntıları da dahil olmak üzere lipozomal membranlar üzerinde NSE deneyleri gerçekleştirme prosedürlerini özetlemektedir. Makale ayrıca bükme sertlik modülü, alan sıkıştırılabilirlik modülü ve düzlem içi viskozite gibi anahtar membran parametrelerini çıkarmak için kullanılan veri analizi yöntemlerini de tanıtır. NSE çalışmalarının biyolojik önemini göstermek için, NSE tarafından araştırılan membran fenomenlerinin seçilmiş örnekleri, yani katkı maddelerinin membran bükme sertliği üzerindeki etkisi, etki alanı oluşumunun membran dalgalanmaları üzerindeki etkisi ve membran-protein etkileşimlerinin dinamik imzası tartışılmaktadır.

Giriş

Hücre zarlarının ve işlevlerinin anlaşılması son birkaç on yılda önemli ölçüde gelişti. Hücre zarlarının hücre sınırlarını tanımlayan pasif lipid bilayerleri olarak eski görüşü ve membran proteinleri^1, lipid bilayerlerinin hücresel sinyalizasyon, moleküler değişim ve protein fonksiyonu da dahil olmak üzere hayati biyolojik süreçleri düzenlemede önemli bir rol oynadığı dinamik bir modele dönüştü - birkaç 2^,3,⁴,^5,6. Hücre zarlarının son derece dinamik olduğunu, sürekli yeniden....

Protokol

1. Deney için gerekli olan döterasyon şeması

1. Bükme dalgalanması ölçümleri için, D 2 O_(%99,9)veya D 2 O tamponunda (örneğin,_H2O yerine D₂O ile hazırlanmış fosfat tamponu) tamamen protiated lipozomlar yapın. _133,4mg ile tamamen protiated DMPC (C 36 H₇₂NO₈P) ve DSPC (C₄₄H₈₈NO₈P) kullanın, burada X_DMPC ve X_DSPC, DMPC ve DSPC'nin köstebek fraksiyonlarıdır, burada sırasıyla 0.7 ve 0.3 olarak ayarlanır ve Mw_D....

Sonuçlar

Bükme dalgalanmalarına erişen NSE çalışmaları genellikle ~ (0,04 - 0,2) ş^-1Q aralığı üzerinden gerçekleştirilir. Bu Q aralığı, membran kalınlığı ile bükme dinamiklerinin hakim olduğu lipozomal yarıçap arasındaki orta uzunluk ölçeklerine karşılık gelir. Genişletilmiş bir Q aralığı üzerinden ölçüm, lipozomal difüzyon ve intramembran dinamikleri de dahil olmak üzere ek dinamik modlara erişim sağlayabilir. NSE tarafından erişilen membran dinamiklerindeki çapraz geçi?.......

Tartışmalar

NSE, lipid zarlarının mezoskopik dinamiklerinin çeşitli koşullar altında ölçülmesinde güçlü ve benzersiz bir tekniktir. NSE'nin etkin kullanımı numune kalitesine, nötron kontrastı ve belirli bir örnek için araştırılabilen erişilebilir dinamiklerin aralığına bağlıdır. Bu nedenle, başarılı NSE denemeleri gerçekleştirmek ve yüksek kaliteli veri toplamak için birkaç kritik adım gereklidir. Bir NSE deneyi sırasında nötron ışın süresinin etkili kullanımını sağlamanın önemli bir.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chloroform (biotech grade)	Sigma Aldrich	496189	Biotech. grade, ≥99.8%, contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer
Circulating water bath	Julabo	SE-12	Heating Circulator with smart pump, programmable temperature settings, and external sensor connection for measurement and control
Deuterium Oxide	Cambridge Isotopes Laboratories	DLM-4	Deuterated water; Heavy water (D2O) (D, 99.9%)
Digital Semi-Microbalance	Mettler Toledo	MS105	Semi-micro balance with 120 g capacity, 0.01 mg readability, high resolution weighing cell, ergonomic doors, and pipette-check application
Ethanol (molecular biology grade)	Sigma Aldrich	E7023	200 proof ethanol for molecular biology applications
Glass Pipets	VWR	36360-536	Disposable Soda Lime glass Pasteur pipets
Glass Vials	Thermo Scientific	B7990-1	Borosilicate glass vials with PTFE/Silione septum caps
Lab grade freezer	Fisher Scientific	IU2886D	Ultra-low temprature freezer (-86 to -50 C) for long-term storage of lipids and proteins
Lipids (protaited or perdeuterated)	Avanti Polar Lipids	varies by lipid	Lipids can be purchased from Avanti in powder form or in a chloroform solution with the required amounts and deuteration schemes.
Millipore water purifier	Millipore Sigma	ZRQSVP3US	Direct-Q® 3 UV Water Purification System which deliver both pure and ultrapure water with a built-in UV lamp to reduce the levels of organics for biological  applications
Mini Extruder Set	Avanti Polar Lipids	610020	Mini-extruder set includes mini-extruder, heating block, 2 GasTight Syringes, and 2 O-rings, Polycarbonate Membranes, and Filter Supports
Quick Connect Fittings	Grainger	2YDA1 and 2YDA7	Push-button tube fittings for QuickConnect water circulation applications, e.g. high temperature vesicle extrusion
Syringe Pump	SyringePump.com	New Era-1000	Fully programmable syringe pump for infusion and withdrawal; programs up to 41 pumping phases with adjustable pumping rates, dispensed volumes, and extrusion cycles
Ultrasonic bath	Fisher Scientific	CPX2800	Temperature controlled ultra sonic bath with programmable functionality for degassing and ultrasonic applications
Vacuum Oven	Thermo Scientific	3608	0.7 cu ft vaccum oven with built-in-high-limit thermostat guards against overheating
Vortex Mixer	Fisher Scientific	02-215-414	Variable speed, analog control that allows low rpm start-up for gentle shaking or high-speed mixing for vigorous vortexing of samples